慢性腦缺血大鼠空間學習記憶能力與前額葉皮質突觸相關蛋白-25表達的相關研究

林春雨

（廣東省湛江市第一中醫(yī)院 兒科，廣東 湛江 524000）

慢性腦缺血是指由多種因素綜合作用導致的機體長期腦血流灌注不足，為老年性癡呆、動靜脈畸形及血管性癡呆等疾病發(fā)生的主要危險因素之一[1]。相關醫(yī)學數據調查結果顯示，近年來我國慢性腦缺血患者的發(fā)病率不斷升高，嚴重影響患者生活質量，威脅患者生命健康[2-3]。現階段，國內外越來越多的研究學者開始對慢性腦缺血的各種病理損傷機制進行研究，并取得了良好的研究進展，但尚無慢性腦缺血狀態(tài)下認知功能與突觸相關蛋白-25（synaptosomal-associated protein 25, SNAP- 25）表 達的研究報道[4]。基于上述研究現狀，本次研究對慢性腦缺血大鼠空間學習記憶能力與前額葉皮質SNAP-25蛋白表達之間的相關性進行了探討，旨在進一步明確慢性腦缺血引起認知功能損害的作用機制，為慢性腦缺血性疾病的防治提供理論依據和新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究選用我省醫(yī)學動物實驗中心提供的SPF級40只SD大鼠作為研究樣本，40只大鼠均在標準試驗條件下喂養(yǎng)，生長環(huán)境自然采光，進食、飲水自由，體重為250～300 g，平均體重為（273.5±8.6）g。隨機抽取20只健康大鼠建立慢性腦缺血大鼠實驗模型，并將該組大鼠設為試驗組，將另外20只健康大鼠設為對照組，兩組大鼠日齡、體重比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 建立腦缺血大鼠試驗模型 建立模型前禁食12 h，禁水4 h，給予大鼠腹腔注射5%水合氯醛進行麻醉，用藥劑量為0.35 ml/100 g。麻醉成功后，將實驗大鼠固定為仰臥位，逐層分離頸前部皮膚、肌肉，暴露并分離大鼠雙側頸動脈及迷走神經，完成后使用4號絲線常規(guī)縫合，肛溫維持在36～37℃，繼續(xù)進行常規(guī)飼養(yǎng)，術后2個月進行行為評價和免疫組化測定。

1.2.2 空間學習記憶能力評估方法 采用Morris水迷宮試驗評估兩組大鼠的空間學習記憶能力，本次研究使用的水迷宮由一個圓形水池和一個隱藏在水面下2 cm的平臺組成。圓形水池的直徑為1.5 m，高度為0.5 m，將水溫設置為24℃。水面下平臺的直徑為0.1 m，高度為0.27 m。另配備攝像機和計算機。進行Morris水迷宮試驗期間，保持水迷宮內外的參照物位置不變，兩組大鼠均訓練5 d，每天分上、下午兩段訓練，每段訓練4次，間隔1 h訓練一次。采用定位航行試驗評估大鼠的學習能力，訓練時，將大鼠面向圓形水池池壁緩慢放入術中，準確記錄大鼠四肢登上水下平臺的時間，設定大鼠的游泳時間為2 min，在水下平臺停留的時間為5 s，若大鼠在下水后2 min內仍未登上水下平臺，則記錄逃避潛伏期為2 min。采用空間探索試驗評估大鼠的記憶能力，在兩組大鼠學會尋找水下平臺后，將水下平臺撤出，然后再將大鼠放入水中，記錄大鼠2 min內穿越目標區(qū)域的次數。

1.2.3 前額葉皮質SNAP-25檢測方法 兩組大鼠空間學習記憶能力評估結束后，將大鼠斷頭處死，冰上迅速分離前額葉腦組織，置于4%的多聚甲醛溶液中固定，固定時間為48 h，進行脫水、透明、石蠟包埋，冠狀切片5 μm，使用35℃水漂展開后，貼在干預處理的載玻片上，石蠟片在60℃的烤箱中烘烤20 min后進行脫蠟染色，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）為陰性對照，在4℃的環(huán)境中孵育過夜，在室溫暗環(huán)境下顯色，使用顯微鏡觀察染色情況。使用生物圖像分析系統(tǒng)分析前額葉皮質SNAP-25免疫反應產物的光密度 值。

1.3 統(tǒng)計學方法

本院本次研究得到的呈正態(tài)分布的研究數據均采用統(tǒng)計學軟件SPSS 13.0處理，量性觀察指標采用均數±標準差（±s）表示，以t檢驗進行獨立樣本檢驗，計數資料采用χ2檢驗，慢性腦缺血大鼠空間學習記憶能力與前額葉皮質SNAP-25蛋白表達的相關性進行Logistic回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠Morris水迷宮試驗結果比較

經數據統(tǒng)計發(fā)現，試驗組大鼠的逃逸潛伏期明顯長于對照組大鼠（P＜0.05），撤出水下平臺后穿越目標區(qū)域的次數明顯少于對照組大鼠，組間比較存在的差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），具體研究數據見表1所示。

表1 兩組大鼠Morris水迷宮試驗結果比較 （±s）

表1 兩組大鼠Morris水迷宮試驗結果比較 （±s）

組別 例數 逃逸潛伏期/秒 穿越目標區(qū)域次數/次試驗組 20 45.9±8.3 2.8±0.5對照組 20 26.5±6.4 3.2±0.6 t值 8.278 2.290 P值 0.000 0.028

2.2 前額葉皮質SNAP-25蛋白表達水平比較

經檢測發(fā)現試驗組大鼠的前額葉皮質SNAP-25蛋白表達水平明顯高于對照組大鼠（P＜0.05），詳見表2所示。

表2 兩組大鼠的前額葉皮質SNAP-25蛋白表達水平比較（±s）

表2 兩組大鼠的前額葉皮質SNAP-25蛋白表達水平比較（±s）

組別 例數 SNAP-25蛋白表達水平試驗組 20 1 345.69±39.81對照組 20 963.36±21.95 t值 37.612 P值 0.000

2.3 慢性腦缺血大鼠認知功能損害程度與前額葉皮質SNAP-25蛋白表達水平的相關性

觀察發(fā)現大鼠認知功能損害程度越高，前額葉皮質SNAP-25蛋白表達水平越高，Logistic回歸分析結果顯示大鼠認知功能損害程度與前額葉皮質SNAP-25蛋白表達水平呈正相關性，具體研究數據見表3。

表3 慢性腦缺血大鼠認知功能損害程度與前額葉皮質SNAP-25蛋白表達水平的相關性分析

3 討論

臨床觀察發(fā)現慢性腦缺血患者起病具有隱匿性，病情發(fā)展較為緩慢，發(fā)病早期病理改變以認知功能輕度損害為主，隨著病情的不斷發(fā)展，可發(fā)生能量代謝障礙、蛋白質合成異常及神經元缺失等病理改變，最終導致認知功能發(fā)生嚴重損害[5-6]。前額葉皮質是機體學習記憶的關鍵腦區(qū)，研究發(fā)現機體發(fā)生慢性腦缺血后，突觸的可塑性會受到影響，導致神經遞質釋放所必需的突觸前血漿膜蛋白SNAP-25在前額葉皮質中的表達水平升高，并直接參與神經遞質釋放和神經元細胞可塑性的調節(jié)[7-8]。因此本院推測慢性腦缺血患者機體空間學習記憶能力與前額葉皮質SNAP-25的蛋白表達存在一定程度的相關性。

為驗證上述推測結果的客觀性和準確性，本院建立實驗動物模型，開展了實踐研究。Morris水迷宮定位航行試驗結果顯示試驗組大鼠的逃逸潛伏期明顯長于對照組健康大鼠，空間探索試驗結果顯示試驗組大鼠的目標區(qū)域穿越次數明顯少于對照組大鼠，免疫組織化學染色結果顯示試驗組大鼠的前額葉皮質SNAP-25的蛋白水平明顯高于對照組大鼠。采用Logistic回歸分析對慢性腦缺血大鼠認知功能損害程度與前額葉皮質SNAP-25蛋白表達水平的相關性進行分析發(fā)現，兩者呈正相關性，即大鼠認知功能損害越嚴重，前額葉皮質SNAP-25的蛋白表達水平越高。

綜上所述，雖然本研究結果證實了本院上述推測的客觀性，但由于現階段我國醫(yī)療領域關于該課題的臨床研究較少，本次研究所得結果的指導意義仍需臨床通過大量實踐研究進行證明。

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