癌超甲基化基因1與卵巢癌基因1在卵巢癌組織中的表達及意義

王偉源，程文德，李彥華

（廣東省深圳市龍華新區(qū)中心醫(yī)院 病理科，廣東 深圳 518110）

卵巢癌為婦科常見惡性腫瘤之一，多見于中老年婦女[1]。通常卵巢癌發(fā)病較為隱匿，且尚無早期診斷的有效方法，病死率較高，對患者生命安全存在嚴(yán)重威脅，因此研究卵巢癌發(fā)病機制勢在必行[2]。當(dāng)今分子生物學(xué)不斷發(fā)展，發(fā)現(xiàn)候選抑癌基因的生物學(xué)特征及功能在卵巢癌發(fā)病機制中起到一定作用。本組研究旨在探究癌超甲基化基因1（hypermethylated in cancer 1, HIC1）及卵巢癌基因1（ovarian cancer gene 1, OVCA1）蛋白在卵巢癌組織中的表達及意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年-2015年于本院治療的35例卵巢癌患者，年齡31～68歲，平均（46.5±4.8）歲，病理類型：20例漿液性囊腺癌，8例黏液性囊腺癌，7例子宮內(nèi)膜樣癌；分級：6例高分化，15例中分化，14例低分化；分期：23例臨床I、II期，12例III、IV期。且選擇同期20例交界性卵巢腫瘤患者，年齡28～66歲，平均（46.4±4.6）歲；20例良性卵巢腫瘤，年齡30～65歲，平均（45.9±4.6）歲；20例卵巢組織正常者，年齡31～62歲，平均（46.0±4.4）歲。4組年齡資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.098，P=0.961），具有可比性。

1.2 檢測方法

1.2.1 組織處理 ①采用2.0～2.5 cm2×0.2 cm卵巢石蠟組織，均由病理醫(yī)生行病理鑒定并圈出腫瘤區(qū)域；②采用一次性解剖刀于組織片中刮取石蠟組織至離心管內(nèi)，離心參數(shù)：10 000 r/min，持續(xù)5 min，在4℃下進行；③經(jīng)吐溫20釋放使DNA從細(xì)胞核內(nèi)釋放，蛋白酶K消化組蛋白，消化裂解過夜，至少重復(fù)加入2次4 μl 10 mg/ml蛋白酶K，每次間隔超過1 h；④離心后將吸取石蠟層下溶液；⑤采用QIAgen吸附柱收集；⑥冷卻后保存。

1.2.2 凝膠配制與電泳 ①將8%分離膠灌入安裝好的玻璃膠膜內(nèi)，采用去離子水封閉后使其自然凝固；②待分離膠凝固好且去離子水倒掉后，將8%濃縮膠灌入，插入樣梳；③將膠膜放進電泳槽內(nèi)加電極緩沖液，取出樣梳，加marker與樣品，50 μg上樣量；④保持電泳儀300 mA、65 V，25 min預(yù)電泳；樣品進入分離膠后保持電壓120 V，電泳60 min。

1.2.3 轉(zhuǎn)膜 ①電泳后轉(zhuǎn)移凝膠上蛋白至硝酸纖維膜中；②以5%胎牛血清封閉硝酸纖維素膜（nitrocellulose filter membrane，簡稱NC膜），1 h后棄封閉液并加入一抗；③1∶200鼠抗人OVCA1多克隆抗體及1∶100鼠抗人HIC1多克隆抗體于4℃過夜；④含吐溫20的三烴甲基氨基甲烷鹽緩沖液（Tris-Buffered Saline+ Tween 20, TBST）洗膜2、3次，分別加入二抗，即1∶2 000羊抗鼠，室溫下?lián)u晃1 h采用TBST洗膜2、3次；⑤將NC膜放置于配制好的二氨基聯(lián)苯胺顯色液內(nèi)，當(dāng)條帶完成顯色后，水終止顯色。

1.3 結(jié)果判斷方法

①經(jīng)Western檢測HIC1與OVCA1分別以76KD與50KD呈單一顯色條帶為陽性。經(jīng)Bandscan軟件進行顯像條帶灰度分析，參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）觀察OVCA1、HIC1表達程度；②臨床病理分期：僅卵巢中存在腫瘤為I期；腫瘤蔓延到盆腔為II期；腫瘤侵犯腹腔臟器為III期；腫瘤超過腹腔為IV期；③參照WHO2003分類標(biāo)準(zhǔn)，進行組織學(xué)分型與病理分級。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

選用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；兩組間比較用t檢驗；兩兩均數(shù)比較用q檢驗；多組均數(shù)間比較采用方差分析（F檢驗），P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同卵巢組織中HIC1蛋白表達量比較

在HIC1蛋白表達量方面，組間比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），見表1。

表1 不同卵巢組織中HIC1蛋白表達量比較

2.2 不同卵巢組織中OVCA1蛋白表達量比較

在OVCA1蛋白表達量方面，組間比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），見表2。

表2 不同卵巢組織中OVCA1蛋白表達量比較

2.3 不同臨床病理特征卵巢癌HIC1表達比較

HIC1蛋白表達量在不同卵巢癌病理類型、病理分級、病理分期中表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表 3。

表3 不同臨床病理特征卵巢癌HIC1表達比較

2.4 不同臨床病理特征卵巢癌OVCA1表達比較

在OVCA1蛋白表達量方面，Ⅲ、Ⅳ期顯著低于Ι、Ⅱ期（P＜0.05）；不同卵巢癌病理分級和病理類型OVCA1蛋白表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表 4。

表4 不同臨床病理特征卵巢癌OVCA1表達比較

3 討論

大量研究證明約占8%卵巢癌具有家族性[3]，其可能與BRCA1或BRCA2基因突變有關(guān)。但現(xiàn)在尚未確定散發(fā)性卵巢癌發(fā)病的分子機制[4]。當(dāng)今臨床將17號染色體短臂突變作為研究重點，發(fā)現(xiàn)17號染色體短臂出現(xiàn)雜合型丟失為卵巢癌患者常見病理改變，而發(fā)生雜合性丟失次數(shù)最高的區(qū)域被指處于17p13.3-p13.2，而對此區(qū)域抑癌基因的分析對反映卵巢癌的發(fā)病及病理進展具有重要意義，本研究中探討的OVCA1、HIC1基因均位于17號染色體上[5-6]。HIC1蛋白為轉(zhuǎn)錄抑制物，其同應(yīng)急控制蛋白經(jīng)轉(zhuǎn)錄形成抑制復(fù)合體。這種復(fù)合物可對應(yīng)急控制蛋白啟動子進行調(diào)控，進而控制轉(zhuǎn)錄[7]。OVCA1為核內(nèi)蛋白，可能在細(xì)胞分化、增殖、胚胎發(fā)育及腫瘤發(fā)展中存在一定作用[8-9]。研究顯示，卵巢腫瘤時細(xì)胞系內(nèi)OVCA1蛋白表達水平降低甚至缺損，表明卵巢腫瘤形成過程可能與OVCA1功能缺失緊密相關(guān)[10]。

本研究通過分析OVCA1、HIC1基因在不同卵巢組織及不同臨床病理特征卵巢癌組織上的表達發(fā)現(xiàn)，在HIC1蛋白表達量方面，組間比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；在OVCA1蛋白表達量方面，組間比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。表明卵巢癌發(fā)生與這兩種基因表達水平下調(diào)有關(guān)。在OVCA1蛋白表達量方面，Ⅲ、Ⅳ期顯著低于Ι、Ⅱ期，表明卵巢癌發(fā)展，OVCA1基因丟失顯著增加。HIC1蛋白表達量在不同卵巢癌病理類型、病理分級、病理分期的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，推測HIC1基因缺失參與了各種病理類型卵巢癌發(fā)生，而卵巢癌的發(fā)生和變化機制并不相同，HIC1蛋白失活僅是參與卵巢癌發(fā)生的因素之一。

綜上所述，HIC1與OVCA1的基因缺失參與了卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展過程，OVCA1、HIC1可作為卵巢癌發(fā)病及病理進展的一種預(yù)測因子。

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