miRNAs對熱應(yīng)激畜禽調(diào)控的分子機(jī)制

郭　江　高勝濤　權(quán)素玉　南雪梅　卜登攀，4?（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙410128；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，北京100193；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院與世界農(nóng)用林業(yè)中心農(nóng)用林業(yè)與可持續(xù)畜牧業(yè)聯(lián)合實驗室，北京100193；4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，哈爾濱150030）

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miRNAs對熱應(yīng)激畜禽調(diào)控的分子機(jī)制

郭江1，2，3高勝濤2，3權(quán)素玉2，3南雪梅2，3卜登攀1，2，3，4?
（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙410128；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，北京100193；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院與世界農(nóng)用林業(yè)中心農(nóng)用林業(yè)與可持續(xù)畜牧業(yè)聯(lián)合實驗室，北京100193；4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，哈爾濱150030）

摘要:熱應(yīng)激改變動物行為和生理機(jī)能，miRNAs作為22個核苷酸左右的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平通過抑制靶基因參與機(jī)體的熱應(yīng)激調(diào)控。本文就miRNAs對熱應(yīng)激細(xì)胞生長、凋亡以及對熱應(yīng)激畜禽免疫、抗應(yīng)激、器官損傷、生長性能和繁殖性能等方面所起作用及其機(jī)制進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞:miRNAs；熱應(yīng)激；畜禽；調(diào)控

隨著全球氣候變暖，熱應(yīng)激對畜牧業(yè)的影響越來越嚴(yán)重。而我國幅員遼闊，每年夏季大片區(qū)域受熱應(yīng)激影響，導(dǎo)致畜禽代謝紊亂、生產(chǎn)性能和繁殖性能降低，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［1-2］。熱應(yīng)激反應(yīng)是動物機(jī)體一種自我保護(hù)機(jī)制，相關(guān)基因和蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生改變。而miRNAs作為一種轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控因子，在哺乳動物基因的轉(zhuǎn)錄水平中只有1%～5%被編碼，卻調(diào)控超過60%的基因［3-5］。越來越多研究結(jié)果表明，miRNAs在畜禽抵御熱應(yīng)激方面發(fā)揮重要作用，如調(diào)控?zé)嵝菘说鞍祝℉SP）、氧化還原基因、免疫基因、細(xì)胞凋亡基因和相關(guān)代謝基因等［6-7］。本文旨在對近些年熱應(yīng)激條件下相關(guān)miRNAs的研究進(jìn)行綜述，以期為畜禽熱應(yīng)激研究提供幫助。

1　miRNAs形成的分子機(jī)制

miRNAs作為一種轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的非編碼RNA，對動物機(jī)體調(diào)控起到重要作用［8］。通過線蟲胚胎發(fā)育時間控制缺陷型遺傳篩選試驗發(fā)現(xiàn)最早miRNAs家族成員lin-4［9-10］，從此miRNAs受到廣泛關(guān)注。成熟miRNAs形成過程包含以下幾個步驟：miRNAs基因轉(zhuǎn)錄后形成長鏈的原miRNA （pri-miRNA），pri-miRNA經(jīng)Doarsha酶切，形成前體miRNA（pre-miRNA），由Exportin-5蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，經(jīng)Dicer酶切而形成成熟miRNAs［11］。miRNAs通過復(fù)合物RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）調(diào)控基因的表達(dá)：mRNA剪切和翻譯抑制［12-13］。在這個過程中，miRNAs可能有多個靶基因，靶基因也可能受多個miRNAs調(diào)控［14］。

2　miRNAs對熱應(yīng)激畜禽調(diào)控的分子機(jī)制

2.1對熱應(yīng)激細(xì)胞生長和凋亡的調(diào)控

細(xì)胞暴露在高溫環(huán)境會受到損傷，細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA和蛋白質(zhì)被抑制［15］。體外培養(yǎng)的細(xì)胞在熱應(yīng)激條件下生長停滯，并誘發(fā)其凋亡［16］。熱應(yīng)激誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞，先是熱應(yīng)答、DNA修復(fù)和蛋白質(zhì)修復(fù)有關(guān)基因上調(diào)，之后凋亡相關(guān)基因上調(diào)［17］。miRNAs作為單鏈非編碼小分子，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡［8］。miR-17-5p作用于自噬相關(guān)基因（ULK1），抑制細(xì)胞自噬的發(fā)生［18］。miR-71直接作用于pdk-1和cdc-25.1，影響DNA損傷修復(fù)信號通路［19］。Wilmink等［20］觀察高溫誘導(dǎo)表皮成纖維細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)時發(fā)現(xiàn)，有83個miRNAs表達(dá)量下調(diào)和40個miRNAs表達(dá)量上調(diào)，靶基因分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的miR-138、miR-196a 與HSP家族HSPA4L和HSPH1有關(guān)；熱應(yīng)激條件下有3類miRNAs進(jìn)行調(diào)控，在大部分應(yīng)激表達(dá)miRNAs，如miR125b、miR-222、miR-22和let-7c；只在高溫誘導(dǎo)下表達(dá)miRNAs，如miR-452、miR-382和miR-378；和在應(yīng)激條件下表達(dá)下調(diào)的miRNAs。高溫抑制miRNA-24的表達(dá)，降低奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡發(fā)生率，促進(jìn)細(xì)胞的生長發(fā)育［21］。熱應(yīng)激刺激CYP2e基因生產(chǎn)大量活性氧自由基［22］，造成細(xì)胞內(nèi)限速酶肌肉磷酸果糖激酶（PFKm）表達(dá)量上升，糖酵解加快，乳酸濃度升高；長期應(yīng)激會使乳酸在細(xì)胞內(nèi)堆積，導(dǎo)致微環(huán)境的酸中毒，使細(xì)胞凋亡。而miR-320a靶向調(diào)控PFKm，抑制糖酵解［23］。

熱應(yīng)激能影響細(xì)胞內(nèi)HSP表達(dá)，進(jìn)行急性穩(wěn)態(tài)反應(yīng)，如HSP和相關(guān)基因表達(dá)改變［15］。有研究發(fā)現(xiàn)HSP70和HSP90與Ago2（RISC重要組成部分，對miRNAs修飾作用）有關(guān)，可能HSP還參與miRNA的基因沉默［24］。但Fukuoka等［25］發(fā)現(xiàn)miRNAs的表達(dá)水平不變情況下，熱應(yīng)激能使基因沉默活性加強(qiáng)；HSP90對miRNAs基因沉默沒有作用，HSP1也不參與miRNAs介導(dǎo)的基因沉默；認(rèn)為內(nèi)源miRNAs基因沉默在抑制熱變性蛋白可能只起輔助的作用。

2.2對熱應(yīng)激畜禽免疫和抗應(yīng)激的調(diào)控

熱應(yīng)激反應(yīng)是機(jī)體通過啟動自身防御體系，以避免機(jī)體損傷的一種非特異性防御反應(yīng)，但強(qiáng)度過大、時間過長，機(jī)體出現(xiàn)病理、器官衰竭甚至死亡［26］。研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激促使泛素-蛋白酶體通路表達(dá)上調(diào)，清除嚴(yán)重受損蛋白質(zhì)［27］；機(jī)體下丘腦-垂體-腎上腺素軸活性加強(qiáng)，加強(qiáng)機(jī)體抗應(yīng)激能力。Zheng等［28］研究熱應(yīng)激奶牛血液中miRNAs表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，有7個miRNAs涉及應(yīng)激和免疫有關(guān)；其中表達(dá)上調(diào)miR-19a和miR-19b通過對靶基因HSP家族調(diào)控，參與熱應(yīng)激調(diào)節(jié)。在急性應(yīng)激下大鼠循環(huán)血中HSP72濃度上調(diào)和miR-142-5P、miR-203下調(diào)［29］。miR-142-5P通過調(diào)控白細(xì)胞介素（IL）- 6受體進(jìn)行免疫反應(yīng)；miR-203能抑制細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制蛋白-3（SOCS3），進(jìn)而調(diào)控促炎癥的細(xì)胞因子［30］。蔡明成等［31］研究熱應(yīng)激對紅安格斯母牛外周血miRNAs的影響發(fā)現(xiàn)有118個miRNAs表達(dá)上調(diào)，197個miRNAs表達(dá)下調(diào)；將表達(dá)量顯著上調(diào)和下調(diào)的10個miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miRNAs表達(dá)上調(diào)的靶基因主要參與細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)節(jié)，miRNAs表達(dá)下調(diào)的靶基因主要參與機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)。其中，miR-98靶向調(diào)控IL-6基因的表達(dá)［32］，miR-31靶向調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子kappa B （NF-κB）誘導(dǎo)激酶（NIK）的表達(dá)，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)［33］。以上研究表明，在熱應(yīng)激條件下畜禽可通過miRNAs調(diào)控靶基因表達(dá)，參與機(jī)體免疫和抗應(yīng)激反應(yīng)。

2.3對熱應(yīng)激畜禽器官損傷的調(diào)控

2.3.1腸道

熱應(yīng)激畜禽腸道缺血缺氧，造成腸道黏膜損傷［22］。miRNAs在此過程發(fā)揮重要作用。McKenna等［34］對小鼠空腸組織黏膜層采用高通量測序，檢測到1 094個成熟miRNAs，其中有65個是小腸黏膜特異性表達(dá)的miRNAs；當(dāng)Dicer1酶（miRNAs合成酶）基因缺失，小鼠腸上皮組織紊亂，腸屏障功能受損，發(fā)生炎癥反應(yīng)。Yu等［7］研究熱應(yīng)激引起大鼠小腸損傷發(fā)現(xiàn)，有18個miRNAs（含miR-34a、miR-34b、miR-140、miR-375、miR-500）的表達(dá)量上調(diào)和11個miRNAs（含miR-31）的表達(dá)量下調(diào)。miR-500能靶向已糖激酶2（hexokinase 2，HK2）mRNA的3′UTR區(qū)域，通過降低HK2的活性，抑制小腸葡萄糖的吸收［35］。miR-375作用于IL-13，調(diào)控T細(xì)胞2中促上皮細(xì)胞因子胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP）的表達(dá)，使抵抗素樣分子家族β（RELMβ）表達(dá)降低，使腸道黏膜免疫力缺失［36］。miR-34a、miR-34b可靶向作用于凋亡基因（p53），調(diào)控DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡［37］。miR-140調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥反應(yīng)［38］。miR-31在炎癥反應(yīng)時表達(dá)量下調(diào)，與細(xì)胞生長、死亡和細(xì)胞通信的相關(guān)基因有關(guān)［39］。

熱應(yīng)激能導(dǎo)致腸道脂多糖（LPS）顯著上升和腸黏膜屏障受損，LPS進(jìn)入肝臟卻無法全部被消除，進(jìn)而進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，進(jìn)行全身炎癥反應(yīng)［40-41］。LPS會通過NF-κB信號通路激活腫瘤壞死因子-α （TNF-α）和IL-6，通過SOCS3導(dǎo)致肝臟胰島素耐受和產(chǎn)生高胰島素血癥，胰島素信號通路與炎癥因子的信號傳導(dǎo)存在交叉作用［42-43］。當(dāng)LPS刺激時，IL-6分泌和miR-181b表達(dá)呈負(fù)相關(guān)［44］。腸道黏膜的miR-146a表達(dá)量上調(diào)，通過抑制Toll樣受體（TLR）信號通路中IL-1受體相關(guān)激酶1 （IRAK1），保護(hù)腸道免受損傷［45］。miR-140作為細(xì)胞因子信號抑制蛋白3（SOCS3）的作用靶標(biāo)，調(diào)控LPS引起炎癥反應(yīng)［46］?？傊跓釕?yīng)激條件下腸道產(chǎn)生大量的LPS，通過TLR和NF-κB信號通路刺激促炎癥因子的釋放，引起炎癥反應(yīng)；而miRNAs通過調(diào)控TLR和NF-κB信號通路上相關(guān)基因，保護(hù)腸道健康。

2.3.2肝臟

熱應(yīng)激容易導(dǎo)致肝臟氧化損傷。而肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）能清除氧自由基，減小熱應(yīng)激對肝臟氧化損傷［47］。miR-214靶向作用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（MGST1），調(diào)節(jié)抗氧化能力［47］。另外，肝細(xì)胞中線粒體是呼吸鏈氧自由基的主要產(chǎn)生部位，miR-93和miR-214靶向調(diào)控肝臟細(xì)胞色素c復(fù)合物（UQCRC1），起保護(hù)肝功能的作用［48-49］。

2.4對熱應(yīng)激畜禽生產(chǎn)性能的調(diào)控

在熱應(yīng)激條件下，畜禽增加排汗、加快心跳和呼吸頻率來維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)，但影響畜禽的生產(chǎn)性能［50］。如熱應(yīng)激奶牛采食量下降，營養(yǎng)物質(zhì)攝入量不足，引起奶牛能量負(fù)平衡，導(dǎo)致產(chǎn)奶量降低［51］。Baumgard等［51］報道熱應(yīng)激奶牛出現(xiàn)能量負(fù)平衡，將葡萄糖優(yōu)先在組織中進(jìn)行代謝利用而非泌乳。miR-143通過抑制胰島素及下游因子蛋白激酶B（AKT）的活性，調(diào)控葡萄糖的穩(wěn)態(tài)［53］。Fatima等［54］采用基因芯片技術(shù)檢測能量負(fù)平衡狀態(tài)奶牛肝臟miRNAs表達(dá)時發(fā)現(xiàn)，有miR-17-5p、miR-31、miR-140、miR-1281和miR-2885這5個miRNAs表達(dá)上調(diào)，其中miR-31的靶基因肝細(xì)胞核因子3-γ（HNF3-γ）和轉(zhuǎn)錄因子（TF）涉及胰島素樣生長因子-1（IGF-1）表達(dá)調(diào)控，與葡萄糖代謝的穩(wěn)態(tài)有關(guān)。營養(yǎng)缺乏時，miR-80表達(dá)量下調(diào)，直接靶向CRBE-1和調(diào)控胰島素信號通路調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝［55］。由此可見，熱應(yīng)激畜禽可通過miRNAs作用調(diào)控機(jī)體能量代謝，進(jìn)而影響采食量。

熱應(yīng)激影響畜禽產(chǎn)品的質(zhì)量。熱應(yīng)激降低牛奶中乳蛋白和酪蛋白濃度，產(chǎn)生“熱應(yīng)激乳蛋白降低征”［56-58］。張凡建等［59］發(fā)現(xiàn)不同熱應(yīng)激程度對牛奶品質(zhì)的影響也不同；中度熱應(yīng)激奶牛乳蛋白率極顯著低于輕度熱應(yīng)激，而重度熱應(yīng)激奶牛乳脂率顯著低于輕度熱應(yīng)激。miR-199a-3p能通過調(diào)控AKT/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路來調(diào)控蛋白的合成［60］。miR-15a靶向作用于生長激素受體，能抑制乳腺上皮細(xì)胞增殖和酪蛋白的分泌［61］。miR-200a靶向作用于乳脂合成關(guān)鍵基因信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白4（STAT4），調(diào)控乳脂合成［62］。miR-142-3P靶向作用于催乳素受體，可調(diào)控乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白和甘油三酯的分泌［63］。熱應(yīng)激降低畜禽骨骼肌中脂肪含量，提高腹部脂肪含量，引起肌肉組織中不飽和脂肪酸氧化，產(chǎn)生異味，降低肉品質(zhì)［64］。miR-130能靶向調(diào)控過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ），調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化和脂肪沉積［65］。miR-27b通過靶向作用于脂蛋白脂肪酶（LPL）基因和調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、Wnt等信號通路抑制肉牛肌內(nèi)脂肪的沉積［66］。

2.5對熱應(yīng)激家畜繁殖性能的調(diào)控

熱應(yīng)激影響畜禽精子活力，降低受胎率，導(dǎo)致胚胎早亡和增加流產(chǎn)率［67］。Ji等［68］研究高溫和氧化應(yīng)激能降低精子的miR-15表達(dá)量，并通過靶向結(jié)合HSPA1B的3′UTR區(qū)域，減小應(yīng)激對精子產(chǎn)生的損傷。研究發(fā)現(xiàn)miRNAs對機(jī)體繁殖發(fā)育起到重要作用，從單細(xì)胞分裂增殖形成4-細(xì)胞期時，miRNAs經(jīng)歷先減少后增加的過程；其中miR-290家簇上調(diào)15倍，通過抑制靶基因Dickkopf相關(guān)蛋白1（Dkk-1）激活Wnt信號通路，為機(jī)體的胚胎形成、發(fā)育和干細(xì)胞分化發(fā)揮重要作用［69-70］。Nehammer等［71］研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激影響產(chǎn)蛋率；與野生型相比，miR-80突變型秀麗隱桿線蟲的產(chǎn)蛋率28℃時顯著降低，而miR-71、miR-80和miR-239突變型秀麗隱桿線蟲在30℃時幾乎不產(chǎn)蛋；并認(rèn)為在高溫下，miRNAs基因缺失型秀麗隱桿線蟲減少產(chǎn)蛋原因可能是特性miRNAs損傷可以使性腺變得敏感或者缺失特異性miRNAs的胚胎在高溫下無法生存。上述研究證實，畜禽可通過miRNAs作用緩解熱應(yīng)激對繁殖性能的損害。

3　小　結(jié)

miRNAs作為一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，在熱應(yīng)激條件miRNAs在細(xì)胞生長、凋亡，機(jī)體免疫和抗應(yīng)激反應(yīng)、生長性能和繁殖性能等多方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用。因此，探討miRNAs在熱應(yīng)激條件下對機(jī)體調(diào)控作用，差異表達(dá)miRNAs、miRNAs家族的協(xié)調(diào)作用及其靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)或信號通路，有助于利用熱應(yīng)激分子特征研究，緩解熱應(yīng)激對機(jī)體造成損傷。

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（責(zé)任編輯武海龍）

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Anti-Heatstress Mechanism of miRNAs in Livestock and Poultry

GUO Jiang1，2，3GAO Shengtao2，3QUAN Suyu2，3NAN Xuemei2，3BU Dengpan1，2，3，4?
（1. College of Animal Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2. State Key Laboratory of Animal Nutrition，Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China；3. CAAS-ICRAF Joint Laboratory on Agroforestry and Sustainable Animal Husbandry，Beijing 100193，China；4. Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition，Harbin 150030，China）

Abstract：Animal behavior and physiological function were changed under heat stress. miRNAs contained approximately 22 nucleotides in length regulated target gene of heat-stressed animal at the post-transcriptional level. This article mainly reviewed the effects of differential miRNAs expression on growth and apoptosis of heat stress cell，and the regulation of miRNAs on immunity，anti-stress responses，organic damage，performance and fertility，etc，and their mechanisms.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2016，28（3）：652-658］

Key words：miRNAs；heat stress；livestock and poultry；regulation

Corresponding author?，professor，E-mail：budengpan@126.com

通信作者:?卜登攀，研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail：budengpan@126.com

作者簡介:郭 江（1986—），男，福建三明人，博士研究生，研究方向為動物生理學(xué)。E-mail：zhouhui163521@163.com

基金項目:國家自然科學(xué)基金（31372341）；十二五國家科技支撐計劃（2012BAD12B02-05）；動物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實驗室自主課題（2004DA125184G1103）

收稿日期:2015-10-13

doi：10.3969/ j.issn.1006-267x.2016.03.003

中圖分類號:S811.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:1006-267X（2016）03-0652-07