糖尿病大血管病變的表觀遺傳學(xué)標(biāo)志物

陳明云 李連喜

·綜述·

糖尿病大血管病變的表觀遺傳學(xué)標(biāo)志物

陳明云 李連喜

表觀遺傳學(xué)是指在不改變核苷酸序列的情況下，基因的表達活性發(fā)生了可遺傳的變化，它包括DNA甲基化、組蛋白修飾、miRNA等。表觀遺傳學(xué)在糖尿病大血管病變的發(fā)生、發(fā)展過程發(fā)揮了重要的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)了一些反映糖尿病大血管病變的表觀遺傳學(xué)標(biāo)志物，包括LINE-1甲基化、Alu甲基化、DDAH2啟動子甲基化；Sirt1與SET7等組蛋白修飾相關(guān)酶；miRNA-126、miRNA-21、miRNA-125b等。隨著表觀遺傳改變檢測手段的改進，表觀遺傳學(xué)標(biāo)志物有可能成為糖尿病大血管病變新的診斷手段。

糖尿病；大血管病變；表觀遺傳；生化標(biāo)志物

糖尿病大血管病變是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為多部位的動脈粥樣硬化，可能與高血糖的“代謝記憶”效應(yīng)有關(guān)。高血糖“代謝記憶”是指糖尿病患者早期血糖控制不佳，即使之后有效控制血糖，仍較早期血糖控制良好患者更易發(fā)生多臟器的損傷和血管并發(fā)癥[1]。近來的研究表明，高血糖“代謝記憶”可能與靶細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)改變相關(guān)。隨著一系列有效檢測疾病表觀遺傳改變手段的出現(xiàn)，越來越多人意識到表觀遺傳學(xué)標(biāo)志物是可行的疾病診斷手段。

1 表觀遺傳學(xué)概述

表觀遺傳學(xué)指在不改變核苷酸序列的情況下，基因表達活性發(fā)生了可遺傳的變化[2]。目前研究較充分的有DNA甲基化、組蛋白修飾和小分子RNA(miRNA)。

DNA甲基化是在胞嘧啶的脫氧核糖的5-C上加入甲基基團，多發(fā)生于CG雙核糖核苷酸富集區(qū)域，即CpG島，約占人類基因組的40%[3]。DNA甲基化通常發(fā)生在基因的啟動子區(qū)域，接近轉(zhuǎn)錄的起始位點，抑制了目標(biāo)基因表達。

組蛋白修飾又稱轉(zhuǎn)錄后修飾或“組蛋白密碼”，通常發(fā)生在組蛋白N端尾部，在相關(guān)酶的作用下發(fā)生乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化及SUMO化等。組蛋白的乙?；ǔＴ谝阴；D(zhuǎn)移酶介導(dǎo)下發(fā)生在賴氨酸殘基，促進基因的轉(zhuǎn)錄；而組蛋白去乙酰化酶則起到移除乙?；鶊F的作用，抑制基因轉(zhuǎn)錄。組蛋白的甲基化也發(fā)生在賴氨酸殘基，與組蛋白乙?；煌氖?，其對基因轉(zhuǎn)錄的影響取決于修飾的殘基位點，如H3K9與H3K27的甲基化與抑制DNA的表達相關(guān)，而H3K4的甲基化與活化DNA的表達相關(guān)。組蛋白SUMO化和組蛋白泛素化作用機制至今沒有被闡明。

MiRNA是內(nèi)源性具有調(diào)控功能的非編碼RNA，通常由DNA的內(nèi)含子編碼，通過與目標(biāo)mRNA的3′非編碼區(qū)相結(jié)合，介導(dǎo)基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，即通過介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄沉默，抑制翻譯及降解相關(guān)RNA，進而抑制目標(biāo)蛋白的表達。

2 糖尿病大血管病變相關(guān)表觀遺傳學(xué)標(biāo)志物

2.1 DNA甲基化 DNA甲基化參與了多種疾病包括糖尿病及糖尿病大血管病變的發(fā)生、發(fā)展。目前，許多高效的檢測手段如DNA甲基化芯片、全基因組亞硫酸氫鹽測序等，為DNA甲基化作為診斷疾病發(fā)生的標(biāo)志物提供了可能性[4]。

約55%人類基因包含重復(fù)元件，其中包括近500 000個長散布核元件-1(LINE-1)重復(fù)序列，占基因組的17%。它們是“反轉(zhuǎn)位子”，這些流動的遺傳元素首先被轉(zhuǎn)錄成RNA，然后再被由該反轉(zhuǎn)位子本身產(chǎn)生的一種逆向轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成DNA。該DNA可在任何位置整合進基因組中。LINE-1能高度代表正常組織中DNA甲基化水平，因此常被用來作為檢測總DNA甲基化水平的標(biāo)志物。Wei等[5]對中國人群外周血淋巴細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，LINE-1甲基化水平下降與心血管事件的發(fā)生高度相關(guān)，且和動脈粥樣硬化獨立危險因素同型半胱氨酸的升高高度相關(guān)。Greiβel等[6]研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化斑塊組織LINE-1甲基化水平顯著低于正常動脈組織，且重度頸動脈狹窄患者血清中LINE-1甲基化也顯著低于正常人。Martín-Núez等[7]基于對西班牙人(n=155)的隊列研究發(fā)現(xiàn)，低LINE-1甲基化水平是糖尿病等代謝性疾病的獨立危險因子，可作為評估糖尿病及其大血管病變的潛在生化標(biāo)志物。然而，Pearce等[8]對英國紐卡斯?fàn)柷粞芯?Newcastle Thousand Families Study，NTFS)分析發(fā)現(xiàn)，高甲基化LINE-1水平與患者空腹血糖、甘油三酯和低密度脂蛋白-膽固醇升高相關(guān)，與高密度脂蛋白-膽固醇水平降低相關(guān)，而這些都可作為預(yù)測2型糖尿病及心血管疾病發(fā)生的生化標(biāo)志物。上述研究結(jié)果相?？赡苁且驗檠芯克x取的細(xì)胞種類不同及伴隨著衰老的過程，人體DNA甲基化水平下降，對研究結(jié)果造成干擾。但是，LINE-1甲基化水平的變化作為糖尿病及心血管疾病的表觀遺傳學(xué)標(biāo)志物卻是毋庸置疑的。

Alu重復(fù)序列同樣可以作為評估DNA甲基化水平的可靠指標(biāo)。由于這種DNA序列中有限制性內(nèi)切核酸酶Alu的識別序列AGCT，所以稱為Alu重復(fù)序列。Kim等[9]評估286名志愿者外周血淋巴細(xì)胞Alu重復(fù)序列的水平，發(fā)現(xiàn)曾有心肌梗死、卒中、高血壓及糖尿病病史的患者有更高的總DNA甲基化水平。同樣這和患者血清中高同型半胱氨酸表達相關(guān)。因此，Alu重復(fù)序列的甲基化水平也可作為評估糖尿病大血管病變潛在的表觀遺傳學(xué)標(biāo)志物。

臨床研究及動物實驗都表明內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)取決于內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)，而高血壓、高脂血癥、冠心病、糖尿病等疾病狀態(tài)都可損害EPCs功能。EPCs可以用來評估血管功能及心血管風(fēng)險。Niu等[10]對比冠心病患者與正常人的外周血EPCs的甲基化發(fā)現(xiàn)，冠心病患者的EPCs中調(diào)控二甲基精氨酸二甲氨水解酶(DDAH2)的基因啟動子區(qū)呈高甲基化狀態(tài)。且DDAH2 mRNA呈低水平表達，EPCs黏附功能受損。非對稱性二甲基精氨酸可抑制一氧化氮合酶發(fā)揮作用。DDAH2可抑制非對稱性二甲基精氨酸的作用，因此被視為動脈粥樣硬化、糖尿病等相關(guān)血管性疾病的保護因子。因此DDAH2啟動子高甲基化可能是繼LINE-1和Alu之后又一潛在的評估相關(guān)糖尿病大血管病變的生化標(biāo)志物。

2.2 組蛋白修飾 沉默信息調(diào)節(jié)因子相關(guān)酶類1(Sirt1)是組蛋白去乙?；钢?，參與調(diào)控能量平衡、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)與氧化應(yīng)激等。Sirt1能夠降低糖尿病患者組蛋白乙酰化水平，并脫去與Shc相關(guān)磷酸化酪氨酸適配蛋白(p66Shc)及核因子-κB p65啟動子相結(jié)合的H3組蛋白上乙?；鶊F，而后者與氧化反應(yīng)及炎性反應(yīng)相關(guān)基因的上調(diào)相關(guān)[11]。Paneni等[12]通過高糖刺激人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)H3組蛋白發(fā)生高乙?；?，促進p66 Shc的高表達和活性氧簇的生成，提示其可能為誘導(dǎo)糖尿病大血管病變的作用機制，且這種影響在細(xì)胞恢復(fù)正常糖培養(yǎng)下并未消除，他們通過小鼠實驗也同樣驗證了以上結(jié)論。Kim等[13]發(fā)現(xiàn)高糖刺激THP-1巨噬細(xì)胞，可增加組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶的活性，催化核因子-κB p65的基因發(fā)生乙?；?，上調(diào)下游白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子α等炎性因子的表達水平。Sirt1還可改善內(nèi)皮細(xì)胞的胰島素抵抗、氧化應(yīng)激狀態(tài)，阻礙動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展。動物水平研究發(fā)現(xiàn)，Sirt1活化劑能改善胰島素抵抗，增加動脈彈性。Sirt1活化劑藥物目前已經(jīng)進入了Ⅱa期臨床試驗階段，有望成為治療糖尿病大血管病變的新型藥物[14]。

H3K9的甲基化與調(diào)控自身免疫及炎性反應(yīng)的基因密切相關(guān)。Greiβel等[6]發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化斑塊組織中H3K9甲基化水平顯著低于正常動脈組織，且在頸動脈壁上平滑肌細(xì)胞與炎性細(xì)胞中表達水平也顯著降低。抑制人平滑肌細(xì)胞H3K9甲基化轉(zhuǎn)移酶Suv39h1的基因表達，可促進炎性因子的表達，同樣在糖尿病db/db小鼠來源的平滑肌細(xì)胞也表現(xiàn)出單核細(xì)胞趨化蛋白1和白細(xì)胞介素-6等炎性因子的表達水平上升，而H3K9甲基化水平下降與H3K4的甲基化水平增加相關(guān)[15]。

SET7(也稱作SET9或者SET7/9)甲基化轉(zhuǎn)移酶可催化H3K4發(fā)生單甲基化。SET7 在炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮正性調(diào)節(jié)作用。SET7可上調(diào)核因子-κB p65在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達，并在內(nèi)皮細(xì)胞的先天免疫過程中發(fā)揮重要作用[16]。Okabe等[17]發(fā)現(xiàn)，高糖狀態(tài)可刺激SET7在內(nèi)皮細(xì)胞核內(nèi)聚集，促進促炎因子基因的表達。Paneni等[18]發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者SET7表達水平顯著高于正常人，且SET7高表達上調(diào)了核因子-κB的活化水平及核因子-κB下游的氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)相關(guān)的基因及血漿中細(xì)胞間黏附分子-1與單核細(xì)胞趨化蛋白-1的表達水平。給予人動脈內(nèi)皮細(xì)胞高糖刺激可見到上述相似表現(xiàn)，而抑制SET7可以抑制H3K4發(fā)生單甲基化，并抑制核因子-κB依賴的氧化應(yīng)激與炎性反應(yīng)。SET7可能是潛在的糖尿病大血管病變的診療靶標(biāo)。

由于炎性因子在糖尿病大血管病變的發(fā)生中起著十分關(guān)鍵的作用，因此，細(xì)胞內(nèi)組蛋白乙?；郊凹谆降淖兓型蔀轭A(yù)測糖尿病大血管病變發(fā)生的表觀遺傳學(xué)標(biāo)志物。傳統(tǒng)的基序檢測與蛋白檢測相結(jié)合的手段和生化技術(shù)，已能高效檢測組蛋白甲基化。LANCE Ultra和AlphaLISA等技術(shù)的發(fā)展與優(yōu)化，顯著提高了檢測的靈敏度[19]。組蛋白修飾作為潛在的生化標(biāo)志物應(yīng)用于臨床指日可待。

2.3 MiRNA MiRNA參與調(diào)控人類基因組中1/3～2/3的基因，參與細(xì)胞生長、增殖、分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡、代謝與衰老等過程。并且miRNA可在血液、尿液、唾液、淚液及乳汁中檢測到，可作為有效的診斷標(biāo)志物[20]。

MiRNA-126又被稱為血管特異性miRNA，只由內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)含子的表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域7編碼，是調(diào)控動脈粥樣硬化的重要因子。相關(guān)研究表明，miRNA-126通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子的表達，下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子的抑制劑Spred-1的表達，促進心血管的生成，在保持血管的完整性及血管的生成中發(fā)揮重要作用[21]。研究表明，糖尿病患者EPCs的數(shù)量減少且功能不全，而EPCs對內(nèi)皮的再生極為重要。研究揭示，糖尿病患者EPCs的miRNA-126表達水平較對照組下降(P<0.05)，并提出EPCs低表達的miRNA-126可能通過調(diào)控Spred-1損傷血管功能[20]。Jansen等[22]則通過檢測176例冠心病患者血液中miRNA-126微粒數(shù)量，發(fā)現(xiàn)合并糖尿病的患者miRNA-126的表達水平顯著低于不合并糖尿病的患者。因此miRNA-126水平的變化有可能作為糖尿病大血管病變的表觀遺傳學(xué)標(biāo)志物而應(yīng)用于臨床。

Fleissner等[23]研究表明，血液中有較高ADMA表達的冠狀動脈粥樣硬化患者EPCs的miRNA-21表達水平較對照組明顯上升，而參與線粒體氧化防御反應(yīng)的超氧化物歧化酶-2的表達水平則顯著下降。這可能激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶/絲裂原活化蛋白激酶通路，促進活性氧簇生成及血管EPCs遷移功能受損。Zeng等[24]同樣發(fā)現(xiàn)糖尿病患者的EPCs miRNA-21表達水平較對照組明顯增加。

此外，miRNA-125b可以下調(diào)Suv39h1水平，抑制白細(xì)胞介素-6和單核細(xì)胞趨化蛋白-1啟動子H3K9甲基化，進而促進大血管炎性反應(yīng)的發(fā)生與動脈粥樣硬化的形成[25]。因此，miRNA-21和miRNA-125b等miRNA都可能是潛在的糖尿病大血管病變的表觀遺傳標(biāo)志物。

3 總結(jié)

糖尿病大血管病變是糖尿病致死、致殘的主要原因。糖尿病高血糖“代謝記憶”提示早期控制血糖的重要性，因此我們亟需高效的糖尿病大血管病變的診斷指標(biāo)。表觀遺傳學(xué)反映了環(huán)境對糖尿病大血管病變的影響，在糖尿病大血管病變的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。因此我們希望能從中發(fā)現(xiàn)新的診斷和治療的生化標(biāo)志物，通過闡明表觀遺傳學(xué)的機制為疾病的預(yù)防和治療提供新的方向。

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Epigeneticbiomarkersofdiabeticmacrovascularcomplications

ChenMingyun,LiLianxi.

DepartmentofEndocrinologyandMetabolism,ShanghaiJiaotongUniversityAffiliatedSixthPeople′sHospital,ShanghaiClinicalCenterforDiabetes,ShanghaiDiabetesInstitute,ShanghaiKeyLaboratoryofDiabetesMellitus,Shanghai200233,China

Correspondingauthor:LiLianxi,Email:lilx@sjtu.edu.cn

Epigenetics are heritable traits that do not change DNA sequence, including DNA methylation, histone modification, and noncoding RNA action and so on. Epigenetics play an important role in the occurrence and development of diabetic macrovascular disease. Recently, a number of epigenetic biomarkers have been identified and used to reflex diabetic macrovascular complications, such as LINE-1 methylation, Alu methylation, methylation of DDAH2 promoter, Sirt1 and SET7 which take part in histone modification, miRNA-126, miRNA-21 and miRNA-125b, etc. With the improvement of detection of epigenetic changes, epigenetic biomarkers may become new diagnostic tools for diabetic macrovascular complications.

Diabetes mellitus; Macrovascular complications; Epigenetics; Biomarkers

國家自然科學(xué)基金資助項目(81170759)，上海市科學(xué)技術(shù)委員會資助項目(15411960600)

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2016.02.015

200233 上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，上海市糖尿病研究所，上海市糖尿病臨床醫(yī)學(xué)中心，上海市糖尿病重點實驗室

李連喜，Email：lilx@sjtu.edu.cn

FundprogramNational Natural Science Foundation of China (811770759); Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (15411960600)

2015-06-02)