兔艾美耳球蟲分子生物學鑒定技術研究進展

樊翀宇，呂繼洲，楊曉野，吳紹強*

(1.內蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，內蒙古呼和浩特 010018；2.中國檢驗檢疫科學研究院動物檢疫研究所，北京 100029)

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兔艾美耳球蟲分子生物學鑒定技術研究進展

樊翀宇1,2，呂繼洲2，楊曉野1，吳紹強2*

(1.內蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，內蒙古呼和浩特 010018；2.中國檢驗檢疫科學研究院動物檢疫研究所，北京 100029)

感染兔的艾美耳屬球蟲主要有11種，其對世界養(yǎng)兔業(yè)的危害日益嚴重。論文綜述了國內外兔艾美耳球蟲分子生物學鑒定技術的研究進展，基于不同靶標序列分類總結和分析了鑒定技術的優(yōu)點和存在的問題，展望了未來兔艾美耳球蟲分子生物學鑒定技術的應用前景和發(fā)展趨勢，以期為兔艾美耳球蟲病的診斷、預防和控制提供技術手段和方法依據(jù)。

兔；艾美耳球蟲；分子生物學；鑒定技術

兔球蟲病是家兔中常見的一類寄生蟲病，對養(yǎng)兔業(yè)危害很大，是養(yǎng)兔生產(chǎn)中長期存在的一個難題。各品種家兔對艾美耳球蟲(Eimeria)都易感染，特別是斷奶到4月齡的小兔最易發(fā)病[1]。幼兔的球蟲感染率一般為90%，病死率為40%～70%[2]。耐過球蟲病未死亡的或經(jīng)治愈的家兔多成為長期帶蟲者，是該病的傳染源[3]。鑒于兔球蟲病危害的嚴重程度，我國農(nóng)業(yè)部將其列入《一、二、三類動物疫病病種名錄》中的二類動物疫病。為防止該病跨境傳入傳出，2013年發(fā)布的《中華人民共和國進境動物檢疫疫病名錄》中也收錄了兔球蟲病。

兔球蟲病主要是由寄生在腸道和膽管上皮細胞的艾美耳屬球蟲引發(fā)[4]。世界上已報道的感染兔的艾美耳球蟲包括斯氏艾美耳球蟲(E.stiedai)、小型艾美耳球蟲(E.exigua)、中型艾美耳球蟲(E.media)、大型艾美耳球蟲(E.magna)、黃艾美耳球蟲(E.flavescens)、盲腸艾美耳球蟲(E.coecicola)、腸艾美耳球蟲(E.intestinalis)、無殘艾美耳球蟲(E.irresidua)、梨形艾美耳球蟲(E.piriformis)、維氏艾美耳球蟲(E.vejdovskyi)及穿孔艾美耳球蟲(E.perforans)[5-8]。

兔球蟲病傳統(tǒng)上以糞便檢查為主要確診手段，通過對糞便中卵囊的形態(tài)學及培養(yǎng)特性，主要是球蟲卵囊的大小、形態(tài)、內部構造及發(fā)育時間等特征進行鑒定，確定感染球蟲種類[9]。但是，依靠形態(tài)學鑒定球蟲種類容易出現(xiàn)如下問題：首先，全面掌握所有11種兔球蟲種類的形態(tài)學特征及區(qū)分方法需要耗費大量的時間，而且十分困難；其次，不同種類兔球蟲卵囊之間的形態(tài)、大小極為相近，即使經(jīng)驗豐富的專家也難以將它們區(qū)分。除此之外，兔球蟲感染往往是腸道兔球蟲和肝臟兔球蟲同時感染，單一個體內存在2種或2種以上兔球蟲的情況比較普遍[10]?；谏鲜鲈颍邪l(fā)兔球蟲病病原種類的特異性診斷技術及簡便易行的分子生物學種類鑒定方法勢在必行。

本文就近年發(fā)展起來的有關感染兔的艾美耳球蟲的分子生物學鑒定技術和方法進行了綜述與探討，以便為兔球蟲病的分子生物學診斷體系的建立與應用提供參考。

1　兔艾美耳球蟲分子生物學鑒定方法

1.1基于核基因組的鑒定技術

1.1.1普通PCR方法2010年，崔平等分別成功分離了腸艾美耳球蟲[1]、黃艾美耳球蟲[11]和大型艾美耳球蟲[12]卵囊并提取基因組，根據(jù)GenBank中各自的18 S rDNA序列設計引物，建立了針對這3種艾美耳球蟲的PCR鑒定方法，均擴增出了清晰條帶，經(jīng)比對，目的產(chǎn)物與GenBank中序列同源性在98.5%以上。2014年，石團員等[13]以中國家兔的腸艾美耳球蟲為對象，根據(jù)18 S rRNA基因序列進行PCR擴增，經(jīng)測序和比對，結果表明國內艾美耳球蟲的18 S rRNA基因序列與法國和捷克分離的同種艾美耳球蟲同源性分別為100%和96%。

2011年方素芳等[14-15]根據(jù)GenBank中發(fā)表的艾美耳屬球蟲18 S rDNA和5.8 S rDNA序列設計引物，通過PCR擴增內轉錄間隔區(qū)1(ITS-1)，分別以腸艾美耳球蟲卵囊基因組和黃艾美耳球蟲卵囊基因組為模板，擴增出了預期片段。2012年 ，顧小龍等[16]先是利用艾美耳屬球蟲18 S rDNA和5.8 S rDNA保守引物，PCR擴增3種兔球蟲(大型艾美耳球蟲、黃艾美耳球蟲和腸艾美耳球蟲)ITS-1片段，隨后又對國內5種兔球蟲(大型艾美耳球蟲、黃艾美耳球蟲、腸艾美耳球蟲、中型艾美耳球蟲及穿孔艾美耳球蟲)ITS-1序列進行擴增分析，與GenBank中序列同源性均在96.9%以上，表明ITS-1序列可作為兔球蟲分子鑒定的遺傳標記[17]。但由于ITS-1長度有限，不適合多重PCR等一些對遺傳標記有長度要求的鑒別方法。鑒于此，許家園等[10]在2014年對3種常見兔艾美耳球蟲的ITS全序列進行了PCR擴增和序列測定，并與GenBank中的相應序列比對，試驗結果與Kvicerova等用18 S rDNA進行系統(tǒng)進化分析的結果一致，表明ITS序列可應用于兔球蟲的系統(tǒng)進化研究，為兔球蟲的分類鑒定、分子流行病學調查及相關研究奠定了基礎。

2013年，閆文朝等[18]擴增了6種兔艾美耳球蟲的ITS1-5.8S-ITS2完整序列。結果顯示，每一種兔球蟲的ITS1和ITS2序列都具有特異性?；贗TS1和ITS2的多態(tài)位點，他們建立了一種特異、敏感的多重PCR診斷方法，用于區(qū)分和鑒定斯氏艾美耳球蟲、腸艾美耳球蟲和黃艾美耳球蟲這3種高致病性艾美耳球蟲。此項研究為兔高致病性艾美耳球蟲的臨床鑒別和兔球蟲病的群體遺傳學研究提供了依據(jù)。

1.1.2套式PCR方法2011年，Oliveira U C等[19]根據(jù)11種兔艾美耳球蟲各自的ITS1區(qū)序列設計特異性引物，建立了針對不同種球蟲的套式PCR方法。經(jīng)特異性試驗驗證，種間無交叉反應；敏感性試驗結果顯示，檢測限從500 fg到1 pg不等，相當于0.8個～1.7個孢子化卵囊，且用3種不同品牌的擴增酶得到了一致的敏感性結果。這些敏感性好、特異性高的方法為兔艾美耳球蟲流行病學調查提供了有效途徑。

2014年，王云周等[20]對斯氏艾美耳球蟲和中型艾美耳球蟲的單卵囊基因組DNA進行隨機擴增，然后用WGA(whole genome amplification)的產(chǎn)物作為模板，根據(jù)2種艾美耳球蟲的ITS-1、18 S rDNA和23S rDNA設計特異性引物，建立了套式PCR方法。此方法可成功擴增出單卵囊基因，用這些單卵囊分離斯氏艾美耳球蟲和中型艾美耳球蟲的方法所進行的種類鑒定，與形態(tài)學鑒定結果完全一致，這表明套式PCR方法在艾美耳球蟲單卵囊水平的分子生物學鑒定中具有實用性，該方法也可應用到其他寄生蟲的鑒定。

1.1.3實時熒光定量PCR方法2015年，許家園等[21]針對腸艾美耳球蟲ITS2序列設計1對特異性引物，以10倍倍比稀釋的已知卵囊含量的腸艾美耳球蟲DNA為模板進行SYBR Green Ⅰ real-time PCR的擴增和標準曲線的建立。結果顯示，最低可檢測1個卵囊含量的樣品，與同屬的大型艾美耳球蟲、黃艾美耳球蟲和中型艾美耳球蟲均不發(fā)生交叉反應。表明建立的實時熒光定量PCR檢測方法靈敏度高，特異性強，重復性好，為快速檢測腸艾美耳球蟲提供了有效的方法。

1.2基于線粒體基因組(mtDNA)的鑒定技術

2012年，田思勤等[22]根據(jù)艾美耳球蟲線粒體cytb基因設計保守引物，擴增兔6種艾美耳球蟲cytb基因部分序列。根據(jù)獲得cytb基因已知序列，設計長PCR引物，建立了套式PCR方法，獲得了6種兔球蟲mtDNA全序列。然后分析了6種艾美耳球蟲線粒體基因組的基因結構、核苷酸組成、密碼子使用情況等信息，以線粒體基因組蛋白質編碼基因為標記，構建進化樹，探討兔艾美耳球蟲在頂復門寄生蟲中的進化位置。

2015年，劉國華等[23]針對腸艾美耳球蟲、黃艾美耳球蟲、中型艾美耳球蟲、維氏艾美耳球蟲和無殘艾美耳球蟲5種常感染家兔的艾美耳球蟲的線粒體基因設計長PCR引物，建立了普通PCR鑒定方法并獲得了這5種球蟲線粒體基因組序列。通過對mtDNA的標記來進行群體遺傳學和分子流行病學的研究，為分子診斷、預防和控制兔球蟲做出貢獻。

1.3基于頂質體基因組的鑒定技術

田思勤等[24]2014年采用劉國昌[25]報道的堆型艾美耳球蟲rpoB和TufA基因的擴增引物，建立了針對兔艾美耳球蟲rpoB和TufA基因的PCR技術，并利用生物學軟件與GenBank中收錄的頂復門寄生蟲相關序列進行比對和進化分析。結果表明，擴增的兩種兔艾美耳球蟲rpoB和TufA基因片段的大小均相同，兩種球蟲rpoB和TufA基因種間的差異分別為6.8%和0.2%，rpoB基因差異相對較大，而TufA基因差異較小。因此，rpoB基因序列可以作為兔艾美耳球蟲種間的遺傳標記，用得到的rpoB基因序列為參考與其他頂復門寄生蟲進行進化分析進一步證明了該結論，首次報道兔艾美耳球蟲頂質體rpoB和TufA基因的部分序列，為兔艾美耳球蟲的鑒定和進化分析提供參考依據(jù)，也為頂復門頂質體的深入研究奠定了基礎。

2　不同分子生物學鑒定技術的評價

國內外用于鑒定兔球蟲的分子生物學方法和技術有很多，不同技術都有各自的優(yōu)缺點。崔平等人先后用普通PCR方法擴增ITS1序列，對腸艾美耳球蟲、黃艾美耳球蟲、大型艾美耳球蟲、中型艾美耳球蟲和穿孔艾美耳球蟲進行同源鑒定，同源性在96.9%以上。其中建立的針對腸艾美耳球蟲、黃艾美耳球蟲和大型艾美耳球蟲PCR方法的敏感性結果顯示最低能檢出27個孢子化卵囊。此種方法成本低，操作簡便，但是擴增產(chǎn)物需要純化測序，浪費時間，且易出現(xiàn)假陰性。套式PCR由于模板和引物的改變，降低了非特異性反應連續(xù)放大的可能性，保證了反應的特異性，也極大的提高了PCR的敏感性，可以檢出單個卵囊；但是套式PCR方法仍需要對結果進行電泳測定，費時費力，假陽性率高。實時熒光定量PCR通過熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，使PCR擴增和終產(chǎn)物檢測全處在封閉的條件下進行，從而具有實時監(jiān)測、無污染、快速、靈敏、精確、特異等特點，其最主要的優(yōu)勢是能對待測樣本起始PCR反應模板進行準確定量，極大的克服了普通PCR和套式PCR技術的不足。許家園建立的SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法能夠定量檢測到含有一個卵囊含量的樣本，敏感性和特異性都較高[21]。然而，SYBR Green染料的特異性還有待提高。

無論哪一種兔球蟲的分子鑒定技術，其中DNA擴增引物的設計是關鍵，引物的特異性直接影響鑒定結果的準確性。目前文獻報道最多的引物主要有兩類，一類是根據(jù)球蟲的保守序列設計的引物，最常選用的靶基因是核糖體基因，其中包括18 S、5.8 S、28 S rDNA。在18 S rDNA與5.8 S rDNA 之間以及5.8 S rDNA與28 S rDNA之間有內轉錄間隔區(qū)(ITS)。ITS序列具有功能上的保守性和進化上的時鐘性[26]，被越來越多地用于物種分類和遺傳進化關系的研究[27-28]；另一類是基于線粒體基因組的鑒定技術，mtDNA結構簡單、穩(wěn)定、以母系方式遺傳，不受父本的影響；核苷酸歧異度大、進化速度快等特點，使得mtDNA在種間、種內、群體間和群體內具有廣泛的多態(tài)性，常被作為可靠的遺傳標記，應用于相近寄生蟲種類鑒定[29-30]。COI基因屬線粒體基因，其編碼的COI為呼吸鏈的重要組分，普通存在于原核生物和真核生物細胞的線粒體中，其進化速度比核基因快10倍以上，故易受環(huán)境的影響及誘導而體現(xiàn)進化過程。

3　展望

分子生物學鑒定技術在檢測和鑒定兔球蟲種類方面的研究發(fā)展迅速，不斷有新的技術方法出現(xiàn)，顯示出較好的應用前景，分子生物學鑒定方法已部分取代了傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法，應用于鑒定工作中。如TaqMan探針法實時熒光定量PCR，因其重復性好、特異性強、線性范圍寬等特點在各個領域有著廣泛的應用，內標系統(tǒng)的引入進一步提升了該方法的靈敏度，增加了其可靠性和實用性[31]。焦磷酸測序技術是一種新的DNA序列分析技術，其特點是操作簡便、大通量、自動化，適合大量樣本的快速檢測，無須進行電泳、DNA序列無須熒光標記等，是一個理想的遺傳分析技術平臺。環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術是一種新的恒溫核酸擴增技術，具有特異性強、等溫靈敏、操作簡單、產(chǎn)物易檢測等優(yōu)點。該技術已被用于多種病原微生物的檢測。相對于一般意義上的生物芯片，液相芯片具有高通量、高靈敏度、檢測準確、重復性好、線性范圍寬廣等優(yōu)勢，液相芯片技術在生物醫(yī)學工程領域具有廣泛的應用。目前，應用這些技術對艾美耳球蟲進行檢測的方法還未見報道。相信未來實時熒光定量PCR、LAMP、液相芯片等方法的應用將克服現(xiàn)有兔艾美耳球蟲檢測方法存在的各種問題，為兔球蟲物種鑒定、檢測及流行病學調查提供更好的技術，滿足口岸科學檢疫把關的技術需求。

[1]崔平,顧小龍,方素芳,等.腸艾美爾球蟲純種分離及18 S rDNA部分序列測定[J].中國動物檢疫,2010,27(8):40-43.

[2]宋鴻雁,朱順星,劉春,等.江蘇省實驗兔球蟲感染情況調查研究[J].動物醫(yī)學進展,2012,33(12):88-91.

[3]陳美珍,張嘉,王壽昆,等.福建某獺兔場兔艾美耳球蟲感染情況調查及種類鑒定[J].中國畜牧獸醫(yī),2015,42(8):2204-2209.

[4]江甜.兔球蟲病診斷與防治[J].中國動物保健,2013,15(6):49-50.

[5]王夢艷.溫縣地區(qū)兔球蟲病流行病學調查及藥物防治試驗[D].河南洛陽：河南科技大學,2015.

[6]Silva S M,Ferreira C,Paupério J,et al.Coccidiosis in European rabbit (Oryctolaguscuniculusalgirus) populations in the Iberian Peninsula[J].Acta Parasitol,2015,60(2):350-355.

[7]Okumu P O,Gathumbi P K,Karanja D N,et al.Prevalence,pathology and risk factors for coccidiosis in domestic rabbits (Oryctolaguscuniculus) in selected regions in Kenya[J].Vet Quart,2014,34(4):205-210.

[8]Stanley J B,Micheal R P,Keith R S,et al.Observations on oocyst development ofEimeriastiedaiin rabbits[J].Acta Parasitol,2014,59(3):544-547.

[9]安紅麗.山東省兔球蟲流行病學調查[D].山東泰安：山東農(nóng)業(yè)大學,2013.

[10]許家園,廖貴城,胡會朋,等.3種兔艾美耳球蟲rDNA ITS序列測定與系統(tǒng)進化分析[J].中國畜牧獸醫(yī),2014,41(12):30-33.

[11]方素芳,崔平,顧小龍,等.黃艾美耳球蟲河北株18 S rDNA部分序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2011,9(66):99-100.

[12]方素芳,顧小龍,崔平,等.大型艾美爾球蟲18S rDNA部分序列測定與系統(tǒng)發(fā)育分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學,2011,50(9):1838-1841.

[13]Shi T，Bao G.A low-virulenceEimeriaintestinalisisolate from rabbit (Oryctolaguscuniculus)in China:molecular identification,pathogenicity,and immunogenicity[J].Parasitol Res,2014,113(3):1085-1090.

[14]方素芳,顧小龍,崔平,等.腸艾美耳球蟲單卵囊分離及ITS-1序列測定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2011,1(163):307-308.

[15]方素芳,崔平,顧小龍,等.黃艾美耳球蟲純種分離及ITS-1序列測定[J].河南農(nóng)業(yè)科學,2011,40(1):144-146.

[16]顧小龍,劉紅彬,崔平,等.3種兔球蟲ITS-1序列測定與系統(tǒng)發(fā)育分析[J].中國獸醫(yī)學報,2012,3(27):984-987.

[17]顧小龍,孫秀梅,劉紅彬,等.基于ITS-1序列的5種兔球蟲系統(tǒng)進化分析[J].畜牧獸醫(yī)學報,2012,43(7):1123-1128.

[18]Yan W,Wang W,Wang T,et al.Simultaneous identification of three highly pathogenicEimeriaspecies in rabbits using a multiplex PCR diagnostic assay based on ITS1-5.8S rRNA-ITS2 fragments[J].Vet Parasitol,2013,193(1):284-288.

[19]Oliveira U C,Fraga J S,Licois D,et al.Development of molecular assays for the identification of the 11Eimeriaspecies of the domestic rabbit (Oryctolaguscuniculus)[J].Vet Parasitol,2011,176(2):275-280.

[20]Wang Y,Tao G,Cui Y,et al.Molecular analysis of single oocyst ofEimeriaby whole genome amplification (WGA) based nested PCR[J].Exp Parasitol,2014,144:96-99.

[21]許家園,程田,胡會朋,等.兔腸艾美耳球蟲實時熒光定量PCR檢測方法的建立[J].動物醫(yī)學進展,2015,36(5):36-39.

[22]田思勤.兔6種艾美耳球蟲線粒體基因組序列測定及系統(tǒng)發(fā)生研究[D].黑龍江大慶：黑龍江八一農(nóng)墾大學,2014.

[23]Liu G,Tian S,Cui P,et al.The complete mitochondrial genomes of fiveEimeriaspecies infecting domestic rabbits[J].Exp Parasitol,2015,159:67-71.

[24]田思勤,張艷,常巧呈,等.兩種兔艾美耳球蟲頂質體rpoB和TufA基因的擴增及序列分析[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學學報,2014,26(2):40-43.

[25]劉國昌.雞艾美耳球蟲頂質體、核糖體IGS序列分析及熒光定量PCR檢測方法的建立[D].廣東廣州：華南農(nóng)業(yè)大學,2013.

[26]Metwaly M S,Dkhil M A,Gewik M M,et al.Induced metabolic disturbance and growth depression in rabbits infected withEimeriacoecicola[J].Parasitol Res,2013,112(9):3109-3114.

[27]Mason S,Dubey J P,Smith J E,et al.Toxoplasmagondiicoinfection with diseases and parasites in wild rabbits in Scotland[J].Parasitology,2015,142(11):1315-1421.

[28]Singh S,Arthur S,Talukder J,et al.Mast cell regulation of Na-glutamine co-transporters B0AT1 in villus and SN2 in crypt cells during chronic intestinal inflammation[J].BMC Gastroenterol,2015,15:47.

[29]Lin R,Qiu L,Liu G,et al.Characterization of the complete mitochondrial genomes of fiveEimeriaspecies from domestic chickens[J].Gene,2011,480:28-33.

[30]Kamata Y,Saito M,Irikura D,et al.A toxin isolated fromSarcocystisfayeriin raw horse meat may be responsible for food poisoning[J].J Food Protect,2014,77(5):814-819.

[31]姜文燦,岳素文,江洪,等.Taqman探針法實時熒光定量PCR的應用和研究進展[J].臨床檢驗雜志,2015,4(1):797-805.

Progress on Molecular Identification Techniques of Rabbit Eimeria spp.

FAN Chong-yu1,2,Lü Ji-zhou2,YANG Xiao-ye1,WU Shao-qiang2

(1.College of Veterinary Medicine,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot,Inner Mongolia，010018,China;2.InstituteofAnimalQuarantine,ChineseAcademyofInspectionandQuarantine,Beijing,100029,China)

At present,11Eimeriaspecies that could infect rabbits were recognized.Coccidiosis could cause significant economic losses to rabbit industry worldwide.This paper reviewed the research progress on the molecular techniques adopted in rabbitEimeriaspecies identification,and discussed the advantages and the problems of these molecular methods.Besides,this paper also made a forecast on the tendency of molecular techniques in rabbitEimeriaspecies identification,which would be helpful in the diagnosis,prevention and control of rabbit coccidiosis.

rabbit;Eimeriaspp; molecular identification; technique

2016-03-08

國家科技支撐計劃項目(2012BAK11B04)

樊翀宇(1990-)，女，內蒙古鄂爾多斯人，獸醫(yī)碩士，主要從事動物寄生蟲學研究。*通訊作者

S852.723

A

1007-5038(2016)08-0087-04