棘腹蛙“水腫病”病原的分離鑒定

李曉英，羅　潔，杜孝田，龍方偉，胡　凱，徐敬明，樊汶樵

(重慶文理學(xué)院林學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，重慶珍稀瀕危水產(chǎn)資源保護(hù)與開發(fā)研究中心，重慶 402168)

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棘腹蛙“水腫病”病原的分離鑒定

李曉英，羅潔，杜孝田，龍方偉，胡凱，徐敬明，樊汶樵*

(重慶文理學(xué)院林學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，重慶珍稀瀕危水產(chǎn)資源保護(hù)與開發(fā)研究中心，重慶 402168)

為了解重慶地區(qū)部分棘腹蛙養(yǎng)殖場(chǎng) “水腫病”病因，并對(duì)該病的臨床防控提供參考，本研究采集了10只具有 “水腫病”典型癥狀的2歲齡棘腹蛙成蛙，剖檢后從其主要病變組織分離細(xì)菌；對(duì)分離的優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行培養(yǎng)特性觀察和回歸致病性試驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行生理生化特性鑒定、16 S rDNA序列測(cè)定和藥敏試驗(yàn)。結(jié)果顯示，從病蛙腹腔中分離到1株優(yōu)勢(shì)菌株并命名為CQWU201501，該菌為革蘭陰性無芽胞短桿菌，主要生理生化特性符合弗氏檸檬酸桿菌的指標(biāo)，16 S rDNA序列與弗氏檸檬酸桿菌同源性高達(dá)99.5%；藥敏試驗(yàn)顯示該菌對(duì)絕大部分β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類和四環(huán)素類藥物敏感。綜上所述，棘腹蛙“水腫病”是由弗氏檸檬酸桿菌引起的；該菌對(duì)供試的16種藥物敏感，僅對(duì)頭孢唑啉和復(fù)方新諾明2種藥物耐藥，生產(chǎn)上可選擇敏感藥物治療。

棘腹蛙；水腫?。环蛛x鑒定；藥敏試驗(yàn)

棘腹蛙(Paaboulengeri)為蛙科、棘蛙屬的兩棲動(dòng)物，體大肉美，是我國特有的大型經(jīng)濟(jì)蛙類[1]；主要分布在湖北、湖南、山西、江西、四川及甘肅等地。近年來，由于人為濫捕、棲息水體污染、生態(tài)環(huán)境被破壞等因素，導(dǎo)致棘腹蛙種群數(shù)量急劇下降，已被《中國瀕危動(dòng)物紅皮書》列為易危物種[2]。為保護(hù)野生資源，重慶市部分地區(qū)已經(jīng)開展了棘腹蛙的人工飼養(yǎng)繁殖工作。近段時(shí)間，部分養(yǎng)殖場(chǎng)的棘腹蛙出現(xiàn)腹部腫脹、氣囊變大等癥狀的“水腫病”，患病蛙短時(shí)間內(nèi)就會(huì)死亡，帶來了較大經(jīng)濟(jì)損失。在兩棲動(dòng)物的“水腫病”方面，僅見到孫浩等[3]關(guān)于嗜水氣單胞菌感染大鯢并致病的報(bào)道；在蛙類的疫病研究中，這一流行疾病未見任何相關(guān)報(bào)道。有鑒于此，本研究從患病棘腹蛙上分離致病菌，并進(jìn)行生物學(xué)特性研究和藥敏試驗(yàn)，以期為該病的有效防治提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病料及供試材料來源患病棘腹蛙成蛙10只，均為重慶市某養(yǎng)殖場(chǎng)送檢樣品，2歲齡，平均體重65.0 g±3.0 g，平均體長30.0 mm±2.0 mm。病蛙明顯腹部腫脹，部分氣囊腫脹，食量減少，嚴(yán)重患蛙死亡。剖檢可見腹腔積液，胃腫大，其他臟器未見異常。

健康棘腹蛙購自重慶某養(yǎng)殖場(chǎng)，共60只，規(guī)格為每只60 g左右，平均體長29 mm左右。

1.1.2主要試劑細(xì)菌微量生化管(批號(hào)：140123)和藥敏試紙(批號(hào)：140227)，杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；胰蛋白胨、酵母提取物等試劑，OXOID公司產(chǎn)品；水解酪蛋白(M-H)瓊脂/肉湯，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、2×TaqPCR Master Mix等，北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；其他常規(guī)試劑由重慶文理學(xué)院重慶珍稀瀕危水產(chǎn)資源保護(hù)與開發(fā)研究中心自行配制。

1.2方法

1.2.1病原菌的分離無菌操作打開10只病蛙的胸、腹腔，將腹腔積液、胃黏液及肝臟、心臟等器官勻漿接種于LB液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)18 h～24 h，觀察培養(yǎng)基上細(xì)菌生長情況；同時(shí)將接種的LB固體培養(yǎng)基置于厭氧罐中厭氧培養(yǎng)18 h～24 h，以觀察候選菌株對(duì)氧氣的需求。對(duì)分離菌進(jìn)一步純化，再轉(zhuǎn)接SS鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)，以便進(jìn)一步鑒別，采用革蘭染色鏡檢觀察。純化后的菌株加入25%的滅菌甘油中，置-20 ℃保存。

1.2.2致病性試驗(yàn)挑取單個(gè)菌落于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床振蕩培養(yǎng)12 h。用平板菌落計(jì)數(shù)法調(diào)整菌懸液濃度至3.4×107、3.4×106、3.4×105、3.4×104、3.4×103CFU/mL。將健康棘腹蛙隨機(jī)分成6組，每組10只，飼養(yǎng)1周后對(duì)其中5組進(jìn)行腹腔注射上述不同濃度的菌液，每只0.2 mL；另一組腹腔注射0.2 mL生理鹽水作為對(duì)照。每天觀察記錄試驗(yàn)蛙死亡情況，并對(duì)死亡的棘腹蛙再進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定，以確定致病菌。

1.2.3分離菌的生理生化特性鑒定取純化后的單個(gè)菌落，接種于細(xì)菌微量生化反應(yīng)管進(jìn)行生理生化特性測(cè)定，參照《伯杰氏細(xì)菌手冊(cè)》進(jìn)行結(jié)果判定。

1.2.416 S rDNA基因序列分析選取純化后單個(gè)菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中以獲得細(xì)菌懸液，提取細(xì)菌基因組DNA，采用細(xì)菌16 S rDNA的通用引物(fD1/rD1)PCR擴(kuò)增1 500 bp左右的目的片段(上、下游引物分別為：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-TACGGCTACCTTGTTAC- GACTT-3′)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后的陽性產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

將測(cè)序所得候選菌株16 S rDNA 序列通過NCBI的Blast 檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性分析。取相似較高的序列，進(jìn)行多序列匹配排列(Multiple Alignments)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)進(jìn)行藥敏性試。挑取純化后的菌株于MH肉湯中，28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)12 h。取100 μL新鮮菌懸液(濃度約1×107CFU/mL) 均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，用無菌鑷子將18種藥敏紙片均勻貼在平板上，每張紙片間距≥24 mm，紙片中心距平皿邊緣≥15 mm，28 ℃恒溫培養(yǎng)16 h～18 h后觀察平板上細(xì)菌生長情況，并測(cè)量抑菌圈直徑，參照藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1細(xì)菌分離結(jié)果及培養(yǎng)特性

在10只患病棘腹蛙腹腔積液、胃黏膜、肝臟均分離到1株相同的優(yōu)勢(shì)菌。該菌株好氧，在LB固體培養(yǎng)基上呈濕潤、光滑、低凹的半透明菌落，菌落邊緣不整齊；在SS鑒別培養(yǎng)基上呈橙黃色菌落，菌落中心呈粉紅色，邊緣不整齊。革蘭染色為無芽胞革蘭陰性桿菌，鞭毛染色可見周生鞭毛，將該純化菌株命名為CQWU201501。

2.2分離菌回歸致病試驗(yàn)結(jié)果

候選分離菌株CQWU201501人工感染4 d后棘腹蛙開始死亡，眼觀可見3.4×104CFU/mL及以上感染組棘腹蛙出現(xiàn)腹部膨大癥狀，剖檢癥狀與自然發(fā)病一致；對(duì)照組無任何異常。從感染病蛙的腹腔積液、肝臟等分離出與自然發(fā)病相同的優(yōu)勢(shì)菌。根據(jù)改良寇氏法可計(jì)算出候選菌株CQWU201501感染棘腹蛙的半數(shù)致死劑量LD50為2.14×105CFU/mL，結(jié)果見表1。

表1　候選菌株對(duì)棘腹蛙的致病性 (死亡數(shù)/試驗(yàn)數(shù))

2.3分離菌的生理生化特性鑒定結(jié)果

對(duì)菌株CQWU201501進(jìn)行生理生化特性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該菌能利用精氨酸雙水解酶，DNA酶陰性，VP試驗(yàn)陰性，在蛋白胨水中不能生長，能發(fā)酵葡萄糖、棉子糖和木糖等，能利用尿素、氰化鉀，不能利用賴氨酸脫羧酶、丙二酸鹽，不能液化明膠。生理生化鑒定結(jié)果顯示候選菌株與弗氏檸檬酸桿菌的生理生化指標(biāo)趨于一致。具體結(jié)果見表2。

表2　候選菌株的生理生化特性鑒定結(jié)果

注：“+”為陽性，“-”為陰性。

Notes:“+”Positive,“-”Negative.

2.4分離菌的16 S rDNA序列分析

成功擴(kuò)增到菌株CQWU201501的部分16 S rDNA基因序列，長度為1 402 bp。將該序列提交至NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)親緣關(guān)系最為接近，同源性最高達(dá)99.5%。結(jié)合比對(duì)結(jié)果調(diào)出與候選菌株序列相關(guān)性較高的核酸序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。

括號(hào)前為菌株名，括號(hào)內(nèi)為該菌株在GenBank 中的登錄號(hào)。

2.5分離菌的藥物敏感性試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果參照美國臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)判定，分離菌株CQWU201501對(duì)氨曲南、頭孢吡肟、頭孢噻肟、美羅培南、亞胺培南、替卡西林、奈替米星、環(huán)丙沙星、米諾環(huán)素、四環(huán)素、氨芐西林、慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星和他唑巴坦、頭孢他啶等16種抗菌藥物表現(xiàn)出不同程度的敏感性，而對(duì)頭孢唑啉、復(fù)方新諾明表現(xiàn)耐藥(表3)。

3　討論

通過培養(yǎng)特性觀察、回歸致病性試驗(yàn)、生理生化特性鑒定和16 S rDNA序列測(cè)定，本研究確定了致棘腹蛙“水腫病”的病原為弗氏檸檬酸桿菌。弗氏檸檬酸桿菌是革蘭陰性、需氧或兼性厭氧短桿菌，是檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)的一個(gè)種，該屬另外還有2個(gè)種，即無丙二酸鹽檸檬酸桿菌(C.amalonaticus)和差異檸檬酸桿菌(C.diversus)，分為11個(gè)基因種[4]；弗氏檸檬酸桿菌為該屬中的模式種。該菌具有鞭毛和菌毛，所釋放的黏附因子有助于細(xì)菌侵入機(jī)體后黏附于細(xì)胞表面，經(jīng)過定居、繁殖釋放大量內(nèi)毒素引起動(dòng)物發(fā)病；不但可以引起腹瀉和膿腫，還可導(dǎo)致如壞死性膿瘡、腹膜炎、胰腺炎、壞死性筋膜炎、骨髓炎、肺炎、腎炎、菌血癥和腦膿腫等臨床癥狀[5-8]。

本研究分離的檸檬酸桿菌致病株感染棘腹蛙后，4 d即可發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)蛙腹腔腫大，菌液稀釋10 000倍后仍可引起棘腹蛙發(fā)病并逐步死亡，顯示出這一致病菌較強(qiáng)的致病力和感染性。高正勇等[9]也曾報(bào)道過一株弗氏檸檬酸桿菌感染中國大鯢的病例，該菌株對(duì)大鯢和鯽魚都有較強(qiáng)致病力，與本試驗(yàn)分離的菌株一樣導(dǎo)致腹腔出血、積水，肝臟腫大，進(jìn)一步證實(shí)了弗氏檸檬酸桿菌對(duì)兩棲動(dòng)物的致病性，臨床上應(yīng)加大對(duì)該病的防治力度。

表3　分離菌株的藥敏試驗(yàn)

注：S.敏感；I.中度敏感；R.耐藥。

Note:S.Sensitive; I.Intermediary; R.Resistance.

棘腹蛙的人工養(yǎng)殖起步較晚，相關(guān)的資料積累還比較匱乏，導(dǎo)致了生產(chǎn)上往往盲目、超劑量使用抗生素進(jìn)行治療，既不利于疫病的有效防控，更可能造成水體環(huán)境的污染。本實(shí)驗(yàn)室近年致力于棘腹蛙細(xì)菌性疾病的防治，已報(bào)道了包括“白內(nèi)障”、“消化系統(tǒng)出血癥”等疾病[10-11]。通過研究發(fā)現(xiàn)，要做好棘腹蛙細(xì)菌性疾病的防治，既要依靠動(dòng)物的機(jī)體免疫力發(fā)揮作用[12]，也要注意合理利用消毒劑與抗菌藥。本研究證實(shí)了致棘腹蛙水腫的弗氏檸檬酸桿菌分離株對(duì)大多數(shù)供試抗菌藥敏感，針對(duì)性選取慶大霉素在養(yǎng)殖場(chǎng)使用之后，取得了良好的效果；環(huán)丙沙星、美羅培南和亞胺培南也是較佳的選擇。對(duì)于有條件的養(yǎng)殖場(chǎng)，要保持養(yǎng)殖用水潔凈無污染；在養(yǎng)殖區(qū)用生石灰粉噴灑，對(duì)于預(yù)防病原菌的滋生也有一定作用。

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Isolation and Identification of Pathogenic Bacteria Caused “Edema Disease” inPaaboulengeri

LI Xiao-ying,LUO Jie,DU Xiao-tian,LONG Fang-wei,HU Kai,XU Jing-ming,FAN Wen-qiao

(College of Forestry and Life Science，Chongqing University of Arts and Sciences,Chongqing Research Center ofConservationandDevelopmentonRareandEndangeredAquaticResources,Chongqing,402168,China)

To understand the main biological characteristics of pathogen inPaaboulengerithat suffered from “edema disease” and the methods to treat this disease,10 adult frogs (2 years old) with the typical symptoms of edema disease were collected,and candidate bacteria were isolated from the pathological tissue after dissection.Then the cultured characteristics observation,pathogenic experiment,physiological and biochemical identification,16 S rDNA sequence,and drug sensitivity test of candidate bacteria were conducted.Results showed that a Gram negative and nonspore bacillus,named as CQWU201501,was isolated from the peritoneal cavity.Physiological and biochemical characteristics and 16 S rDNA sequence indicated asCitrobacterfreundii.Drug sensitivity test revealed that the strain was sensitive to the majority drug of β-lactam,aminoglycosides,quinolones and tetracycline.Above all,theCitrobacterfreundiistrain was bacterial pathogen leading to “edema disease” ofPaaboulengeri; this pathogeny was sensitive to 16 drugs,only resistant to cefamedin and compound sulfamethoxazole.Appropriate drugs could be chosen for symptomatic treatment.

Paaboulengeri; edema disease; isolation and identification; drug resistance

2016-01-11

重慶市基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究(重點(diǎn))專項(xiàng)(cstc2015jcyjBX0013)；重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃一般項(xiàng)目(cstc2014jcyjA80042)； 重慶文理學(xué)院人才引進(jìn)項(xiàng)目(R2013LS13,R2014LX07)

李曉英(1973- )，女，四川榮縣人，副教授，主要從事食源性動(dòng)植物產(chǎn)品質(zhì)量控制研究。*通訊作者

S917.1

B

1007-5038(2016)08-0116-04