補(bǔ)腎健骨方對(duì)腎性骨病模型大鼠鈣磷代謝紊亂與股骨密度的影響

于思明，裴春鵬，代麗娟，郭丹丹

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎病科，哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)一科)

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·基礎(chǔ)研究·

補(bǔ)腎健骨方對(duì)腎性骨病模型大鼠鈣磷代謝紊亂與股骨密度的影響

于思明1，裴春鵬1，代麗娟1，郭丹丹2

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎病科，哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)一科)

[摘要]目的探討補(bǔ)腎健骨方對(duì)腎性骨病模型大鼠鈣磷代謝紊亂與股骨密度的影響。方法采用0.75%腺嘌呤聯(lián)合高磷飲食飼喂法建立腎性骨病大鼠模型，按體重從輕到重依次編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字表分為健康組、模型組、補(bǔ)腎健骨低劑量組、補(bǔ)腎健骨高劑量組、骨化三醇對(duì)照組，分別給予相應(yīng)藥物灌胃8周。檢測(cè)各組大鼠血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、堿性磷酸酶(ALP)、血鈣(Ca2+)、血磷(P3-)、全段甲狀旁腺激素(iPTH)水平，在骨密度儀上測(cè)定股骨整體骨密度(W-BMD)、松質(zhì)骨骨密度(T-BMD)及皮質(zhì)骨骨密度(C-BMD)，并觀察股骨組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果補(bǔ)腎低劑量、高劑量組BUN水平低于模型組(P<0.05)，且低于骨化三醇對(duì)照組(P<0.05)；補(bǔ)腎低劑量、高劑量組Scr水平低于模型組(P<0.01)，且低于骨化三醇對(duì)照組(P<0.01)；補(bǔ)腎高劑量組血清Ca2+水平高于模型組(P<0.01)，低于骨化三醇對(duì)照組(P<0.01)，補(bǔ)腎低劑量組血清Ca2+水平與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；補(bǔ)腎低劑量組、高劑量組血清P3-水平均低于模型組(P<0.01)，且低于骨化三醇對(duì)照組(P<0.01)；補(bǔ)腎低劑量組、高劑量組及骨化三醇對(duì)照組ALP水平均低于模型組(P<0.01)，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；補(bǔ)腎低劑量組、高劑量組及骨化三醇對(duì)照組iPTH水平均低于模型組(P<0.01)，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；補(bǔ)腎低劑量組、高劑量組及骨化三醇對(duì)照組大鼠W-BMD與C-BMD高于模型組(P<0.01)，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論補(bǔ)腎健骨方在保護(hù)腎性骨病模型大鼠的腎功能、降低血磷方面具有一定作用，同時(shí)有助于提高大鼠股骨整體骨密度與皮質(zhì)骨骨密度。

[關(guān)鍵詞]腎性骨營養(yǎng)障礙；磷代謝障礙；骨密度；腎病治法; 大鼠, Wistar

隨著慢性腎臟病(CKD)患者生存時(shí)間的延長，腎性骨病(ROD)逐漸成為CKD患者常見而嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，ROD常導(dǎo)致CKD患者的骨痛、骨骼畸形，直接影響CKD患者的生存質(zhì)量。腎性骨病的發(fā)生源于腎精虧虛，又與瘀血、痰濁、水濕等病理因素膠著固結(jié)，故難以祛除?；谀I性骨病的發(fā)病機(jī)制，我們以補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、化瘀泄?jié)釣橹蝿t，組成補(bǔ)腎健骨方，對(duì)其干預(yù)腎性骨病的作用進(jìn)行了初步研究。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK-(吉)2013-0001。

1.2藥品與試劑補(bǔ)腎健骨方由鹽杜仲，酒大黃，煅牡蠣，土鱉蟲組成，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室煎煮、濃縮制得。骨化三醇由上海羅氏制藥有限公司生產(chǎn)，腺嘌呤購自上海源聚生物科技有限公司。

1.3主要儀器Hologic Discovery骨密度儀由美國Hologic公司生產(chǎn)，超低溫冰箱由中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

1.4造模與分組給藥方法參考相關(guān)文獻(xiàn)方法[1-2]，采用0.75% 腺嘌呤聯(lián)合高磷飲食飼喂法(腺嘌呤含量0.75%，磷含量1.03%)建立腎性骨病大鼠模型，持續(xù)腺嘌呤及高磷飲食4 周，繼續(xù)以不含腺嘌呤的高磷飲食飼喂4 周。將大鼠按體重從輕到重依次編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字表分為健康組、模型組、補(bǔ)腎健骨低劑量組、補(bǔ)腎健骨高劑量組、骨化三醇對(duì)照組，每組10只。補(bǔ)腎健骨低劑量組、補(bǔ)腎健骨高劑量組分別給予補(bǔ)腎健骨方(生藥)1.2 g/kg、2.4 g/kg灌胃，骨化三醇對(duì)照組給予骨化三醇0.009 μg/200 g濃度灌胃，灌胃容量均為1 mL/100 g，健康組、模型組給予等量0.9%氯化鈉注射溶液灌胃，1次/d，持續(xù)8 周。

1.5血清學(xué)指標(biāo)測(cè)定連續(xù)給藥8周后予水合氯醛腹腔注射麻醉，心臟采血處死大鼠，收集血液，離心后保存在-80 ℃低溫冰箱待檢。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、堿性磷酸酶(ALP)、血鈣(Ca2+)、血磷(P3-)，以免疫化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)全段甲狀旁腺激素(iPTH)。

1.6股骨密度及股骨病理檢測(cè)從大鼠腹股溝處切開、分離雙側(cè)股骨，剔除肌肉組織及肌腱，兩端離斷，完整取出股骨，以0.9%氯化鈉注射溶液浸濕紗布包裹，置于-80 ℃低溫冰箱待檢。參考文獻(xiàn)方法[3]，檢測(cè)時(shí)選取左側(cè)股骨遠(yuǎn)端1/4作為松質(zhì)骨，中段1/2作為皮質(zhì)骨，將股骨置于Hologic Discovery骨密度儀上分別測(cè)定整體骨密度(W-BMD)、松質(zhì)骨骨密度(T-BMD)及皮質(zhì)骨骨密度(C-BMD)。取右側(cè)股骨，離斷遠(yuǎn)端股骨頭部，置入EDTANa2脫鈣液中浸泡3周，包埋，制成石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，HE染色，在光鏡下觀察股骨組形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組大鼠存活情況及Scr、BUN、ALP檢測(cè)結(jié)果 第8周末健康組、模型組、補(bǔ)腎低劑量組、補(bǔ)腎高劑量組、骨化三醇對(duì)照組分別存活10、7、9、8、7只。檢測(cè)結(jié)果見表1。

組別鼠數(shù)(只)BUN(mmol/L)Scr(μmol/L)ALP(U/L)健康組105.31±1.5428.14±5.20121.50±14.94模型組718.77±4.42183.55±17.33192.35±17.82補(bǔ)腎低劑量組912.49±3.76ab104.30±11.29cd152.33±13.70a補(bǔ)腎高劑量組812.18±3.35ab107.01±12.84cd154.66±15.80a骨化三醇對(duì)照組718.05±4.63178.62±16.71147.44±16.69a

注： 與模型組比較,aP<0.05，cP<0.01；與骨化三醇對(duì)照組比較，bP<0.05，dP<0.01

2.2各組大鼠血清Ca2+、P3-、iPTH的比較補(bǔ)腎高劑量組及骨化三醇對(duì)照組血清Ca2+水平高于模型組(P<0.01)，骨化三醇對(duì)照組高于補(bǔ)腎高劑量組(P>0.05)；補(bǔ)腎低劑量組、高劑量組血清P3-水平低于模型組(P<0.01)，且低于骨化三醇對(duì)照組(P<0.01)；補(bǔ)腎低劑量組、高劑量組及骨化三醇對(duì)照組iPTH水平低于模型組(P<0.01)，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

組別鼠數(shù)(只)Ca2+(mmol/L)P3-(mmol/L)iPTH(pg/ml)健康組102.86±0.132.17±0.227.74±2.50模型組71.63±0.253.90±0.4918.25±3.92補(bǔ)腎低劑量組91.70±0.332.56±0.34ac11.73±1.55a補(bǔ)腎高劑量組82.28±0.26ab2.68±0.51ac10.86±1.33a骨化三醇對(duì)照組72.62±0.30a3.24±0.36a10.67±1.01a

注： 與模型組比較,aP<0.01；與骨化三醇對(duì)照組比較，bP<0.05，cP<0.01

2.3各組大鼠股骨密度檢測(cè)結(jié)果比較補(bǔ)腎低劑量組、高劑量組及骨化三醇對(duì)照組W-BMD、C-BMD水平高于模型組(P<0.01)，補(bǔ)腎高劑量組、骨化三醇對(duì)照組T-BMD水平低于模型組(P<0.01)，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表3。

2.4各組大鼠股骨組織形態(tài)變化健康組骨皮質(zhì)及骨髓腔無明顯變化，骨細(xì)胞分布均勻。模型組大鼠股骨皮質(zhì)厚度變薄，骨髓腔變大，骨陷窩增大，骨小梁數(shù)增多，脂肪空泡數(shù)減少，骨細(xì)胞數(shù)量增多，呈條束狀堆積分布。骨化三醇對(duì)照組骨皮質(zhì)可見纖維細(xì)胞增生，骨陷窩較大，骨小梁數(shù)增多。補(bǔ)腎低劑量組、高劑量組骨細(xì)胞數(shù)量、排列接近正常，骨陷窩較小，骨小梁數(shù)增多。

組別鼠數(shù)(只)W-BMDC-BMDT-BMD健康組100.1627±0.00290.1610±0.00320.1404±0.0031模型組70.1349±0.00150.1308±0.00440.1585±0.0029補(bǔ)腎低劑量組90.1563±0.0020a0.1477±0.0024a0.1573±0.0045ab補(bǔ)腎高劑量組80.1578±0.0026a0.1483±0.0031a0.1502±0.0032ab骨化三醇對(duì)照組70.1552±0.0022a0.1464±0.0036a0.1496±0.0025

注： 與模型組比較,aP<0.01；與骨化三醇對(duì)照組比較，bP<0.01

3討論

CKD已成為威脅全球人類健康的一類重大疾病。在CKD這一患者群體中，礦物質(zhì)和骨代謝紊亂十分常見，隨著腎功能的不斷減退，該紊亂逐漸加重最終導(dǎo)致嚴(yán)重的后果[4-5]。隨著腎臟替代治療技術(shù)的發(fā)展，CKD甚至終末期腎病患者的生存時(shí)間顯著延長，腎性骨病的發(fā)病率也隨之上升[6-7]。近年研究發(fā)現(xiàn)，腎性骨病不但會(huì)導(dǎo)致骨鈣減少、骨質(zhì)疏松，還與CKD患者的心血管鈣化和透析患者死亡率密切相關(guān)[8]。因此，加強(qiáng)對(duì)CKD患者鈣磷代謝紊亂的防控，積極治療腎性骨病具有比較重要的現(xiàn)實(shí)意義。

腎性骨病是由臟腑內(nèi)傷導(dǎo)致的骨病，故在病因病機(jī)上與一般骨病有所不同。根據(jù)中醫(yī)學(xué)臟腑相關(guān)理論，“肝腎同源”，肝藏血，主筋，腎藏精，主骨，精血互生，筋骨相連，密不可分。又如《素問·五臟生成篇》言：“腎之合骨也，其榮發(fā)也，其主脾也”。故腎性骨病雖病位在骨，但其本在腎，又與肝脾相關(guān)，因此在治療上不應(yīng)局限于補(bǔ)腎填精，還應(yīng)注意調(diào)補(bǔ)肝腎以強(qiáng)筋骨，同時(shí)助脾氣運(yùn)化，以氣血充養(yǎng)腎精。此外，慢性腎臟病患者多兼有濕濁、瘀血、痰飲等，還需針對(duì)上述病理因素輔以通腑泄?jié)?、清利濕熱、活血化瘀等治療方法、才能取得較好的治療效果。補(bǔ)腎健骨方中鹽杜仲補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨，是治療骨質(zhì)疏松的常用藥物。有研究顯示，單味杜仲可抑制骨吸收，提高骨的強(qiáng)度，對(duì)去勢(shì)大鼠的骨質(zhì)疏松具有一定的防治作用[9]。酒大黃活血化瘀，排毒泄?jié)幔混涯迪犥泩?jiān)散結(jié)，澀腸收斂，與酒大黃同用有利于磷及尿毒癥毒素的排出。現(xiàn)有的研究表明，高磷血癥不但與腎性骨病密切相關(guān)，而且CKD患者的血磷水平與冠狀動(dòng)脈鈣化程度呈正相關(guān)，是心血管事件與死亡的獨(dú)立影響因素[10]。土鱉蟲破血逐瘀、續(xù)筋接骨，合大黃取大黃蟅蟲丸祛瘀生新之意。該方經(jīng)長期臨床使用，具有比較滿意的療效。

本研究采用腺嘌呤聯(lián)合高磷飲食成功建立腎性骨病大鼠模型，其造模方法較5/6腎切除法鈣磷代謝紊亂更為突出，因高磷飲食可以對(duì)骨代謝產(chǎn)生直接影響，與人類腎性骨病特點(diǎn)比較接近。有研究表明，腺嘌呤能較快地制造大鼠腎性骨病模型，對(duì)骨組織沒有直接影響[1]。其腎臟損傷與大量腺嘌呤形成的-2，8-二羥腺嘌呤有關(guān)，后者系一難溶晶體，沉積于腎小管可造成小管損傷[11]。本研究觀察到，成模后，各組大鼠Scr、BUN上升，補(bǔ)腎健骨方2個(gè)劑量組均能降低大鼠血清Scr、BUN水平，骨化三醇對(duì)照組對(duì)大鼠血清Scr、BUN沒有明顯作用，提示骨化三醇不能抑制腺嘌呤對(duì)腎小管的損傷，而補(bǔ)腎健骨方具有腎小管保護(hù)作用。ALP為骨代謝產(chǎn)物，對(duì)腎性骨病的診斷有一定參考價(jià)值。本研究中，造模大鼠ALP水平上升，補(bǔ)腎健骨方與骨化三醇均能降低ALP水平，提示兩者均可對(duì)腎性骨病的骨代謝異常產(chǎn)生影響。高磷血癥是血管鈣化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與CKD患者的病死率呈正相關(guān)，以往多采用含鈣的磷結(jié)合劑治療，但與不含鈣的磷結(jié)合劑相比，其引起血管鈣化的危險(xiǎn)性更高[12]。在糾正鈣磷代謝紊亂方面，補(bǔ)腎2個(gè)劑量組均展現(xiàn)了較好的降低血磷的作用，且優(yōu)于骨化三醇，可能與大黃、牡蠣直接從腸道排除血磷的作用有關(guān)，杜仲、土鱉蟲是否也通過其他機(jī)制降低了血磷水平，有待于在后續(xù)研究中探討。補(bǔ)腎低劑量組對(duì)血鈣水平無明顯影響，高劑量組具有升高血鈣的作用，但不及骨化三醇組。分析方中含鈣藥物為牡蠣，但在煎煮后其吸鈣收能力有限，故在升高血鈣方面與骨化三醇比較不具有優(yōu)勢(shì)，同時(shí)表明補(bǔ)腎健骨方降低血磷的作用并非依賴于補(bǔ)充鈣質(zhì)，值得進(jìn)一步探究。在降低iPTH水平方面，補(bǔ)腎組與骨化三醇的作用相當(dāng)。對(duì)骨組織形態(tài)學(xué)的觀察結(jié)果顯示，腺嘌呤聯(lián)合高磷飲食可導(dǎo)致大鼠皮質(zhì)骨BMD下降，厚度變薄，松質(zhì)骨BMD上升，因該方法導(dǎo)致的骨病為骨高轉(zhuǎn)換模型[2]，松質(zhì)骨與皮質(zhì)骨的骨形成、吸收速率不同。補(bǔ)腎健骨方可以改善骨組織形態(tài)學(xué)變化，其作用機(jī)制可能與改善腎功、降低血磷及iPTH有關(guān)。

本研究對(duì)補(bǔ)腎健骨方干預(yù)腎性骨病的作用進(jìn)行了初步研究，該方在保護(hù)腎功、降低血磷方面具有一定作用，同時(shí)有助于提高皮質(zhì)骨骨密度，其作用機(jī)制有待于后續(xù)研究。

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Effects of Bushen Jiangu Decoction on calcium and phosphorus metabolism and femoral density of renal osteodystrophy ratsYuSiming*,PeiChunpeng,DaiLijuan,GuoDandan(*DepartmentofNephrologytheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangCollegeofTraditionChineseMedicine,Harbin150040,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of Bushen Jiangu Decoction on calcium and phosphorus metabolism and femoral density of renal osteodystrophy rats. MethodsTo establish the rat model of renal osteodystrophy by 0.75% adenine combined with high phosphorus diet feeding method.Rats were numbered according to the weight from light to heavy. All rats randomly divided into normal control group, model group, low dose group, high dose group,and calcitriol group in accordance with the random number table, the corresponding medicine were gavaged for 8 weeks. The levels of iPTH, BUN, P3-, ALP, Ca2+and Scr of rats were detected; and bone mineral density, cancellous bone mineral density and cortical bone mineral density were measured. ResultsThe serum BUN and Scr level of low dose and high dose group were lower than those in model group and calcitriol control group (P<0.05). The serum Ca2 +level of high dose group was higher than model group (P<0.01), and lower than calcitriol group (P<0.01).There was no statistically significant difference between low dose group and model group (P>0.05). The serum level of P3 of low dose group and high dose group were less than that of model group and calcitriol group (P<0.01). The ALP and iPTH levels of low dose group, high dose group and calcitriol group were lower than those of model group (P<0.01), but the differences among three groups had no statistical significance (P>0.05). ConclusionBushen Jiangu Decoction can protect renal function and reduce blood phosphorus for renal osteodystrophy rats, while can help to improve the rat femur overall bone density and cortical bone mineral density.

[Key words]Renal osteodystrophy；Phosphorus metabolism disorders；Bone density；Kidney disease therapeutic methods; Rats, wistar

(收稿日期：2015-10-10)

Corresponding author:Guo Dandan,Email:guodan9634@sohu.com

中圖分類號(hào):R681.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2016.01.025

作者簡介：于思明，博士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，Email:simingyu1978@sina.com通信作者：郭丹丹，副主任醫(yī)師，Email:guodan9634@sohu.com

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12541771)