雙孔鉀離子通道THIK-1的病理生理研究進展

王俊柯，魏義勇，王海英

(1.遵義醫(yī)科大學 麻醉醫(yī)學院，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 麻醉科，貴州 遵義 563099)

目前發(fā)現(xiàn)的雙孔鉀離子通道有6類，15種亞型，各種亞型在不同的組織，參與了一系列重要生理功能[1]。雙孔鉀離子通道THIK(Two-pore-domain halothane-inhibited K+channel，THIK)于2001年被發(fā)現(xiàn)，包括THIK-1和THIK-2兩種亞型。Rajan等[2]通過逆轉錄-PCR技術分析發(fā)現(xiàn)，THIK-1離子通道在腦、肺、腎、肝、胃、脾、骨骼肌、心臟和睪丸等組織中均有表達；運用原位雜交技術檢測到THIK-1離子通道在成年大鼠嗅球顆粒細胞層、嗅結節(jié)、外側隔以及不同的下丘腦和丘腦核團(下丘腦腹內(nèi)側核、乳頭狀外側核、網(wǎng)狀核、團聚核)中均有表達[2]。Kang等[3]將轉染含有GFP質粒的HEK293細胞C端與THIK-1融合(THIK-1-GFP)，共聚焦圖像顯示，THIK-1定位于質膜。THIK鉀離子通道是由4個跨膜片段(M1-M4)、2個孔結構域(P1、P2)和一個位于M1-P1之間的環(huán)形螺旋帽結構構成的背景鉀離子通道[4]，吸入麻醉藥氟烷和異氟烷可抑制THIK離子通道電流，這是此類離子通道區(qū)別于其它類型雙孔鉀離子通道的一個顯著特征[1-2]。THIK-1和THIK-2離子通道高度同源，但THIK-2離子通道擁有獨特的結構，在細胞內(nèi)沒有活性[5-6]。THIK-1離子通道在靜息膜電位下介導了內(nèi)向的鉀離子漏電流，從而參與細胞的興奮性和靜息膜電位[3, 7]。

目前已知THIK-1離子通道參與了多個重要的病理生理過程。例如，背根神經(jīng)節(jié)THIK-1離子通道表達增加參與了炎癥后疼痛的發(fā)生，使其可能成為治療潛在炎性疼痛靶點[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，THIK-1離子通道還是吸入麻醉藥物作用的潛在分子靶點[9-11]。另外，THIK-1離子通道在人和小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)疾病(多發(fā)性硬化癥)組織的小膠質細胞中表達[12-13]。因此，本文綜述了THIK-1離子通道參與疼痛和神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及吸入麻醉藥的作用機制等。通過進一步闡述THIK-1離子通道在這些領域中的具體作用，有助于以THIK-1離子通道作為潛在的分子靶點研發(fā)減輕疼痛、防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物，以及研發(fā)新型麻醉藥物。

1 THIK-1離子通道與疼痛

Djouhri等[14]報道外周病理性疼痛和急性疼痛可由部分神經(jīng)損傷、組織損傷和/或炎癥引起。背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal root ganglia，DRG)初級傳入神經(jīng)元電生理特性的改變是引起和維持這種疼痛的關鍵。在炎性和病理性疼痛模型中，神經(jīng)細胞自發(fā)放電(Spontaneous firing)頻率增加、電閾值降低，自發(fā)[15]抬腳(Spontaneous foot lifting，一種自發(fā)疼痛的標志)和/或完整纖維的傷害性感覺降低[14, 16-17]。根據(jù)生物物理特性的差異，鉀離子通道參與疼痛狀態(tài)的作用大小和性質迥異，有學者認為通過限制或阻止周圍神經(jīng)末梢的動作電位(AP)啟動來抑制外周興奮性，從而降低軸突的傳導保真度，或限制中樞終末的神經(jīng)遞質釋放，這可能是參與了治療疼痛的機制[18-19]。鑒于鉀離子通道對維持胞體膜電位(Em)中的作用，因此被認為是治療頑固性和病理性疼痛的潛在靶點[15, 19]。因此，對Em影響最大的K2P通道，被認為是影響自發(fā)性疼痛發(fā)生發(fā)展的關鍵靶點。

THIK-1離子通道由KCNK13基因編碼， Haskins等[8]結合免疫組化、Western blotting和行為學測試等手段，發(fā)現(xiàn)大鼠的所有DRG小神經(jīng)元，大量的中、大神經(jīng)元都表達THIK-1離子通道。有髓和無髓纖維、皮膚的神經(jīng)末梢和脊髓的I、II層也表達該離子通道。THIK-1離子通道染色與IB4(Isolectin B4，植物凝集素)結合和trkA(Tropomyosin-receptor kinase A，一種肽能傷害性感受器)共定位，提示該離子通道在傷害性感受器中廣泛表達。研究發(fā)現(xiàn)[8]THIK-1離子通道的功能與SFL持續(xù)時間呈顯著負相關，THIK-1離子通道表達降低會導致K+滲漏降低，從而引起靜息膜電位去極化。反過來，這將導致傷害性感受器自發(fā)放電易化。在DRG神經(jīng)元中，目前還沒有關于THIK-1離子通道對Em影響的數(shù)據(jù)，因此很難確定THIK-1離子通道在完全弗氏佐劑誘導的皮膚炎癥后1 d(CFA1)自發(fā)性疼痛中的確切作用，但是免疫熒光染色顯示，THIK-1離子通道在幾乎所有的小神經(jīng)元(C纖維傷害性感受器)以及中型和大型神經(jīng)元中均有表達，鑒于此，進一步研究THIK-1離子通道對Em影響意義重大。

此外， Haskins等[8]也發(fā)現(xiàn)，在條件性敲除小鼠THIK-1離子通道會延長的自發(fā)抬足持續(xù)時間，證明THIK-1離子通道在自發(fā)性疼痛中可能發(fā)揮一定作用。作者在小鼠足底注射完全弗氏佐劑誘導炎癥后1 d(CFA1)，胞漿和邊緣(膜相關)THIK-1離子通道染色發(fā)現(xiàn)，同側小神經(jīng)元數(shù)量較正常側明顯減少。誘導炎癥后4 d(CFA4)，與正常相比，雙側小神經(jīng)元邊緣THIK-1離子通道表達降低。中、大型DRG神經(jīng)元在CFA1和CFA4處的THIK-1離子通道表達均無明顯變化。CFA1處同側(而非對側)小神經(jīng)元THIK-1離子通道的平均強度與自發(fā)抬足時間(自發(fā)疼痛的標志)呈顯著負相關。因此，THIK-1離子通道參與了炎癥調(diào)控皮膚傷害性感受器的表達。最后，siRNA敲除體內(nèi)THIK-1離子通道比siRNA干擾THIK-1離子通道大鼠具有更長的自發(fā)抬足持續(xù)時間[8]。上述證據(jù)表明THIK-1離子通道可能是炎癥后疼痛的發(fā)生機制。

2 THIK-1離子通道與吸入麻醉

吸入麻醉藥的作用機制至今仍然是醫(yī)學上最令人困惑的謎團之一。Jung等[20]研究發(fā)現(xiàn)吸入麻醉藥抑制線粒體生成ATP，而ATP的生成減少，反過來又使突觸前神經(jīng)元的ATP生成減少，減弱了細胞胞吞作用。研究表明，異氟醚通過抑制線粒體復合物I來抑制突觸前神經(jīng)元的胞吞作用，從而導致突觸前神經(jīng)元ATP的生成下降。ATP依賴性的突觸前神經(jīng)元胞吞作用被抑制可能是異氟烷發(fā)揮麻醉作用的主要機制。Izquierdo等[21]在THIK-1基因敲除的小鼠研究中，發(fā)現(xiàn)THIK-1活性的降低會導致小膠質細胞的吞噬能力和降解能力顯著減弱。吸入麻醉藥會影響突觸前神經(jīng)元的胞吞能力，THIK-1離子通道可影響小膠質細胞的吞噬能力，那么THIK-1離子通道是否有可能是突觸前神經(jīng)元ATP生成減少的關鍵生理機制呢？這是重要的科學問題之一。

Lazarenko等[10]發(fā)現(xiàn)烏拉坦麻醉后的大鼠，異氟醚也增加了斜方體后核(RTN，Retrotrapezoid nucleus)化學敏感神經(jīng)元的放電頻率，不依賴于CO2水平。異氟醚短暫地增強了實驗動物呼吸功能，這種效應在呼吸驅動水平較低時最為顯著，主要通過呼吸頻率的增加來調(diào)節(jié)，這些結果表明RTN神經(jīng)元在呼吸調(diào)控中起著重要作用。吸入麻醉藥激活RTN神經(jīng)元，增強RTN神經(jīng)元興奮，抵消部分呼吸運動系統(tǒng)中其它因素的抑制作用，從而在系統(tǒng)其他功能普遍受到抑制的情況下為呼吸系統(tǒng)提供更強的興奮性驅動。因此，進一步研究不同腦區(qū)不同神經(jīng)元的THIK1離子通道在吸入麻醉藥物作用中的重要機制，可為優(yōu)化吸入麻醉效果，改善吸入麻醉的蘇醒質量提供理論基礎，針對THIK-1離子通道深入研究，有望開發(fā)新型全身麻醉藥物，提高麻醉安全。

3 THIK-1離子通道與神經(jīng)系統(tǒng)疾病

多發(fā)性硬化是一種神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病，先天免疫反應既有對抗感染微生物的能力，又有推動病理性炎癥的能力，炎性小體復合物通過調(diào)節(jié)白介素1β(IL-1β)、白介素18(IL-18)和細胞焦亡，因此成為這些過程的核心步驟，炎性小體復合物(NLRP3)通過直接結合配體和間接機制識別受損或死亡細胞釋放的微生物產(chǎn)物或內(nèi)源性分子，IL-1家族的細胞因子可能導致組織損傷和慢性炎癥[22]。Drinkall等[23]進一步研究使用藥物抑制劑和THIK-1基因敲除小鼠的細胞，在體外評價THIK-1對巨噬細胞NLRP3的激活作用。筆者發(fā)現(xiàn)THIK-1離子通道抑制劑TPA(Tetrapentylammonium，四戊基溴化銨)可使NLRP3激動劑對小鼠骨髓來源的巨噬細胞(BMDMs，Bone-marrow-derived macrophages)、混合膠質細胞和小膠質細胞的caspase-1激活和IL-1β的釋放減少。同樣，THIK-1全身敲除(或條件性敲除)小鼠的BMDMs和小膠質細胞也減少了IL-1β的釋放。這些研究表明THIK-1是NLRP3炎癥小體激活的調(diào)節(jié)因子，并確定THIK-1是炎癥性疾病的潛在治療靶點?？梢?，THIK-1調(diào)節(jié)炎性小體復合物在整個炎癥過程的發(fā)展過程中起著至關重要的作用。

小膠質細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐免疫細胞，它們通過運動突起以及納米級傳感絲狀突起動態(tài)地觀察它們所處的環(huán)境[24]，在健康的大腦動態(tài)平衡和可塑性中起著關鍵作用。小膠質細胞在大多數(shù)神經(jīng)病理中被激活，包括神經(jīng)退行性疾病、癲癇、自閉癥、精神障礙和中風[25-27]，THIK-1離子通道在健康人中樞神經(jīng)系統(tǒng)和多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis)癥組織的小膠質細胞中表達[12-13]。多發(fā)性硬化中被激活的小膠質細胞吞噬掉髓鞘和神經(jīng)元碎片[28-31]，這有利于神經(jīng)保護和髓鞘再生。整個過程受ATP、趨化因子、神經(jīng)遞質、細胞外鉀濃度等因素的調(diào)節(jié)[7, 32-33]，并通過小膠質細胞受體整合，特別是嘌呤能受體P2Y12和Fractalkine受體CX3CR1，以及最近發(fā)現(xiàn)的雙孔鉀離子通道THIK-1[7, 34-35]。小膠質細胞與郎飛氏髓鞘和郎飛氏結節(jié)的直接接觸最近在大鼠的穹窿體內(nèi)觀察到[36]，少突膠質前體細胞(OPC，Oligodendrocyte precursors cells)和星形膠質細胞接觸通過郎飛氏結節(jié)[37]，同時有文獻顯示這些細胞可能在特定的節(jié)點處相互作用傳遞信號[38]。表明郎飛氏結節(jié)可能是中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞間通訊的樞紐。

Ronzano等[39]使用3D重建數(shù)據(jù)進一步支持了這一點，該數(shù)據(jù)顯示，大鼠小膠質細胞與結節(jié)成分和其它接觸的膠質細胞建立了物理聯(lián)系。Ronzano等[39]為了評估THIK-1離子通道是否參與小膠質細胞-郎飛氏結節(jié)相互作用，使用鉀通道的廣譜抑制劑四乙銨30mM處理有髓切片，培養(yǎng)1h后發(fā)現(xiàn)TEA不影響小膠質細胞的整體形態(tài)和動力學。然而，這種處理導致小膠質細胞與郎飛氏結節(jié)的相互作用減少了40%，與對照條件下的(18.8±1.1)%相比，處理后的切片中有(11.4±1.1)%的節(jié)點接觸。提示軸突靜息電位上存在的外向鉀電流，參與調(diào)節(jié)了小膠質細胞-郎飛氏結節(jié)的相互作用。Ronzano等[39]使用不同的鉀離子通道阻斷劑，影響小膠質細胞的促細胞再生功能，發(fā)現(xiàn)這與髓鞘再生的減少有關。提示影響神經(jīng)元與小膠質細胞之間的鉀離子信號傳遞，可能是干預髓鞘再生能力的關鍵靶點。筆者進一步使用溶血磷脂酰膽堿(Lysophosphatidylcholine，LPC)誘導了局灶性脫髓鞘病變，構建了多發(fā)性硬化的病理模型，首先，使用THIK-1的阻斷劑四戊基溴化銨(TPA)或廣譜鉀離子通道阻滯劑四乙銨(TEA)處理腦組織切片1h，并通過IGF1標記促再生表型的小膠質細胞，iNOS標記促炎癥表型的小膠質細胞，來量化小膠質細胞的功能表達，結果發(fā)現(xiàn)TEA處理后促再生小膠質細胞數(shù)量顯著減少22%，而TPA處理后顯著減少25%。相反，在TEA處理后，促炎癥小膠質細胞數(shù)量顯著增加了21%，TPA處理后顯著增加26%。筆者得出結論，鉀離子通道抑制劑改變了小膠質細胞與結節(jié)的相互作用，損害了小膠質細胞向再生表型的轉換，并減少了髓鞘的再生，并且雙孔鉀離子通道THIK-1對髓鞘再生的影響更大。

4 展望

THIK-1離子通道廣泛的表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中，參與了細胞的電生理活動和細胞代謝等多個環(huán)節(jié)。在不同的組織細胞中參與了不同的重要病理生理過程。THIK-1離子通道參與疼痛和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生，以及吸入麻醉藥的作用機制。進一步研究THIK-1離子通道在這些領域中的具體作用，有助于以THIK-1離子通道作為潛在的分子靶點，研發(fā)減輕疼痛和防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物，以及研發(fā)新型麻醉藥物。