TGF-β1在煙霧暴露大鼠肺血管的表達(dá)及其與肺血管重塑的關(guān)系*

王　煥，　曾玉蘭，　彭紅星，　楊榮時

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院呼吸內(nèi)科，武漢　430077

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TGF-β1在煙霧暴露大鼠肺血管的表達(dá)及其與肺血管重塑的關(guān)系*

王煥，曾玉蘭，彭紅星△，楊榮時

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院呼吸內(nèi)科，武漢430077

摘要：目的通過制備大鼠長期吸煙模型，觀察TGF-β1在煙霧暴露大鼠肺血管中表達(dá)的變化，探討肺血管重塑形成的原因及其機(jī)制。方法將60只健康SD雄性大鼠隨機(jī)分為對照組、煙霧暴露2、4、8、12周組。通過肺組織的蘇木精-伊紅染色和α-SMA染色切片觀察肺血管重塑的程度；通過免疫組化法觀察和檢測TGF-β1蛋白在肺動脈中的相對表達(dá)。結(jié)果①各組肺血管壁厚度和血管直徑的比值(WT%)分別為(21.17±1.43)%，(31.26±1.71)%，(39.95±1.19)%，(50.54±1.49)%，(61.42±1.67)%；各組完全肌化血管比例分別是(3.33±0.15)%，(6.67±0.54)%，(17.34±1.49)%，(27.37±1.49)%，(35.45±1.83)%，煙霧暴露組WT%和完全肌化血管比例均較對照組明顯增大，且各組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。②各組TGF-β1蛋白表達(dá)結(jié)果依次為(0.041±0.012)，(0.326±0.019)，(0.343±0.012)，(0.448±0.017)，(0.480±0.015)，各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。③TGF-β1蛋白表達(dá)與WT%和完全肌化血管比例呈顯著正相關(guān)(r值分別為0.902、0.844，均P<0.01)。結(jié)論肺血管TGF-β1表達(dá)上調(diào)可能參與煙霧暴露大鼠肺血管重塑的形成過程，且與煙霧暴露時間相關(guān)。

關(guān)鍵詞：TGF-β1；吸煙；肺血管重塑；肺動脈高壓；平滑??；增殖

煙霧暴露嚴(yán)重危害人們的身體健康，慢性阻塞性肺疾病(COPD)主要與肺部對香煙煙霧等有害氣體及有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)，研究表明煙霧暴露與動脈粥樣硬化和COPD等多種疾病有密切的關(guān)系，進(jìn)而可導(dǎo)致肺動脈高壓和肺源性心臟病[1]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)具有多種生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增殖、分化、凋亡，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，促進(jìn)細(xì)胞粘附，是氣道炎癥損傷及纖維修復(fù)的重要因子；煙霧暴露可以直接作用于肺血管，導(dǎo)致肺血管重塑和肺動脈高壓，其具體分子機(jī)制是否與TGF-β1有關(guān)，目前尚不清楚。本研究通過建立大鼠長期吸煙模型，旨在觀察TGF-β1在煙霧暴露大鼠肺血管中的變化，探討其在肺血管重塑形成過程中的作用，進(jìn)一步闡明肺動脈高壓的分子生物學(xué)機(jī)制，為探尋肺動脈高壓治療新靶點(diǎn)和戒煙提供理論基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物SD品系清潔級雄性成年大鼠60只,2～3月齡，體重(180±25)g，購自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.2主要藥品和試劑武漢卷煙廠產(chǎn)紅金龍香煙，每支含尼古丁1.0 mg、焦油15 mg，煙氣中一氧化碳含量15 mg。小鼠抗α-SMA單克隆抗體、兔抗TGF-β1多克隆抗體、SABC免疫組化試劑盒均購自武漢谷歌生物工程有限公司。

1.2動物分組及煙霧暴露模型的建立

SD大鼠隨機(jī)分為5組：對照組、煙霧暴露2、4、8、12周組，每組12只。模型組SD大鼠放入60 cm×57 cm×100 cm的煙熏箱里，使模型組大鼠被動吸煙。每次點(diǎn)燃2支香煙放入，燃燒10 min，休息5 min后再放入2支香煙，上下午各吸煙20支，中間間隔時間不少于4 h，每周吸煙6 d。用CY-100B數(shù)字測氧儀監(jiān)測煙熏箱中的氧濃度，根據(jù)監(jiān)測結(jié)果開放通氣孔的數(shù)目，使煙熏箱中的氧濃度保持20%～21%。正常對照組大鼠飼養(yǎng)在無煙環(huán)境中。

到達(dá)干預(yù)時間點(diǎn)后，用10%的水合氯醛麻醉，放血處死大鼠。分離出肺臟，取左肺用4%多聚甲醛固定，二甲苯透明，行石蠟包埋，病理切片機(jī)切片，切片厚約4 μm。

1.3肺血管重塑觀察與分析

1.3.1肺組織病理學(xué)觀察和圖像分析石蠟切片常規(guī)做蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察支氣管-肺組織病理學(xué)變化，每張切片選取橫斷面較圓的直徑50～200 μm的5支血管，以圖像分析系統(tǒng)測量記錄肺血管壁厚度和血管直徑的比值(WT%)。

1.3.2α-SMA免疫組織化學(xué)染色檢測血管肌化石蠟切片脫蠟至水，微波爐修復(fù)抗原，依次滴加小鼠抗α-SMA單克隆抗體、生物素化羊抗小鼠或羊抗兔IgG、SABC試劑，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。用PBS替代一抗作為陰性對照。光學(xué)顯微鏡下觀察，陽性表達(dá)為胞質(zhì)內(nèi)有細(xì)絲狀棕黃色著色。將切片置于顯微鏡下隨機(jī)觀察30條血管，將組織切片中所有直徑100 μm以下的肺小血管分為3種類型：未肌化的血管(α-SMA染色陽性長度<25%周長)，部分肌化的血管(α-SMA染色陽性長度占25%～75%周長)，完全肌化的血管(α-SMA染色陽性長度>75%周長)。以完全肌化的血管數(shù)目占肺小血管總數(shù)的百分比來表示肺血管重塑時肌化血管的程度。

1.4免疫組織化學(xué)法檢測TGF-β1的表達(dá)

方法同上，一抗均為1∶200稀釋。顯微鏡下觀察，TGF-β1陽性表達(dá)為胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒狀著色。每張切片選取5支50～200 μm的陽性染色肺小動脈，計(jì)算TGF-β1平滑肌細(xì)胞平均吸光度(A)值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1肺組織病理形態(tài)學(xué)改變

對照組肺動脈壁菲薄，結(jié)構(gòu)正常。模型組各組隨煙霧暴露時間延長，氣道和血管周圍炎性細(xì)胞浸潤逐漸加重，肺血管壁逐漸增厚。但早期未見肺泡壁變薄、斷裂等肺氣腫征象(圖1)。煙霧暴露2、4、8和12周組WT%值較對照組顯著增加，煙霧暴露12周組肺動脈壁增厚最明顯，管腔狹窄。任兩相鄰煙霧暴露組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1　各組大鼠肺血管重塑程度的比較±s，n=12)

與對照組比較，aP<0.05；與煙霧暴露2周組比較，bP<0.05；與煙霧暴露4周組比較，cP<0.05；與煙霧暴露8周組比較，dP<0.05

2.2肺小動脈肌化結(jié)果

無肌型動脈的肌化反映了肺血管中平滑肌的增殖，也是肺血管重塑的重要表現(xiàn)之一。α-SMA免疫組化染色后經(jīng)統(tǒng)計(jì)，對照組大鼠完全肌化血管約占3%，肺小動脈以未肌化和部分肌化血管為主。與對照組相比，煙霧暴露各組大鼠肺小動脈完全肌化血管明顯增多，相應(yīng)的未肌化血管和部分肌化血管則逐漸減少(表1)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，各組之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05，表1)。

2.3免疫組化方法檢測各組大鼠TGF-β1蛋白表達(dá)

對照組肺動脈無陽性染色，煙霧暴露2周和4周組肺動脈平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)弱陽性染色，煙霧暴露8周和12周組肺動脈平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)強(qiáng)陽性染色(圖2)，免疫組化檢測TGF-β1蛋白相對表達(dá)量隨煙霧暴露時間延長逐漸升高(圖3)。

A：對照組；Β：煙霧暴露2周組；C：煙霧暴露4周組；D：煙霧暴露8周組；E：煙霧暴露12周組圖1　各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變(HE染色，×200)Fig.1 Histopathological changes of pulmonary tissues in rats in each group(HE staining，×200)

A：對照組；Β：煙霧暴露2周組；C：煙霧暴露4周組；D：煙霧暴露8周組；E：煙霧暴露12周組圖2　免疫組化檢測各組大鼠肺動脈TGF-β1的表達(dá)(DAB顯色，×200)Fig.2 Expression of TGF-β1in pulmonary arteries detected by immunohistochemistry(DAB staining，×200)

A：對照組；Β：煙霧暴露2周組；C：煙霧暴露4周組；D：煙霧暴露8周組；E：煙霧暴露12周組與對照組比較，aP<0.05；與煙霧暴露2周組比較，bP<0.05；與煙霧暴露4周組比較，cP<0.05；與煙霧暴露8周組比較，dP<0.05圖3　各組TGF-β1蛋白表達(dá)水平的比較(n=12)Fig.3 Comparison of the expression of TGF-β1protein between different groups(n=12)

2.4相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson相關(guān)分析，肺動脈TGF-β1蛋白表達(dá)量與WT%和完全肌化血管比例均呈正相關(guān)(r值分別為0.902、0.844，均P<0.01)。

3討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，香煙煙霧暴露各組的WT%和完全肌化血管比例均較對照組顯著增加。煙霧暴露2周組大鼠即較對照組增高，說明煙霧暴露大鼠早期即存在肺血管重塑，隨著煙霧暴露時間延長，煙霧暴露4周和8周組肺小血管的WT%和完全肌化血管比例越來越高，提示肺血管重塑程度與煙霧暴露時間呈正相關(guān)趨勢。Scharf等[2]研究認(rèn)為長期低氧引起肺血管收縮、肺氣腫等因素是引起肺血管重塑的主要原因，但本研究結(jié)果顯示煙霧暴露12周組HE染色結(jié)果顯示并未出現(xiàn)肺氣腫的病理表現(xiàn)，說明煙霧亦能直接作用于肺血管系統(tǒng)，誘導(dǎo)肺血管重塑及肺動脈高壓，Wright等[3]研究結(jié)果與本研究一致；其原因可能與香煙煙霧主要成分尼古丁及其代謝產(chǎn)物能刺激平滑肌細(xì)胞增殖和抑制氣道上皮細(xì)胞的黏附和遷移作用[4]有關(guān)。

TGF-β1與多種呼吸系統(tǒng)疾病密切相關(guān)[5]，目前研究多集中于TGF-β1在哮喘[6]、肺纖維化[7]、COPD氣道重塑[8]等疾病發(fā)病機(jī)制或治療效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)觀察上，而TGF-β1與COPD肺血管重塑和肺動脈高壓相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究較少。已有研究證實(shí)，低氧[9]可通過誘導(dǎo)TGF-β1產(chǎn)生而參與血管重塑，但在吸煙大鼠模型中，TGF-β1對肺血管的影響鮮有報(bào)道，這正是本研究的重點(diǎn)。

文獻(xiàn)報(bào)道[10]，在COPD患者和健康吸煙者中支氣管上皮TGF-β1蛋白和mRNA的表達(dá)量均高于非吸煙者，且其表達(dá)與上皮下巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)。本研究中，煙霧暴露2、4周組肺動脈平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)TGF-β1蛋白弱陽性染色，而對照組肺動脈TGF-β1無陽性染色，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明煙霧暴露的早期即可誘導(dǎo)肺血管TGF-β1蛋白表達(dá)，研究結(jié)果顯示煙霧暴露8、12周組肺動脈平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)強(qiáng)陽性染色，且TGF-β1蛋白相對表達(dá)量隨煙霧暴露時間延長逐漸升高，證實(shí)TGF-β1表達(dá)與煙霧暴露時間呈正相關(guān)關(guān)系。TGF-β1蛋白表達(dá)隨煙霧暴露時間延長而增加，一方面可能與煙霧直接刺激肺血管有關(guān)，前人的研究亦說明煙霧暴露可以直接作用于肺血管，導(dǎo)致肺血管重塑和肺動脈高壓[11]；另一方面也可能與煙霧暴露促進(jìn)大鼠肺動脈高壓形成有關(guān)，有研究亦證實(shí)TGF-β1在肺動脈高壓狀態(tài)下可能被激活[12]，而在肺血管表達(dá)增加。因此，在COPD早期干預(yù)TGF-β1有可能對減緩其病程進(jìn)展，防止其演變?yōu)榉卧葱孕呐K病具有一定的意義。

有研究[13]表明，TGF-β1在多種慢性呼吸道疾病中廣泛參與氣道炎癥反應(yīng)與氣道血管重塑，是COPD炎癥損傷與修復(fù)的重要因子，也參與肺纖維化[14]的形成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著大鼠煙霧暴露時間延長，逐漸出現(xiàn)肺血流動力學(xué)和肺血管重塑指標(biāo)的異常。隨著煙霧暴露時間延長，TGF-β1蛋白表達(dá)亦逐漸增強(qiáng)，且與肺小動脈重塑指標(biāo)WT%和完全肌化血管比例均呈正相關(guān)。以上結(jié)果進(jìn)一步證明肺動脈平滑肌細(xì)胞TGF-β1蛋白表達(dá)與煙霧暴露大鼠肺血管重塑密切相關(guān)，煙霧暴露可能通過上調(diào)肺血管平滑肌中TGF-β1的表達(dá)，促進(jìn)COPD肺血管重塑，進(jìn)而導(dǎo)致肺動脈高壓和肺源性心臟病。其可能的發(fā)生機(jī)制為，煙霧暴露可引起炎癥細(xì)胞在肺組織內(nèi)聚集并釋放炎癥因子基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，MMPs激活TGF-β1[15]，從而使TGF-β1表達(dá)上調(diào)。TGF-β1能夠調(diào)節(jié)肺動脈平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞周期，促進(jìn)其增殖，從而造成肺血管重塑[16-17]。

綜上所述，TGF-β1在煙霧暴露誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，煙霧暴露可能通過上調(diào)肺血管TGF-β1蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)肺血管平滑肌增殖，促進(jìn)血管重塑，最終導(dǎo)致肺動脈高壓的形成。這預(yù)示我們可以將TGF-β1作為防治肺動脈高壓的潛在治療靶點(diǎn)，通過戒煙及拮抗TGF-β1的表達(dá)來減輕肺血管重塑，減緩肺動脈高壓和肺源性心臟病的進(jìn)展。但關(guān)于TGF-β1如何促進(jìn)肺動脈高壓的具體作用機(jī)制尚未完全清楚，有待進(jìn)一步深入研究。

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(2015-07-29收稿)

TGF-β1Expression in Pulmonary Vessels of Cigarette Smoke-exposed Rats and Its Relationship with Pulmonary Vascular Remodeling

Wang Huan，Zeng Yulan，Peng Hongxing△etal

DepartmentofRespiratoryDiseases，LiyuanHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430077，China

AbstractObjectiveTo investigate the variations of TGF-β1expression in pulmonary vessels in rats exposed to cigarette smoke，and the causes and mechanisms of pulmonary vascular remodeling.MethodsSixty SD male rats were randomly divided into control group and smoke exposure groups(2-，4-，8-，12-week groups in terms of different exposure time).Pulmonary remodeling was evaluated by using HE and α-SMA staining.Immunohistochemistry was preformed to determine the expression of TGF-β1protein in the pulmonary artery.Results①The wall thickness(WT)of the pulmonary artery was(31.26±1.71)%，(39.95±1.19)%，(50.54±1.49)%，(61.42±1.67)% in 2-，4-，8-，and 12-week smoke exposure groups，respectively，significantly greater than that in control group[(21.17±1.43)%](allP<0.05).The proportion of muscularized vessels was(6.67±0.54)%，(17.34±1.49)%，(27.37±1.49)%，and(35.45±1.83)%，respectively，in the four smoke exposure groups，significantly higher than that in the control group[(3.33±0.15)%](allP<0.05).②The TGF-β1protein expression in the pulmonary artery was(0.041±0.012)，(0.326±0.019)，(0.343±0.012)，(0.448±0.017)，and(0.480±0.015)in the five groups，respectively.There was significant difference in the expression of TGF-β1protein between groups(P<0.05).③The expression of TGF-β1protein was positively correlated with the WT and proportion of muscularized vessels(r=0.902，P<0.01；r=0.844，P<0.01).ConclusionUp-regulation of TGF-β1expression in pulmonary vessels may participate in the pulmonary vascular remodeling in rats，and the expression of TGF-β1protein is positively correlated with the exposure time of cigarette smoke.

Key wordstransforming growth factor-β1；cigarette smoke；pulmonary vascular remodeling；pulmonary artery hypertension；smooth muscle；proliferation

中圖分類號：R163

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.01.003

通訊作者△，Corresponding author，E-mail：penghx2008@126.com

*湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2013CFB078)

王煥，女，1989年生，碩士研究生，E-mail：1017157390@qq.com