4種立克次體病的疫苗研究進(jìn)展*

于永慧，王 濤 綜述，宋立華 審校

(病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，北京 100071)

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·綜 述·

4種立克次體病的疫苗研究進(jìn)展*

于永慧，王 濤 綜述，宋立華△審校

(病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，北京 100071)

立克次體； 流行性斑疹傷寒； 落基山斑點(diǎn)熱； 恙蟲(chóng)??； Q熱； 疫苗

立克次體是一大類專性真核細(xì)胞內(nèi)寄生的原核微生物，常呈多形性，革蘭陰性。根據(jù)第2版《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》，立克次體目分為3個(gè)科，共16個(gè)屬。多種立克次體是重要的人獸共患病原體，廣泛分布于世界各地。立克次體可通過(guò)媒介昆蟲(chóng)的叮咬、排泄物、氣溶膠進(jìn)行傳播。由于與媒介生物聯(lián)系密切，此類傳染病通常與戰(zhàn)爭(zhēng)、貧窮和落后衛(wèi)生條件相關(guān)。隨著經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，立克次體病在我國(guó)已大幅降低?，F(xiàn)在，立克次體病是一類新發(fā)突發(fā)傳染病，多種立克次體病如Q熱、恙蟲(chóng)病等在多個(gè)地區(qū)仍是臨床常見(jiàn)病，有待引起更多重視。

立克次體病的防治除藥物治療、消除傳染源和消滅傳染媒介等措施外，疫苗接種(特別是針對(duì)高危人群的免疫接種)也是重要手段。本文簡(jiǎn)要綜述4種立克次體病(流行性斑疹傷寒、落基山斑點(diǎn)熱、恙蟲(chóng)病和Q熱)的疫苗研究現(xiàn)狀。其中，流行性斑疹傷寒在我國(guó)已基本滅絕，落基山斑點(diǎn)熱僅限于美洲地區(qū)，這2種疾病與戰(zhàn)爭(zhēng)和生物恐怖關(guān)系密切，在我國(guó)有新發(fā)或重新流行的可能。恙蟲(chóng)病和Q熱是我國(guó)常見(jiàn)病。Q熱的病原體(貝氏柯克斯體)現(xiàn)已歸類到軍團(tuán)菌目柯克斯體屬，但在我國(guó)傳統(tǒng)上仍被稱為Q熱立克次體，Q熱仍然歸類到立克次體病范疇。

1 流行性斑疹傷寒疫苗

流行性斑疹傷寒的病原體為普氏立克次體(Rp)，以人的體虱為病媒，在人與人之間進(jìn)行傳播，往往引起大流行。Rp致病性強(qiáng)，常與戰(zhàn)爭(zhēng)、貧窮、落后衛(wèi)生條件相關(guān)，是經(jīng)典的生物戰(zhàn)劑。該病主要癥狀和體征是發(fā)熱、劇烈頭痛和皮疹，常見(jiàn)中耳炎、腮腺炎及細(xì)菌性肺炎等并發(fā)癥[1]。隨著殺蟲(chóng)劑的普及和衛(wèi)生條件的提高，該病在我國(guó)已基本滅絕，但在世界貧窮落后地區(qū)仍然流行。

1.1 滅活疫苗 1930年有學(xué)者研制流行性斑疹傷寒虱腸疫苗，曾在第二次世界大戰(zhàn)期間廣泛應(yīng)用，能減輕癥狀、降低發(fā)病率，但疫苗生產(chǎn)需要大量培養(yǎng)人虱，具有一定危險(xiǎn)性。1941年改良了用小鼠肺制備傷寒疫苗的技術(shù)，感染Rp的小鼠肺組織經(jīng)過(guò)甲醛滅活、密度梯度離心分離得到疫苗。前蘇聯(lián)科學(xué)家應(yīng)用此法生產(chǎn)疫苗，但效果不理想，疫苗尚不足以保護(hù)工作人員免于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的接觸感染。同期，采用雞胚卵黃囊培養(yǎng)Rp制成雞胚疫苗的方法被眾多國(guó)家采納，例如美國(guó)曾在第二次世界大戰(zhàn)時(shí)期大量生產(chǎn)雞胚疫苗。此種疫苗不能使人免于感染，但能減輕癥狀、縮短病程、避免因病死亡[2]，其在制備方法、立克次體含量和效力測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)、抗原成分等方面存在諸多問(wèn)題，之后被其他類型疫苗取代。

1.2 減毒活疫苗 研究者曾用牛膽汁制備莫氏立克次體(Rt)減毒苗，Rt與Rp有相似性，Rt免疫人群后能夠激發(fā)廣泛的免疫反應(yīng)，對(duì)流行性斑疹傷寒和地方性斑疹傷寒能產(chǎn)生交叉保護(hù)力，但不同批次的疫苗功效差異大，疫苗成分難以定量，存在毒力恢復(fù)的情況[3]。第二次世界大戰(zhàn)至20世紀(jì)70年代，Rp減毒株(如Madrid E株)曾廣泛應(yīng)用。該減毒株由雞胚傳代強(qiáng)毒株11次后分離得到，不產(chǎn)生內(nèi)毒素，對(duì)豚鼠和猴不致病且保持免疫原性。94%的接種者在14個(gè)月內(nèi)可免于流行性斑疹傷寒的自然感染。志愿者在接種后3年內(nèi)接受強(qiáng)毒株攻毒，96%能夠避免感染，在接種后的4～5年內(nèi)仍有83%具有保護(hù)力。但個(gè)別志愿者的接種部位出現(xiàn)紅腫、淋巴結(jié)炎，或出現(xiàn)低熱、頭痛等不良反應(yīng)，此反應(yīng)有時(shí)為速發(fā)型，有時(shí)為遲發(fā)型。20世紀(jì)70年代，研究者在豚鼠上分離到毒力恢復(fù)突變體，該疫苗逐漸停止應(yīng)用[4]。

1.3 亞單位疫苗 由于傳統(tǒng)滅活疫苗和減毒活疫苗存在許多不足，有學(xué)者提出利用可溶性表面蛋白與糖蛋白抗原研制亞單位疫苗，這些可溶性抗原具有免疫原性與保護(hù)性。豚鼠實(shí)驗(yàn)表明，Rp可溶性蛋白中的不耐熱及種特異組分與保護(hù)性有關(guān)，純化的Rt種特異蛋白(不含脂多糖)成為傷寒疫苗的候選。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，純化的Rt可溶性蛋白組分既能預(yù)防流行性斑疹傷寒，也能預(yù)防地方性斑疹傷寒，是一種復(fù)合型傷寒疫苗[5]。然而，直接從Rp或Rt中大量提取種特異性抗原非常困難，難以控制成本并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，且危險(xiǎn)性高。此外，不正確的折疊和低甲基化會(huì)降低蛋白免疫原性。分子生物學(xué)技術(shù)出現(xiàn)后，重組亞單位疫苗成為研究熱點(diǎn)，關(guān)注點(diǎn)主要集中在膜蛋白的克隆表達(dá)及在動(dòng)物模型上重組亞單位疫苗的可行性[6]。

2 落基山斑點(diǎn)熱疫苗

落基山斑點(diǎn)熱的病原體為立氏立克次體(Rr)，由蜱傳播。Rr在斑點(diǎn)熱群立克次體中感染性和致病力最強(qiáng)，被列入生物戰(zhàn)劑清單。落基山斑點(diǎn)熱的特征是突然起病、頭痛、寒顫、發(fā)燒，四肢出現(xiàn)皮疹并波及軀干部，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)生昏迷、休克及腎衰竭[7]。該病目前僅發(fā)生在美洲地區(qū)。隨著國(guó)際交往的逐年增多，傳染病已成為全球的共同威脅，Rr也有傳播到我國(guó)的可能性。

2.1 滅活疫苗 落基山斑點(diǎn)熱滅活疫苗是最早的立克次體疫苗之一。學(xué)者用Rr感染蜱，分離蜱的內(nèi)臟后用苯酚滅活制成疫苗。這種疫苗應(yīng)用于發(fā)病率低、病死率高的地區(qū)，可減輕癥狀、降低病死率；而應(yīng)用在發(fā)病率高、病死率低的地區(qū)，則可以降低發(fā)病率。隨后，有學(xué)者用雞胚卵黃囊法培養(yǎng)Rr，經(jīng)苯酚與甲醛滅活后制成疫苗。蜱和雞胚培養(yǎng)法制備的2種疫苗在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)產(chǎn)生相似水平的免疫力；在人體試驗(yàn)中均不能保護(hù)接種者免于感染，但延長(zhǎng)了疾病的潛伏期，略微縮短了發(fā)病期。有學(xué)者用雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)和蔗糖密度梯度離心法純化Rr菌體，研制甲醛滅活Rr疫苗。這種疫苗在動(dòng)物上有一定免疫效果，接種人后也誘發(fā)抗原特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，但在安慰劑對(duì)照、雙盲試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)疫苗產(chǎn)生的保護(hù)力不夠[8]。

2.2 減毒活疫苗 傳統(tǒng)上Rr的培養(yǎng)和遺傳操作比較困難，其減毒疫苗一直是研究空白。改進(jìn)的Rr分離培養(yǎng)方法和新出現(xiàn)的遺傳學(xué)操作技術(shù)為研制Rr減毒苗提供了可能。

2.3 亞單位疫苗 由于早期的落基山斑點(diǎn)熱滅活苗保護(hù)力低，不能誘導(dǎo)產(chǎn)生足夠的保護(hù)性免疫，學(xué)者逐漸轉(zhuǎn)向Rr亞單位疫苗的研究。Rr外膜蛋白OmpA與OmpB是感染初期主要的免疫原，也是主要的Rr亞單位疫苗候選，可誘導(dǎo)保護(hù)性免疫。重組OmpA的N末端能夠部分保護(hù)豚鼠抵抗致死劑量的Rr。OmpA與OmpB的基因也已用于研制DNA疫苗。DNA初次免疫與相應(yīng)多肽加強(qiáng)免疫的策略可產(chǎn)生部分對(duì)康氏立克次體的保護(hù)性，且比單一組分單獨(dú)免疫更加有效，但產(chǎn)生這種保護(hù)性的機(jī)制目前尚不清楚[9]。盡管如此，這種免疫策略不能誘導(dǎo)長(zhǎng)效可靠的免疫力，對(duì)落基山斑點(diǎn)熱的保護(hù)效果有限。

3 恙蟲(chóng)病疫苗

恙蟲(chóng)病的病原體為恙蟲(chóng)病東方體(Ot)，在恙螨和許多動(dòng)物中廣泛存在，具有典型的自然疫源性。恙蟲(chóng)病臨床表現(xiàn)為突發(fā)高熱、淺表淋巴結(jié)腫大、蟲(chóng)咬潰爛、皮疹等，在亞太地區(qū)發(fā)病率較高，是東南亞地區(qū)重要的傳染病[10]。Ot不屬于生物戰(zhàn)劑，但與東南沿海地區(qū)的軍事行動(dòng)關(guān)系密切，如美國(guó)軍隊(duì)在第二次世界大戰(zhàn)島嶼作戰(zhàn)期間曾因Ot感染造成大面積非戰(zhàn)斗減員。

3.1 滅活疫苗 對(duì)于恙蟲(chóng)病疫苗的研究開(kāi)始較早，研究者曾采用鼻腔、腹腔、靜脈接種法將Ot適應(yīng)于小白鼠、棉鼠、大白鼠的蜱、肺及腹膜等組織，以提高Ot繁殖量來(lái)研制疫苗。有學(xué)者取脾、肺組織制成甲醛疫苗；也有學(xué)者采用組織培養(yǎng)法加甲醛滅活，經(jīng)凍融處理制成疫苗。研究發(fā)現(xiàn)，Ot滅活疫苗在動(dòng)物上可產(chǎn)生對(duì)同株Ot的免疫力，而對(duì)異株的免疫力較低。美國(guó)軍隊(duì)曾在緬甸駐軍中試驗(yàn)過(guò)恙蟲(chóng)病鼠肺疫苗，疫苗接種組與未接種組比較，恙蟲(chóng)病的發(fā)病率和病死率沒(méi)有顯著區(qū)別[11]，說(shuō)明恙蟲(chóng)病滅活疫苗雖然能對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生一定的保護(hù)，但人體免疫效果并不理想。

3.2 減毒活疫苗 有學(xué)者采用γ射線照射獲得了一株Ot減毒株，此減毒株保留了細(xì)胞感染能力，但對(duì)BALB/c小鼠不具有致病性。與甲醛滅活疫苗比較，射線減毒疫苗在小鼠實(shí)驗(yàn)中能夠?qū)Ξ愔闛t產(chǎn)生更好的保護(hù)力。在評(píng)價(jià)疫苗長(zhǎng)效保護(hù)力的實(shí)驗(yàn)中，射線減毒疫苗對(duì)同株Ot的保護(hù)力可持續(xù)1年，而對(duì)異株Ot的保護(hù)力在6個(gè)月時(shí)就已經(jīng)不明顯[12]。射線減毒疫苗的缺點(diǎn)是難以標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)及儲(chǔ)存。

3.3 亞單位疫苗 對(duì)于恙蟲(chóng)病亞單位疫苗的研究，多集中在22、47、56、58、110×103蛋白抗原。56×103蛋白與麥芽糖結(jié)合蛋白的重組融合蛋白，既可作為有效的免疫診斷試劑，也能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生有效的體液免疫和細(xì)胞免疫[13]。47×103蛋白的基因與多肽聯(lián)合免疫小鼠能同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性體液免疫和細(xì)胞免疫[14]。已有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，Ot亞單位疫苗值得進(jìn)行進(jìn)一步研究。

4 Q熱疫苗

Q熱的病原體為貝氏柯克斯體(Cb)，臨床一般無(wú)顯著特征，常與其他熱性傳染病難以區(qū)別。急性Q熱表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、肌肉酸痛，常伴有肺炎、肝炎等。慢性Q熱表現(xiàn)為心內(nèi)膜炎、肉芽腫性肝炎、骨髓炎等。動(dòng)物感染后出現(xiàn)食欲不振、體質(zhì)量下降、不孕、流產(chǎn)、死胎等。雖然抗菌藥物治療對(duì)Q熱有效，但慢性Q熱治療周期長(zhǎng)，容易復(fù)發(fā)，疫苗接種是防治Q熱的最有效手段[15]。

4.1 滅活疫苗 最早研制的Q熱疫苗是為了控制Cb在動(dòng)物中的感染流行。澳大利亞學(xué)者用甲醛滅活Cb作為疫苗，免疫豚鼠后能抵御其他Cb菌株的感染，免疫牛羊后可防止實(shí)驗(yàn)室和自然感染Cb。澳大利亞甲醛滅活疫苗Q-Vax是唯一被許可的人用Q熱疫苗，可有效保護(hù)動(dòng)物接觸者等Q熱高危人群。但該疫苗會(huì)引起較重不良反應(yīng)，包括皮疹、發(fā)熱、頭痛、接種部位腫塊等，曾感染或接種過(guò)Q熱疫苗者的不良反應(yīng)更嚴(yán)重，因此接種前需要做皮試篩選[16]。此外，該疫苗的生產(chǎn)需要在生物安全三級(jí)以上實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，這與皮試篩選共同增加了該疫苗大范圍免疫的難度。

4.2 減毒活疫苗 通過(guò)在豚鼠和小鼠中反復(fù)傳代，俄羅斯學(xué)者獲得了CbGrita減毒株M-44，免疫豚鼠、小白鼠、家兔后可產(chǎn)生牢固的免疫力，能承受強(qiáng)毒的攻擊。口服、劃痕或皮下一次免疫人體均能產(chǎn)生較高的抗體滴度，且不良反應(yīng)發(fā)生率低，即使患過(guò)Q熱或血清學(xué)呈陽(yáng)性反應(yīng)，接種疫苗后也不出現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)。然而，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)毒株在組織中長(zhǎng)期存在，有毒力恢復(fù)的風(fēng)險(xiǎn)[17]。

4.3 亞單位疫苗 Q熱亞單位疫苗主要有氯仿-甲醇提取后的Ⅰ相Cb殘存物(CMR)、Ⅰ相Cb的三氯乙酸提取物(TCAE)和Ⅰ相Cb脂多糖(LPSI)。CMR不僅能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗Cb特異性保護(hù)免疫，還能刺激產(chǎn)生高水平的非特異性免疫[18]。與滅活疫苗比較，CMR具有相同水平的免疫保護(hù)力，不良反應(yīng)發(fā)生率顯著降低。TCAE與LPSI免疫小鼠后，都能產(chǎn)生較高滴度的抗體，且LPSI抗體主要出現(xiàn)于急性患者的恢復(fù)期和慢性患者中，提示LPSI可能適用于預(yù)防慢性Q熱[19]。隨著基因重組技術(shù)的發(fā)展，基因工程重組亞單位疫苗自20世紀(jì)末起成為研究熱點(diǎn)。研究較多的Cb保護(hù)性抗原有27、30、34、67×103及熱休克蛋白等，上述均為Q熱亞單位疫苗成分候選。

5 小 結(jié)

自1916年普氏立克次體被首次命名，已過(guò)去近1個(gè)世紀(jì)，立克次體學(xué)家對(duì)安全高效人用立克次體疫苗的研究仍在探索中。對(duì)3個(gè)專性細(xì)胞內(nèi)寄生立克次體——Rp、Rr、Ot的滅活疫苗研究一致發(fā)現(xiàn)，不論采用何種培養(yǎng)方法，高度純化的全菌抗原雖然在動(dòng)物上有時(shí)可誘導(dǎo)堅(jiān)固的保護(hù)性免疫，但是僅能刺激人體產(chǎn)生部分保護(hù)，不能誘導(dǎo)無(wú)菌保護(hù)性免疫。對(duì)這3個(gè)菌種的亞單位疫苗研究受限于菌體的培養(yǎng)純化。對(duì)三者的重組亞單位疫苗研究在動(dòng)物模型上已取得了可喜進(jìn)展，但還沒(méi)有相關(guān)臨床試驗(yàn)研究。盡管還沒(méi)有理想的疫苗，前期研究已發(fā)現(xiàn)Rp與Ot的減毒活疫苗可誘導(dǎo)堅(jiān)固的保護(hù)性免疫，這與其他病原減毒活疫苗的高效性相一致。隨著立克次體遺傳操作技術(shù)的發(fā)展，定向改造的減毒活疫苗有望成為新的研究熱點(diǎn)。

本文涵蓋的4種立克次體病中，Cb導(dǎo)致的Q熱是特例。目前，Cb仍被認(rèn)為是專性胞內(nèi)寄生菌，但無(wú)生命培養(yǎng)基的出現(xiàn)已使Cb“專性胞內(nèi)寄生”的標(biāo)簽受到質(zhì)疑。與Rp、Rr和Ot不同，Cb滅活疫苗和亞單位疫苗均可以誘導(dǎo)人體產(chǎn)生長(zhǎng)效保護(hù)性免疫，此疫苗的主要缺點(diǎn)是Cb培養(yǎng)純化離不開(kāi)高級(jí)別生物安全實(shí)驗(yàn)室。目前，有2種策略可望解決Cb疫苗大規(guī)模生產(chǎn)的難點(diǎn)：重組表達(dá)保護(hù)性抗原或保護(hù)性抗原表位，采用遺傳學(xué)方法將Cb減毒以解除其高級(jí)別生物安全的要求?？傊?，Cb與Rp、Rr、Ot代表了一大類生物學(xué)性狀相似的專性胞內(nèi)寄生菌，對(duì)它們的疫苗研究不僅有助于疾病防控，也有可能為其他疾病防控提供工具或思路，新近發(fā)展迅速的立克次體遺傳學(xué)改造技術(shù)將在立克次體疫苗研制中發(fā)揮重要作用。

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病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(SKLPBS1409)?！?/p>

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.22.026

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1673-4130(2016)22-3162-03

2016-07-05

2016-09-11)