一起豬水腫病病原分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

梁　喬,趙鳳菊,于學(xué)武,李井春，趙曉彤*

(1.遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽(yáng) 110164；2.遼寧省動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究院， 遼寧沈陽(yáng) 110164)

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一起豬水腫病病原分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

梁?jiǎn)?,2,趙鳳菊1,2,于學(xué)武1,2,李井春1,2，趙曉彤1,2*

(1.遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽(yáng) 110164；2.遼寧省動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究院， 遼寧沈陽(yáng) 110164)

為查明豬群的發(fā)病原因，對(duì)發(fā)病豬進(jìn)行了臨床剖檢及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，通過(guò)分子病原學(xué)檢測(cè)，排除了豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)和豬偽狂犬病病毒(PRV)4種病原感染，并對(duì)病料進(jìn)行了細(xì)菌分離鑒定與藥敏試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所分離到的菌株培養(yǎng)特性及生化反應(yīng)特性與大腸埃希菌基本一致，經(jīng)進(jìn)一步鑒定菌體抗原血清型均為O65和O68；藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離株存在多重耐藥現(xiàn)象，其對(duì)喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、青霉素類、氨曲南類藥物均呈不同程度耐藥，而其對(duì)氨基糖苷類、磺胺類藥物均較敏感，進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證分離株均能產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)。

豬水腫?。淮竽c埃希菌；分離鑒定；耐藥性；超廣譜β-內(nèi)酰胺酶

豬水腫病是由某些特定血清型大腸埃希菌引起的腸道毒血癥，以頭部、面部等處水腫，四肢麻痹，共濟(jì)失調(diào)等為主要特征。1938年，Shanks首先報(bào)道了在愛爾蘭發(fā)現(xiàn)豬水腫病，隨后世界各地陸續(xù)有發(fā)生該病的相關(guān)報(bào)道；1956年，我國(guó)于北京地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)該病，該病發(fā)病急、病死率高，急性病例死亡率幾乎為100%，亞急性病例死亡率為60%～80%，極高的病死率嚴(yán)重制約著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。引起豬水腫病的病原血清型較多，各血清型之間的交叉保護(hù)性不強(qiáng)，菌苗的免疫效果并不明顯，因此在臨床上抗菌藥治療為該病的主要治療方法[1]。然而，抗生素的普遍使用和濫用極易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[2]。我國(guó)多個(gè)地區(qū)如四川[3]、河北[4-5]、浙江[6]等地對(duì)動(dòng)物源大腸埃希菌耐藥情況進(jìn)行過(guò)報(bào)道，發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌耐藥性日益嚴(yán)重；歐美[7-8]等國(guó)家相關(guān)報(bào)道也證實(shí)大腸埃希菌耐藥率在逐漸上升，耐藥性的產(chǎn)生直接影響疾病的治療與控制。

沈陽(yáng)新民某農(nóng)戶飼養(yǎng)的100日齡的豬突然發(fā)病，呈群體發(fā)病趨勢(shì)。主要表現(xiàn)為皮膚表面點(diǎn)狀出血，食欲減退，精神沉郁，口吐白沫，體溫升高，初期病豬四肢無(wú)力，行走不穩(wěn)，發(fā)出呻吟聲或嘶啞聲，肌肉震顫，眼瞼、臉部和頭部發(fā)生水腫。剖檢發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)水腫出血，胸腔積液，肺充血、出血、水腫，肺間質(zhì)增寬，心水腫、充血，脾出血，有壞死點(diǎn)，腎出血，腎乳頭壞死并形成包膜，回盲瓣出血、腫脹、壞死，腸淋巴結(jié)充血。該批豬疫苗免疫情況如下：10日齡接種過(guò)偽狂犬病活疫苗，生產(chǎn)廠家為大北農(nóng)南京天邦生物科技有限公司；1月齡接種過(guò)豬瘟細(xì)胞苗，生產(chǎn)廠家為遼寧益康生物股份有限公司。

從病豬的臨床診斷、病理剖檢方面初步診斷為豬水腫病。為了進(jìn)一步確診該病進(jìn)行了細(xì)菌病原分離鑒定，并對(duì)分離到的病原菌進(jìn)行了耐藥性監(jiān)測(cè)。同時(shí)為排除是否有其他疾病感染，進(jìn)行了豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome viruse,PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine cicrovirus type 2,PCV-2)、豬偽狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)的檢測(cè)，旨在有效控制豬群疾病發(fā)生，降低經(jīng)濟(jì)損失，為科學(xué)防治該病提供可靠依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病料采集采集具有明顯臨床癥狀患病豬的心、肝、脾、肺等組織臟器共5份。

1.1.2培養(yǎng)基和試劑營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：20130805)、麥康凱培養(yǎng)基(批號(hào)：20130701)、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)：20110406)，北京奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片(批號(hào)：140506)、水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(MH)(批號(hào)：140509)、微量生化鑒定管、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended spectrum beta-Lactamases，ESBLs)(批號(hào)：141028)檢測(cè)試劑盒雙紙片試條，杭州市天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌體抗原(O抗原)血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；Trizol和DNAzol核酸提取試劑盒，Invitrogen公司產(chǎn)品；CSFV(批號(hào)：20140901)、PRRSV(批號(hào)：20150601)、PCV-2(批號(hào)：20150301)和PRV(批號(hào)：20141201)檢測(cè)試劑盒，北京生科尚儀科技有限公司產(chǎn)品；其他為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑。

1.2方法

1.2.14種病毒病原的檢測(cè)

1.2.1.1病料的處理將病料用石英砂研磨后加入5 mL生理鹽水，4 ℃、3 000 r/min離心5 min后取上清液備用。

1.2.1.2病毒核酸的提取病毒核酸的提取方法按照Trizol和DNAzol核酸提取試劑盒試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.1.3CSFV、PRRSV病原檢測(cè)采用熒光RT-PCR方法，反應(yīng)體系為25 μL，RT-PCR反應(yīng)液15 μL，RNA模板10 μL，Taq酶0.25 μL，1/4顆RT-PCR酶顆粒。反應(yīng)條件為：42 ℃ 30 min；92℃ 3 min，92℃ 10 min，45℃ 30 min，72℃ 60 min，92℃ 10 min，60℃ 30 min(收集熒光)。

1.2.1.4PCV-2和PRV病原檢測(cè)采用熒光PCR方法，反應(yīng)體系為25 μL，PCR反應(yīng)液23 μL，DNA模板2 μL，Taq酶0.25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 5，60 ℃ 30s(收集熒光)，40個(gè)循環(huán)。

1.2.2細(xì)菌分離與純培養(yǎng)無(wú)菌操作取病豬心血、淋巴結(jié)、肝、脾等組織分別接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況和菌落特征，在麥康凱培養(yǎng)基上挑取粉紅色、中等大小、光滑的菌落進(jìn)行涂片、革蘭染色和鏡檢；在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板挑取白色、中等大小菌落進(jìn)行涂片、染色、革蘭染色鏡檢。革蘭染色、形態(tài)、大小及菌落培養(yǎng)特性等均符合文獻(xiàn)[9]中大腸埃希菌菌株的特征描述，初步確定為大腸埃希菌，并用普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基純化，以便完成細(xì)菌生化試驗(yàn)鑒定和細(xì)菌藥物敏感性試驗(yàn)。

1.2.3細(xì)菌生化試驗(yàn)采用微量生化反應(yīng)管法，用接種針挑取待檢菌接種于微量生化鑒定管中，按廠家腸埃希菌科細(xì)菌微量生化鑒定管要求進(jìn)行生化鑒定。

1.2.4血清型鑒定采用凝集試驗(yàn)方法進(jìn)行菌體抗原的鑒定。按照中國(guó)獸藥監(jiān)察所提供的產(chǎn)品使用說(shuō)明書進(jìn)行操作。細(xì)菌分離株先采用平板凝集試驗(yàn)確定可能的O抗原血清型，再通過(guò)試管凝集試驗(yàn)確定其O抗原血清型。定型標(biāo)準(zhǔn)為測(cè)試血清的試管凝集價(jià)達(dá)到原血清效價(jià)1/2以上，陰性對(duì)照為無(wú)菌生理鹽水。

1.2.5藥敏試驗(yàn)

1.2.5.1采用常規(guī)藥敏紙片法病原菌純培養(yǎng)18 h～24 h后，挑取純培養(yǎng)菌落置于無(wú)菌生理鹽水中，制成相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，用滅菌棉簽蘸取適量均勻涂抹到MH瓊脂培養(yǎng)基表面，反復(fù)幾次，每次將平板旋轉(zhuǎn)60 ℃，最后沿平皿周邊繞兩圈，貼好紙片后在35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h～18 h后測(cè)量藥敏試紙?jiān)谄桨逯挟a(chǎn)生的抑菌環(huán)直徑，檢測(cè)結(jié)果根據(jù)NCCLS標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，按敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)形成報(bào)告。

1.2.5.2超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended spectrum beta-lactamases,ESBLs)篩選和確證試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法，篩選試驗(yàn)選用頭孢曲松(30 μg)和頭孢噻肟(30 μg)2種藥敏紙片。確證試驗(yàn)用ESBLs檢測(cè)試劑盒雙紙片試條進(jìn)行。若頭孢曲松抑菌環(huán)直徑≤25 mm、頭孢噻肟抑菌環(huán)直徑≤27 mm，則提示試驗(yàn)菌株可能產(chǎn)生ESBLs，需進(jìn)一步作表型確證試驗(yàn)來(lái)加以確定；若確證試驗(yàn)時(shí)含棒酸紙片的抑菌環(huán)直徑大于不加棒酸紙片的抑菌環(huán)5 mm以上，則判定產(chǎn)生ESBLs 。

2　結(jié)果

2.14種病毒病原的檢測(cè)結(jié)果

對(duì)CSFV、PRRSV和PCV-2、PRV分別進(jìn)行熒光RT-PCR和熒光PCR擴(kuò)增后，結(jié)果均為陰性。

2.2細(xì)菌學(xué)分離與培養(yǎng)結(jié)果

通過(guò)18 h～24 h培養(yǎng)后，5份樣本中有3份在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上形成灰白色、圓形、半透明、表面稍隆起、光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊的菌落；在麥康凱培養(yǎng)基上形成粉紅色、圓形隆起、光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊的菌落；將以上培養(yǎng)物進(jìn)行常規(guī)涂片、革蘭染色后鏡檢，在顯微鏡下見到革蘭陰性中等大小、兩端鈍圓的直桿菌，根據(jù)培養(yǎng)特征與鏡檢結(jié)果初步判定分離到的3株菌株為大腸埃希菌。

2.3細(xì)菌的生化鑒定結(jié)果

將疑似大腸埃希菌的菌株進(jìn)行生化試驗(yàn)，該菌能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇5種糖類，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，吲哚、甲基紅試驗(yàn)均為陽(yáng)性，VP試驗(yàn)、枸櫞酸鹽試驗(yàn)、H2S試驗(yàn)均為陰性。通過(guò)生化試驗(yàn)最終判定為大腸埃希菌。

2.4血清型鑒定結(jié)果

通過(guò)血清平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)，最終鑒定出兩種大腸埃希菌O血清型，分別為O65和O68。

2.5藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1藥敏紙片法檢測(cè)結(jié)果通過(guò)藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3株大腸埃希菌的藥敏結(jié)果一致。由表1可知，菌株對(duì)恩諾沙星、氟苯尼考、萘啶酸、克拉霉素、氯霉素、甲氧芐啶、磷霉素、阿莫西林、氨芐青霉素、青霉素G、羧芐青霉素、苯唑青霉素、氧哌嗪青霉素、先鋒V、先鋒Ⅵ、頭孢曲松、頭孢噻肟、潔霉素耐藥；對(duì)氟哌酸、鏈霉素、妥布霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、慶大霉素、美滿霉素、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明較敏感。

表1　分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)。

Note :Susceptible(S)，intermediate(I)，resistant(R).

2.5.2ESBLs篩選和確證試驗(yàn)結(jié)果3株大腸埃希菌在ESBLs篩選試驗(yàn)中頭孢曲松、頭孢噻肟的抑菌環(huán)直徑分別均為20 mm和23 mm。在ESBLs確證試驗(yàn)中含棒酸的頭孢噻肟紙片抑菌環(huán)直徑與不含棒酸的抑菌環(huán)直徑之差均大于5 mm，判定為本次分離到菌株均可產(chǎn)生ESBLs。

3　討論

豬水腫病的發(fā)生，受諸多因素影響，例如季節(jié)氣候影響、飼養(yǎng)管理不當(dāng)、環(huán)境衛(wèi)生管理不到位等等。發(fā)病初期常呈現(xiàn)無(wú)任何癥狀就突然死亡現(xiàn)象，所以要早發(fā)現(xiàn)、早治療，在做好飼養(yǎng)管理、環(huán)境衛(wèi)生管理的同時(shí)做好疫苗預(yù)防。由于致豬水腫病的大腸埃希菌血清型較多，豬場(chǎng)單純地使用一種菌苗并不能充分達(dá)到預(yù)防目的。因此，有針對(duì)性地對(duì)自家豬場(chǎng)的致病性大腸埃希菌的種類進(jìn)行病原分離和鑒定或到專業(yè)的鑒定機(jī)構(gòu)去鑒定，選擇有效的疫苗或自制疫苗才能更好的對(duì)該病進(jìn)行科學(xué)有效地防控[10]。

根據(jù)國(guó)內(nèi)各地區(qū)豬源致病性大腸埃希菌血清型的相關(guān)報(bào)道，不同地區(qū)、同一地區(qū)不同豬場(chǎng)流行的血清型都存在較大差別，本試驗(yàn)得出的優(yōu)勢(shì)血清型與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)的報(bào)道不同，不難看出血清型的分布存在地域差。同時(shí)本豬群分離株為交叉凝集血清型，增加了本豬群大腸桿菌病的防控難度。豬大腸埃希菌的血清型繁多，而各血清型之間交叉保護(hù)率較低，同一豬場(chǎng)又可能同時(shí)存在多種血清型，因此了解清楚該豬場(chǎng)或該區(qū)域的優(yōu)勢(shì)血清型對(duì)于疾病的區(qū)域性防治具有重要意義。

本豬群分離到的大腸埃希菌對(duì)喹諾酮、大環(huán)內(nèi)酯類、青霉素類、氨曲南類耐藥，對(duì)氨基糖苷類、磺胺類較敏感。因此，建議在治療時(shí)選擇卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素等敏感性較高的藥物，同時(shí)采取了改善飼養(yǎng)環(huán)境，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理等措施。通過(guò)對(duì)發(fā)病豬連續(xù)3天的綜合治療，癥狀明顯好轉(zhuǎn)。因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中有必要定期進(jìn)行耐藥性監(jiān)測(cè)，在選擇敏感藥物進(jìn)行治療的同時(shí)還要改善飼養(yǎng)環(huán)境，并通過(guò)添加微量元素、維生素等增加機(jī)體的免疫力，適當(dāng)采取對(duì)癥治療措施。

1980年產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株在世界范圍開始蔓延[11]，大腸埃希菌之所以對(duì)大多數(shù)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，其根本原因就在于其所產(chǎn)生的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)[12]。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)能夠造成耐藥基因在細(xì)菌間擴(kuò)散，從而改變細(xì)菌的耐藥性，產(chǎn)生ESBLs菌株的耐藥譜廣，通常表現(xiàn)多重耐藥，是臨床常見的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌主要耐藥機(jī)制[13]。劉雅妮等[14]、劉保光等[15]等報(bào)道，與非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌相比，產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌無(wú)論是對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥還是對(duì)非β-內(nèi)酰胺類抗菌藥耐藥率均高于非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌。本試驗(yàn)中共選出30種抗菌藥，其中對(duì)18種抗菌藥都產(chǎn)生耐藥性，耐藥率為60.0%，更是印證了這一說(shuō)法。為了能盡快控制大腸埃希菌感染特別是耐藥性大腸埃希菌感染，各地在定期檢測(cè)產(chǎn)ESBLs情況的同時(shí)要減少使用或是交替使用抗生素，延緩耐藥菌株的產(chǎn)生。

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Isolation,Identification and Drug Sensitive Test of Pathogen from Swine Edema Disease

LIANG Qiao1,2,ZHAO Feng-ju1,2,YU Xue-wu1,2,LI Jing-chun1,2,ZHAO Xiao-tong1,2

(1.Liaoning Center for Animal Disease Control and Prevention,Liaoning, Shenyang, 110164, China;2.AnimalMedicineResearchInstituteofLiaoningProvince,Liaoning,Shenyang,110164,China)

In order to find out the causes of swine herd,the clinical autopsy and laboratory testing were performed.The other pathogenic infections such as CSFV,PRRSV,PCV-2 and PRV were excluded by real-time PCR method.Then pathogen isolation,identification and drug sensitivity tests were performed.The results indicated that the training characteristics and biochemical characteristics of isolated bacteria identified withE.coli.Cell antigen of the isolated bacteria were O65 and O68.The drug sensitivity tests showed that the isolated strains were multi drug resistant.And they were resistant to quinolone,macrocyclic lactones,penicillins,aztreonam class. But they were sensitive to aminoglycosides,sulfonamides,and they could produce extended spectrum beta-lactamases(ESBLs).

Swine edema disease;Escherichiacoli; isolation and identification; antibiotics resistant; extended spectrum beta-lactamases

2016-01-05

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(201402573)；遼寧省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(2015202013)

梁?jiǎn)?1991-)，女，遼寧莊河人，助理獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物疫病的檢測(cè)和防控工作。*通訊作者

S858.28；S852.612

B

1007-5038(2016)08-0120-04