體細(xì)胞突變?cè)谌┕掏倭霭l(fā)病中的作用

鄭芳芳　朱理敏　高平進(jìn)

200025　上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院高血壓科,上海市高血壓研究所

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體細(xì)胞突變?cè)谌┕掏倭霭l(fā)病中的作用

鄭芳芳朱理敏高平進(jìn)

200025上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院高血壓科,上海市高血壓研究所

【摘要】原發(fā)性醛固酮增多癥是繼發(fā)性高血壓的常見病因，可導(dǎo)致嚴(yán)重的心腦血管病變，影響患者預(yù)后。KCNJ5、ATP1A1、ATP2B3和CACNA1D基因體細(xì)胞突變通過影響不同的離子穩(wěn)態(tài)，增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，從而刺激腎上腺皮質(zhì)球狀帶細(xì)胞分泌過多的醛固酮。該文主要介紹醛固酮腺瘤發(fā)病中上述基因體細(xì)胞突變的作用。

【關(guān)鍵詞】體細(xì)胞突變；原發(fā)性醛固酮增多癥；醛固酮腺瘤；離子通道

原發(fā)性醛固酮增多癥(PA)是一種常見的繼發(fā)性高血壓。由于腎上腺皮質(zhì)球狀帶(ZG)病變，分泌過多的醛固酮，導(dǎo)致水鈉潴留和排鉀增加。在首次確診的高血壓患者中，PA的發(fā)病率約為10%，而在難治性高血壓中可能占到20%。與原發(fā)性高血壓相比，PA患者發(fā)生糖脂代謝異常和心腦血管并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)更高[4-5]。絕大部分PA患者為散發(fā)型，主要病因是醛固酮瘤(APA)和雙側(cè)腎上腺增生[6-7]。1%~10%的PA患者為家族型醛固酮增多癥(FH)，分為FH-Ⅰ、FH-Ⅱ和FH-Ⅲ型。2011年，作為PA研究的一項(xiàng)突破性進(jìn)展，Choi等報(bào)道了KCNJ5基因(編碼內(nèi)向整流鉀通道Kir3.4)突變與APA和FH-Ⅲ的發(fā)病相關(guān),PA的分子生物學(xué)機(jī)制逐漸引起關(guān)注。

1基因突變的發(fā)生率

Choi等通過全基因組測(cè)序技術(shù)，首次證實(shí)了編碼內(nèi)向整流鉀通道Kir3.4的KCNJ5是APA的致病基因，在22例瑞典APA患者中，2例發(fā)生Gly151Arg突變,6例發(fā)生Leu168Arg突變。對(duì)來自英國(guó)和澳大利亞的73例散發(fā)型PA患者的研究發(fā)現(xiàn)，26.0%的患者存在Gly151Arg突變，13.7%存在Leu168Arg突變，另有1例少見突變位點(diǎn)delIle157。另一項(xiàng)納入了瑞典、德國(guó)、澳大利亞和法國(guó)348例PA患者的研究發(fā)現(xiàn)，Gly151Arg和Leu168Arg的突變率分別為24.1%和20.4%，另有2例患者出現(xiàn)少見突變Glu145Gln[10]。來自法國(guó)、德國(guó)和意大利的474例PA患者中，Gly151Arg和Leu168Arg突變率分別為23.8%和13.7%[11]?？偟膩碚f，APA患者的KCNJ5突變率約為40%[12-13]， Gly151Arg和Leu168Arg是突變熱點(diǎn)。

本研究組前期對(duì)168例中國(guó)APA患者的研究顯示，KCNJ5基因的體細(xì)胞突變率高達(dá)76.8%，其中Gly151Arg和Leu168Arg的突變率分別為39.9%和35.7%，另有Thr158Ala和Thr148-Thr149insArg突變各1例[14]。另一項(xiàng)研究報(bào)道,中國(guó)APA患者KCNJ5基因突變率為75.4%[15]，與本研究組的結(jié)果接近。另外，中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)和新疆APH患者KCNJ5基因的突變率略低，分別為59.5%和45.7%[16-17]。日本APA患者KCNJ5基因突變率為65.2%[18]。目前，亞洲APA患者的KCNJ5基因突變率普遍高于其他地區(qū)[13]。主要原因可能是種族差異，但仍需多中心研究進(jìn)一步明確。另一方面，不同中心的PA診斷和入選標(biāo)準(zhǔn)存在差異[12-13]。

對(duì)KCNJ5野生型合并低鉀血癥的男性PA患者的研究發(fā)現(xiàn)，P型三磷酸腺苷(ATP)酶家族成員ATP1A1基因[編碼鈉離子(Na+)/鉀離子(K+)-ATP酶α亞單位]和ATP2B3基因[編碼細(xì)胞膜鈣離子(Ca2+)-ATP酶]體細(xì)胞突變與APA相關(guān)。德國(guó)、法國(guó)和意大利的308例APA患者中，有16例(5.2%)ATP1A1突變樣本和5例(1.6%)ATP2B3突變樣本[19]。另有2項(xiàng)國(guó)外研究顯示，CACNA1D基因(編碼L-型電壓門控性鈣通道的α1亞單位Cav1.3)體細(xì)胞突變與APA的發(fā)病也存在關(guān)聯(lián)，其突變率分別為15.5%和7.8%[20-21]。

2基因突變與臨床表型

研究顯示，KCNJ5基因體細(xì)胞突變狀態(tài)與APA患者的臨床表型相關(guān)[9-11,14,18-19,22-23]。首先，與野生型患者相比，KCNJ5體細(xì)胞突變?cè)谂灾懈Ｒ?56.6%對(duì)33.3%，P=0.02)。其次，KCNJ5基因突變患者的腺瘤直徑更大(15 mm對(duì)11 mm，P=0.021)、尿醛固酮水平更高(23.3 μg/24 h對(duì)16.6 μg/24 h，P=0.038)、醛固酮(ng/dL)/腎素[ng/(mL·h)]比值更高(102 對(duì)42，P=0.007)，提示醛固酮過度分泌與突變的腺瘤可能存在關(guān)聯(lián)。同時(shí)，KCNJ5突變患者的血鉀水平更低(2.6 mmol/L對(duì)2.9 mmol/L，P=0.022)[14]。嚴(yán)重的低鉀血癥是PA患者的典型表現(xiàn)之一，因此KCNJ5突變患者更傾向于就診，從而接受PA的篩查。一項(xiàng)納入13項(xiàng)研究、約1 636例APA患者的薈萃分析也顯示，KCNJ5突變患者的血漿醛固酮水平更高、年齡更小、腺瘤更大，且突變多見于女性，亞洲人群長(zhǎng)期高鈉飲食可能促進(jìn)KCNJ5突變的發(fā)生[13]。但是，關(guān)于KCNJ5基因突變的研究中，仍缺乏APA患者飲食習(xí)慣的數(shù)據(jù)。另外，KCNJ5突變與手術(shù)預(yù)后的關(guān)系仍不明確[24-25]，需要長(zhǎng)期隨訪研究,進(jìn)一步明確。

與KCNJ5突變型和野生型相比，ATP1A1和ATP2B3突變的APA患者多見于男性，且血漿醛固酮水平更高，低鉀血癥更嚴(yán)重[19]。而CACNA1D突變的腺瘤直徑(9 mm)顯著小于KCNJ5突變型(16 mm)和野生型(12 mm)[11]。因此，CACNA1D突變患者易被忽視，可能影響了APA患者中CACNA1D基因突變的檢出率。

3功能學(xué)研究

生理狀態(tài)下，醛固酮由ZG細(xì)胞分泌。以膽固醇作為原料，在一系列特異性酶類的參與下進(jìn)行轉(zhuǎn)換，最終醛固酮合成酶(CYP11B2)催化皮質(zhì)酮轉(zhuǎn)變?yōu)槿┕掏?。高鉀血癥和血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)等因素可刺激醛固酮的產(chǎn)生。在背景內(nèi)向整流鉀通道TASK等因素的作用下，ZG細(xì)胞由靜息狀態(tài)下轉(zhuǎn)為超極化狀態(tài)。Ang Ⅱ與其Ⅰ型受體的結(jié)合，可阻斷這種漏電流及其它鉀通道，引起細(xì)胞膜去極化、電壓門控性鈣通道激活和Ca2+內(nèi)流。細(xì)胞外K+也可直接引起細(xì)胞膜去極化和Ca2+內(nèi)流。同時(shí)，Ca2+內(nèi)流可通過激活鈣/鈣調(diào)蛋白激酶信號(hào)通路等機(jī)制，引起醛固酮合成限速酶的表達(dá)[26]。另外，慢性Ca2+信號(hào)可刺激ZG細(xì)胞增殖。

KCNJ5既可單獨(dú)形成同源四聚體，又可與KCNJ3形成活性更強(qiáng)的異源四聚體[27]。Choi等將野生型(WT)或突變型KCNJ5和KCNJ3共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)KCNJ3/KCNJ5WT使細(xì)胞膜超極化，反轉(zhuǎn)電位為(-65±2) mV，且電流可被鋇離子(Ba2+)阻斷，K+與Na+通透比約為(25.3±4.4)∶1。相反，KCNJ3/KCNJ5Gly151Arg和KCNJ3/KCNJ5Leu168Arg均可使細(xì)胞膜去極化，反轉(zhuǎn)電位分別為(0±2)mV和(-5±1) mV，且電流不能被Ba2+阻斷，K+與Na+通透比下降至(1.0±0.1)∶1和(1.3±0.1)∶1。K+通道的GlyTyrGly序列構(gòu)成一個(gè)狹窄孔道，可特異性允許K+進(jìn)入細(xì)胞。Gly151是GlyTyrGly序列的第1個(gè)甘氨酸。Leu168位于第2個(gè)跨膜區(qū)域，側(cè)鏈毗鄰GlyTyrGly序列的酪氨酸側(cè)鏈。選擇性濾器附近的其他體細(xì)胞突變(delIle157[28]、insThr149[29]和Thr148-Thr149insArg[14])也表現(xiàn)出類似的電生理學(xué)特征，不過遠(yuǎn)離選擇性濾器的Trp126Arg突變可間接影響選擇性濾器附近的氨基酸和K+通道選擇性[30]。體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，KCNJ5基因體細(xì)胞突變可促進(jìn)CYP11B2基因mRNA表達(dá)上調(diào)[14,29-30]。總之，KCNJ5突變體可能引起K+通道的選擇性喪失，導(dǎo)致Na+內(nèi)流，細(xì)胞膜去極化，Ca2+通過電壓門控性鈣通道和Na+/Ca2+交換進(jìn)入細(xì)胞，醛固酮合成增加[8,29]。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，G蛋白偶聯(lián)鉀通道阻斷劑tertiapin-Q可阻斷野生型通道的大部分K+電流，而對(duì)于突變通道的電流阻斷效果明顯降低。KCNJ5突變體改變了孔道結(jié)構(gòu)形態(tài)，影響tertiapin-Q與離子通道的結(jié)合，這可能是引起Na+通透性異常的普遍機(jī)制[28]。L型鈣通道阻斷劑維拉帕米可抑制突變體部分Na+內(nèi)流，Na+/Ca2+交換體阻斷劑KB-R7943可完全阻斷Na+內(nèi)流[29]。這些藥物是否可抑制醛固酮的自主分泌仍需進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

目前，尚無體外實(shí)驗(yàn)研究支持KCNJ5突變可引起細(xì)胞增殖，并且細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載通常引起細(xì)胞凋亡。一項(xiàng)關(guān)于視錐蛋白樣蛋白1(VSNL1)的研究可能有助于解釋為何KCNJ5基因突變患者的腺瘤直徑更大。VSNL1是一種神經(jīng)元鈣感受器蛋白，參與鈣信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。與野生型腺瘤比較，KCNJ5突變型腺瘤的VSNL1表達(dá)增加，可能抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+超負(fù)荷引起的細(xì)胞凋亡[31]。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)，大部分APA患者中Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常激活，Wnt抑制劑SFRP2可下調(diào)部分患者的Wnt信號(hào)，并且抑制APA的形成[32]。該信號(hào)通路在APA形成中的作用，及是否與KCNJ5突變存在關(guān)聯(lián)，仍需更深入的研究。

ATP1A1、ATP2B3和CACNA1D突變效應(yīng)與KCNJ5基因突變類似，影響醛固酮的產(chǎn)生。ATP1A1基因的Leu104位于跨膜α螺旋的M1區(qū)，Val332(可能影響Glu334定位)位于M4區(qū)，同時(shí)Glu334和Leu104的相互作用可能影響K+與Na+/K+-ATP酶的結(jié)合和門控[19,33-34]。ATP1A1突變可顯著降低ATP酶的活性，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度[19]。ATP2B3基因突變Leu425-Val426del和Val426-Val427del通過影響跨膜α螺旋M4的谷氨酸(對(duì)應(yīng)于ATP1A1基因的Glu334)，改變Ca2+結(jié)合位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)[19]。ATP酶突變能引起細(xì)胞膜顯著去極化，激活電壓門控性鈣通道[19]，促進(jìn)CYP11B2和NR4A2的表達(dá)[30]。另外，CACNA1D基因體細(xì)胞突變可引起細(xì)胞膜電位負(fù)值增加，抑制通道失活或增加Ca2+電流，從而激活細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)通路和刺激醛固酮產(chǎn)生[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，作為一種臨床常用的L型鈣通道阻滯劑，氨氯地平可能降低血漿醛固酮水平，影響部分PA患者的診斷[35]。這間接提示調(diào)控Ca2+穩(wěn)態(tài)的相關(guān)基因突變可能影響醛固酮的產(chǎn)生。

4結(jié)語(yǔ)

KCNJ5、ATP1A1、ATP2B3和CACNA1D基因體細(xì)胞突變通過影響不同的離子穩(wěn)態(tài)，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，從而刺激ZG細(xì)胞分泌過多的醛固酮[36]。Dekkers等[37]研究發(fā)現(xiàn)，ATP1A1和CACNA1D基因突變可同時(shí)發(fā)生于同一多結(jié)節(jié)腎上腺內(nèi)，不同結(jié)節(jié)也可發(fā)生KCNJ5基因的不同突變。推測(cè)這些突變的發(fā)生晚于腎上腺結(jié)節(jié)的形成，兩個(gè)過程并無直接因果關(guān)系。然而，APA患者的這些突變是何時(shí)發(fā)生以及如何發(fā)生的，仍需進(jìn)一步探索。目前關(guān)于APA體細(xì)胞突變的研究局限于已切除的腺瘤，探索無創(chuàng)性檢測(cè)手段以在術(shù)前確定突變狀態(tài)，將為APA的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]馬毓，高平進(jìn). 鹽皮質(zhì)激素及其受體在血壓調(diào)節(jié)中的作用. 國(guó)際心血管病雜志，2014，41(4)：252-255.

[2]Rossi GP，Bernini G，Caliumi C，et al. A prospective study of the prevalence of primary aldosteronism in 1,125 hypertensive patients. J Am Coll Cardiol，2006，48(11)：2293-2300.

[3]Calhoun DA，Nishizaka MK，Zaman MA，et al. Hyperaldosteronism among black and white subjects with resistant hypertension. Hypertension，2002，40(6)：892-896.

[4]瑪麗婭·木哈什，龔艷春，郭冀珍， 等. 原發(fā)性醛固酮增多癥與原發(fā)性高血壓的糖脂代謝比較. 國(guó)際心血管病雜志，2012，39(3)：178-181.

[5]Mulatero P，Monticone S，Bertello C，et al. Long-term cardio- and cerebrovascular events in patients with primary aldosteronism. J Clin Endocrinol Metab，2013，98(12)：4826-4833.

[6]Monticone S，Else T，Mulatero P，et al. Understanding primary aldosteronism：impact of next generation sequencing and expression profiling. Mol Cell Endocrinol，2015，399：311-320.

[7]Zennaro MC，Rickard AJ，Boulkroun S. Genetics of mineralocorticoid excess：an update for clinicians. Eur J Endocrinol，2013，169(1)：R15-R25.

[8]Choi M，Scholl UI，Yue P，et al. K+channel mutations in adrenal aldosterone-producing adenomas and hereditary hypertension. Science，2011，331(6018)：768-772.

[9]Azizan EA，Murthy M，Stowasser M，et al. Somatic mutations affecting the selectivity filter of KCNJ5 are frequent in 2 large unselected collections of adrenal aldosteronomas. Hypertension，2012，59(3)：587-591.

[10]?kerstr?m T，Crona J，Delgado Verdugo A，et al. Comprehensive re-sequencing of adrenal aldosterone producing lesions reveal three somatic mutations near the KCNJ5 potassium channel selectivity filter. PLoS One，2012，7(7)：e41926.

[11]Fernandes-Rosa FL，Williams TA，Riester A，et al. Genetic spectrum and clinical correlates of somatic mutations in aldosterone-producing adenoma. Hypertension，2014，64(2)：354-361.

[12]Mulatero P，Monticone S，Rainey WE，et al. Role of KCNJ5 in familial and sporadic primary aldosteronism. Nat Rev Endocrinol，2013，9(2)：104-112.

[13]Lenzini L，Rossitto G，Maiolino G，et al. A meta-analysis of somatic KCNJ5 K+channel mutations in 1636 patients with an aldosterone-producing adenoma. J Clin Endocrinol Metab，2015，100(8)：E1089-E1095.

[14]Zheng FF，Zhu LM，Nie AF，et al. Clinical characteristics of somatic mutations in Chinese patients with aldosterone-producing adenoma. Hypertension，2015，65(3)：622-628.

[15]Wang B，Li X，Zhang X，et al. Prevalence and characterization of somatic mutations in Chinese aldosterone-producing adenoma patients. Medicine (Baltimore)，2015，94(16)：e708.

[16]Wu VC，Huang KH，Peng KY，et al. Prevalence and clinical correlates of somatic mutation in aldosterone producing adenoma-Taiwanese population. Sci Rep，2015，5：11396.

[17]邵丹，李南方，胡燕榮，等. 醛固酮組織體細(xì)胞KCNJ5基因錯(cuò)義突變與原發(fā)性醛固酮增多癥的相關(guān)性研究. 中華內(nèi)分泌代謝雜志，2013，29(10)：862-866.

[18]Taguchi R，Yamada M，Nakajima Y，et al. Expression and mutations of KCNJ5 mRNA in Japanese patients with aldosterone-producing adenomas. J Clin Endocrinol Metab，2012，97(4)：1311-1319.

[19]Beuschlein F，Boulkroun S，Osswald A，et al. Somatic mutations in ATP1A1 and ATP2B3 lead to aldosterone-producing adenomas and secondary hypertension. Nat Genet，2013，45(4)：440-444，444e1-2.

[20]Azizan EA，Poulsen H，Tuluc P，et al. Somatic mutations in ATP1A1 and CACNA1D underlie a common subtype of adrenal hypertension. Nat Genet，2013，45(9)：1055-1060.

[21]Scholl UI，Goh G，St?lting G，et al. Somatic and germline CACNA1D calcium channel mutations in aldosterone-producing adenomas and primary aldosteronism. Nat Genet，2013，45(9)：1050-1054.

[22]Seccia TM，Mantero F，Letizia C，et al. Somatic mutations in the KCNJ5 gene raise the lateralization index：implications for the diagnosis of primary aldosteronism by adrenal vein sampling. J Clin Endocrinol Metab，2012，97(12)：E2307-E2313.

[23]Boulkroun S，Beuschlein F，Rossi GP，et al. Prevalence, clinical, and molecular correlates of KCNJ5 mutations in primary aldosteronism. Hypertension，2012，59(3)：592-598.

[24]Rossi GP，Cesari M，Letizia C，et al. KCNJ5 gene somatic mutations affect cardiac remodelling but do not preclude cure of high blood pressure and regression of left ventricular hypertrophy in primary aldosteronism. J Hypertens，2014，32(7)：1514-1521.

[25]Arnesen T，Glomnes N，Str?ms?y S，et al. Outcome after surgery for primary hyperaldosteronism may depend on KCNJ5 tumor mutation status: a population-based study from Western Norway. Langenbecks Arch Surg，2013，398(6)：869-874.

[26]Al-Salameh A，Cohen R，Desailloud R. Overview of the genetic determinants of primary aldosteronism. Appl Clin Genet，2014，7：67-79.

[27]Bettahi I，Marker CL，Roman MI，et al. Contribution of the Kir3.1 subunit to the muscarinic-gated atrial potassium channel IKACh. J Biol Chem，2002，277(50)：48282-48288.

[28]Murthy M，Azizan EA，Brown MJ，et al. Characterization of a novel somatic KCNJ5 mutation delI157 in an aldosterone-producing adenoma. J Hypertens，2012，30(9)：1827-1833.

[29]Kuppusamy M，Caroccia B，Stindl J，et al. A novel KCNJ5-insT149 somatic mutation close to，but outside，the selectivity filter causes resistant hypertension by loss of selectivity for potassium. J Clin Endocrinol Metab，2014，99(9)：E1765-E1773.

[30]Williams TA，Monticone S，Schack VR，et al. Somatic ATP1A1，ATP2B3，and KCNJ5 mutations in aldosterone-producing adenomas. Hypertension，2014，63(1)：188-195.

[31]Williams TA，Monticone S，Crudo V，et al. Visinin-like 1 is upregulated in aldosterone-producing adenomas with KCNJ5 mutations and protects from calcium-induced apoptosis. Hypertension，2012，59(4)：833-839.

[32]Berthon A，Drelon C，Ragazzon B，et al. WNT/β-catenin signalling is activated in aldosterone-producing adenomas and controls aldosterone production. Hum Mol Genet，2014，23(4)：889-905.

[33]Einholm AP，Andersen JP，Vilsen B. Importance of Leu99 in transmembrane segment M1 of the Na+，K+-ATPase in the binding and occlusion of K+. J Biol Chem，2007，282(33)：23854-23866.

[34]Einholm AP，Andersen JP，Vilsen B. Roles of transmembrane segment M1 of Na+，K+-ATPase and Ca2+-ATPase，the gatekeeper and the pivot. J Bioenerg Biomembr，2007，39(5-6)：357-366.

[35]Brown MJ，Hopper RV. Calcium-channel blockade can mask the diagnosis of Conn's syndrome. Postgrad Med J，1999，75(882)：235-236.

[36]Moraitis AG，Rainey WE，Auchus RJ. Gene mutations that promote adrenal aldosterone production，sodium retention，and hypertension. Appl Clin Genet，2013，7：1-13.

[37]Dekkers T，ter Meer M，Lenders JW，et al. Adrenal nodularity and somatic mutations in primary aldosteronism: one node is the culprit? . J Clin Endocrinol Metab，2014，99(7)：E1341-E1351.

(收稿：2015-08-11修回：2015-12-07)

(本文編輯：梁英超)

doi:10.3969/j.issn.1673-6583.2016.01.012

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(81500324)

通信作者：高平進(jìn)，Email：gaopingjin@sibs.ac.cn