雷公藤多苷對(duì)糖尿病腎病大鼠核因子-κB信號(hào)通路的影響

楊薇 李春君 孫蓓 厲莉 王珊珊 郭欣 張曉娜 馬澤軍 陳莉明

·論著·

雷公藤多苷對(duì)糖尿病腎病大鼠核因子-κB信號(hào)通路的影響

楊薇 李春君 孫蓓 厲莉 王珊珊 郭欣 張曉娜 馬澤軍 陳莉明

目的探討不同劑量雷公藤多苷(TWP)對(duì)糖尿病腎病(DN)大鼠腎組織核因子-κB信號(hào)通路的影響。方法選取60只Sprague-Dawley(SD)大鼠，給予高糖、高脂飲食聯(lián)合尾靜脈注射鏈脲佐菌素(30 mg/kg)建立DN大鼠模型。將成模大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為DN對(duì)照組(DNC組，n=8)、低劑量TWP治療組(3 mg·kg-1·d-1，n=8)、中劑量TWP治療組(6 mg·kg-1·d-1，n=8)、高劑量TWP治療組(9 mg·kg-1·d-1，n=10)。選取10只大鼠作為正常對(duì)照組(NC組)，喂養(yǎng)常規(guī)飼料，灌胃8周后檢測(cè)大鼠的體重、腎重體重比、尿微量白蛋白、血糖、肝功能、腎功能，并采用HE染色觀察腎臟形態(tài)改變，分別采用免疫組化法、q-PCR法、Western印跡方法對(duì)大鼠腎臟核因子-κB、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)以及白細(xì)胞介素-6(IL-6)進(jìn)行定位定量分析(以觀察不同劑量TWP對(duì)大鼠腎臟核因子-κB、ICAM-1、IL-6表達(dá)的影響)。結(jié)果TWP治療可減少尿白蛋白，但對(duì)體重、血糖、肝功能、腎功能無影響，可降低DN大鼠腎臟核因子-κB、ICAM-1、IL-6 mRNA(t核因子-κB=8.89～16.88，tICAM-1=9.56～15.92，tIL-6=10.16～25.78，P均<0.05及蛋白(t核因子-κB=9.87～17.38，tICAM-1=8.54～16.95，tIL-6=9.76～20.18，P均<0.05)表達(dá)，且呈劑量依賴性，中高劑量TWP抑制更明顯(P均<0.05)。結(jié)論TWP呈劑量依懶性抑制DN大鼠腎組織核因子-κB炎性反應(yīng)信號(hào)通路。

雷公藤多苷；糖尿病腎病；核因子-κB；細(xì)胞間黏附分子-1；白細(xì)胞介素-6

糖尿腎病(DN)是糖尿病患者的微血管并發(fā)癥之一，是由多種因素相互作用所引起的一種低度炎性疾病[1]。大量研究證實(shí)，炎性反應(yīng)因子對(duì)DN的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮重要作用[2]。其中核因子-κB信號(hào)通路是介導(dǎo)慢性炎性反應(yīng)的經(jīng)典通路，核因子-κB是細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)的上游因子[3]。同時(shí)ICAM-1、IL-6可加速DN進(jìn)展，因此抑制核因子-κB信號(hào)通路可以延緩DN的進(jìn)展，提示核因子-κB有可能成為DN的治療位點(diǎn)[4]。雷公藤多苷(TWP)是一種植物免疫抑制劑，能夠抑制多種炎性反應(yīng)信號(hào)通路，具有獨(dú)特的抗炎、抗免疫作用[5]。本研究以DN大鼠為研究對(duì)象，旨在觀察不同劑量TWP對(duì)腎組織核因子-κB、ICAM-1、IL-6 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 主要試劑與儀器：(1)鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó)Sigma公司)。(2)TWP片(浙江得恩德制藥公司)。(3)抗核因子-κB、ICAM-1、IL-6單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)，抗GAPDH抗體(天津三箭生物技術(shù)有限公司)。(4)SYBR q-PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo公司)。(5)凝膠成像儀(美國(guó)BIO-RAD公司)。(6)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(日本Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物造模及分組 6周齡清潔級(jí)雄性Spraugue-Dawley(SD)大鼠70只，體質(zhì)量(161±9)g，予常規(guī)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分組，隨機(jī)選取10只大鼠作為正常對(duì)照組(NC組)，繼續(xù)喂養(yǎng)常規(guī)飼料，其余60只作為DN模型組給予高糖、高脂飼料(具體配方為：蔗糖10%，豬油10%，膽固醇1%，膽酸鈉0.3%)。喂養(yǎng)8周后，高糖、高脂飼料組大鼠尾靜脈注射STZ 30 mg/kg，NC組予以尾靜脈注射等體積檸檬酸緩沖液[6]。共成模56只，將成模大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為DN對(duì)照組(DNC組)、低劑量TWP治療組(3 mg·kg-1·d-1)、中劑量TWP治療組(6 mg·kg-1·d-1)、高劑量TWP治療組(9 mg·kg-1·d-1)。不同劑量TWP治療組灌胃給藥，而NC組和DNC組分別灌胃等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液灌胃8周后，成模大鼠共死亡22只。最終每組只數(shù)分別為：NC組10只，DNC組8只，低劑量TWP治療組8只，中劑量TWP治療組8只，高劑量TWP治療組10只。

1.2.2 標(biāo)本收集與處理 在灌胃8周后測(cè)定各組大鼠的體重、隨機(jī)血糖，股動(dòng)脈取血用于檢測(cè)肝、腎功能，收集每只大鼠24 h尿液(將大鼠置于代謝籠內(nèi)，每籠6～8只)，用于檢測(cè)尿微量白蛋白。

1.2.3 腎臟組織病理學(xué) 灌胃第8周末處死大鼠后，分別取出兩腎，以冰PBS灌注沖洗干凈，濾紙吸除多余水分。右腎于稱重后置于4%多聚甲醛固定，取少量腎組織，常規(guī)制片，進(jìn)行HE染色。

1.2.4 免疫組化檢測(cè)核因子-κB表達(dá) 將腎組織切片置于60℃恒溫箱中烘烤20～30 min，取出后靜置5 min，然后依次將載玻片放入二甲苯Ⅰ及不同濃度酒精中脫蠟，脫蠟后進(jìn)行抗原修復(fù)，然后滴加核因子-κB抗體(1∶100)，滴加二氨基聯(lián)苯胺反應(yīng)底物顯色，蘇木素復(fù)染，浸泡、脫水、封片。

1.2.5 q-PCR法檢測(cè)核因子-κB、ICAM-1、IL-6的mRNA表達(dá) Trizol法提取大鼠腎組織總RNA，取2 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系包括：4.0 μl RT Buffer(5×)，1.0 μl RiboLock RNase Inhibitor，2.0 μl 10 mmol/L dNTP Mix，1.0 μl RevertAid Reverse Transcriptase，1.0 μl Oligo(dT)18 Primer，RNA sample 和 ddH2O。 PCR擴(kuò)增目的基因，擴(kuò)增時(shí)反應(yīng)體系包括：5 μl 2×SYBR?Premix Ex TaqTM，0.5 μl 上游引物(10 μmol/L)及0.5 μl下游引物(10 μmol/L)，1 μl DNA模板，3 μl H2O。反應(yīng)條件：95℃ 5 min預(yù)變性；95℃ 15 s變性，60℃ 40 s退火并延伸；循環(huán)40次。目的片段引物用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)(表1)，由北京奧科生物技術(shù)公司合成。用凝膠圖像系統(tǒng)成像及進(jìn)行掃描定量分析，以所測(cè)得凈光密度與內(nèi)參照凈光密度的比值代表半定量值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6 Western印跡法檢測(cè)核因子-κB、ICAM-1、IL-6的蛋白表達(dá) RIPA裂解液裂解大鼠腎組織，離心提取上清液，40 μg蛋白上樣于12%聚丙烯酰胺凝膠，電泳后轉(zhuǎn)膜于0.45 μm PVDF膜。封閉2 h，加入特異性一抗(GAPDH 1∶10 000、核因子-κB 1∶1 000、ICAM-1 1∶500、IL-6 1∶1 000)4℃孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔或抗小鼠IgG(1∶10 000)室溫孵育1 h。最后用ECL化學(xué)發(fā)光劑染色、顯影。以凝膠成像系統(tǒng)記錄觀察結(jié)果，采用2Del凝膠分析軟件對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行掃描，將核因子-κB、ICAM-1、IL-6條帶與GAPDH條帶灰度值比值表示各指標(biāo)的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

表1 各目的基因的引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度

注：IL-6：白細(xì)胞介素-6；ICAM-1：細(xì)胞間黏附分子-1

2 結(jié)果

2.1 一般指標(biāo)變化 與NC組相比，DNC組血糖及尿微量白蛋白水平升高，體重降低(P均<0.05)；與DNC組相比，各劑量TWP治療組血糖、體重差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，而尿微量白蛋白明顯減少(P<0.05)，且中、高劑量TWP治療組較低劑量TWP治療組減少更明顯，呈劑量依賴性。各組肝、腎功能比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.2 腎組織HE染色結(jié)果 光鏡下觀察，NC組腎小球形態(tài)規(guī)則，無明顯腎小球基底膜增厚及其他明顯病變(圖1A，封3)；DNC組可見腎小球體積略增大，腎小球基底膜明顯增厚、系膜基質(zhì)增生，部分腎小球內(nèi)皮細(xì)胞呈空泡變性(圖1B，封3)。而經(jīng)TWP治療后的腎小球上述病理改變有不同程度改善，而且中、高劑量TWP治療組改善更加明顯，圖1C～E(封3)。

注：A為正常對(duì)照組：腎小球形態(tài)規(guī)則，無明顯腎小球基底膜增厚；B為糖尿病腎病對(duì)照組：腎小球體積略增大，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，腎小球基底膜明顯增厚、系膜基質(zhì)增生，部分腎小球內(nèi)皮細(xì)胞呈空泡變性；C為低劑量雷公藤多苷治療組：腎小球基底膜增厚減輕，炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少；D為中劑量雷公藤多苷治療組：腎小球形態(tài)基本規(guī)則，炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少，系膜基質(zhì)增生緩解；E為高劑量雷公藤多苷治療組：腎小球形態(tài)接近正常對(duì)照組，基底膜增厚不明顯，炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少圖1 腎組織HE染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果(400×)

2.3 腎組織免疫組化結(jié)果 免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，NC組腎組織各部位少量核因子-κB表達(dá)(圖2A，封3)；DNC組腎小球大量表達(dá)核因子-κB(圖2B，封3)；而在不同劑量TWP治療組腎小球表達(dá)核因子-κB逐漸減少(圖2C～E，封3)。圖像分析結(jié)果顯示，DNC組核因子-κB表達(dá)增加，與NC組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同劑量TWP治療組核因子-κB表達(dá)明顯減少，與DNC組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中高劑量TWP治療組表達(dá)明顯減少，與低劑量TWP治療組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，圖2F(封3)，圖3。

注：A為正常對(duì)照組：腎組織各部位無或少量核因子-κB表達(dá)，特異性染色顏色最淺；B為糖尿病腎病對(duì)照組：核因子-κB在腎小球大量表達(dá),特異性染色顏色最深；C、D、E為低、中、高劑量雷公藤多苷治療組：腎組織核因子-κB表達(dá)逐漸減少，特異性染色顏色逐漸變淺圖2 腎組織核因子-κB免疫組化結(jié)果(400×)

注：NC組：正常對(duì)照組；DNC組：糖尿病腎病對(duì)照組；L-TWP組：低劑量雷公藤多苷治療組；M-TWP組：中劑量雷公藤多苷治療組；H-TWP組：高劑量雷公藤多苷治療組；NF-κB：核因子-κB；TPA：平均面積密度；與NC組相比，aP<0.05；與DNC組相比，bP<0.05；與L-TWP組相比，cP<0.05圖3 免疫組化法對(duì)各組腎組織核因子-κB半定量分析

組別例數(shù)體重(g)KW/BW(mg/g)UMA(μg/24h)血糖(mmol/L)BUN(mmol/L)SCr(μmmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)NC組10442.7±43.83.2±0.245.7±14.56.0±0.210.9±2.032.8±4.449.7±9.5105.1±18.4DNC組8298.6±37.1a5.8±0.5a253.7±53.0a28.2±3.0a10.7±1.631.3±3.355.1±5.1109.4±8.4L-TWP組8318.2±22.1a5.0±0.5a183.5±78.7ab25.8±6.9a10.9±1.332.8±3.553.8±10.9116.8±9.5M-TWP組8308.6±37.8a5.1±0.3a123.8±74.8abc27.6±5.7a10.0±1.931.1±4.154.9±9.799.5±15.9H-TWP組10328.5±6.8a4.6±0.8a119.0±52.0abc29.0±3.1a10.2±1.231.5±3.854.2±8.9112.2±13.9F值112.322.14102.2815.7610.3430.1053.60102.10P值<0.05<0.05<0.05<0.05>0.05>0.05>0.05>0.05

注：NC組：正常對(duì)照組；DNC組：糖尿病腎病對(duì)照組；L-TWP組：低劑量雷公藤多苷治療組；M-TWP組：中劑量雷公藤多苷治療組；H-TWP組：高劑量雷公藤多苷治療組；KW/BW:腎重體重比；UMA:尿微量白蛋白；BUN：血尿素氮；SCr：血肌酐；ALT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶；AST：谷草轉(zhuǎn)氨酶；與NC組對(duì)比，aP<0.05；與DNC組對(duì)比，bP<0.05；與L-TWP組相比，cP<0.05

2.4 腎臟核因子-κB、ICAM-1、IL-6 mRNA的表達(dá) DNC組核因子-κB、ICAM-1、IL-6 mRNA表達(dá)量明顯升高，與NC組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TWP治療組較DNC組有較大幅度降低(P<0.05)，各治療組間，中、高劑量TWP治療組較低劑量TWP治療組有較大幅度降低(P<0.05)，見圖4。

2.5 腎臟核因子-κB、ICAM-1、IL-6的蛋白表達(dá) Western印跡結(jié)果顯示，DNC組核因子-κB、ICAM-1、IL-6的蛋白表達(dá)量明顯升高，與NC組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TWP治療組較DNC組有較大幅度降低(P<0.05)，中、高劑量TWP治療組較低劑量TWP治療組有較大幅度降低(P<0.05)，見圖5。

3 討論

炎性反應(yīng)及炎性因子對(duì)促進(jìn)DN的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮不可或缺的作用。有研究表明通過抑制核因子-κB炎性反應(yīng)信號(hào)通路可延緩DN進(jìn)展，提示核因子-κB是治療DN的重要靶點(diǎn)[7]。研究已證實(shí)，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎組織中，核因子-κB表達(dá)量明顯增加，且與尿白蛋白水平呈正相關(guān)。人體研究亦發(fā)現(xiàn)，DN患者核因子-κB信號(hào)通路的活性高于無腎病的糖尿病患者，而且與尿白蛋白程度密切相關(guān)[8]。核因子-κB信號(hào)通路被激活后可調(diào)節(jié)促炎因子、黏附分子和趨化因子的基因表達(dá)[9]。ICAM-1和IL-6是核因子-κB的下游因子。

注：NC組：正常對(duì)照組；DNC組：糖尿病腎病對(duì)照組；L-TWP組：低劑量雷公藤多苷治療組；M-TWP組：中劑量雷公藤多苷治療組；H-TWP組：高劑量雷公藤多苷治療組；NF-κB：核因子-κB；ICAM-1：細(xì)胞間黏附分子-1；IL-6：白細(xì)胞介素-6；與NC組相比，aP<0.05；與DNC組相比，bP<0.05；與L-TWP組相比，cP<0.05圖4 PCR法檢測(cè)各組腎組織中核因子-κB、ICAM-1、IL-6mRNA相對(duì)表達(dá)量

注：NC組：正常對(duì)照組；DNC組：糖尿病腎病對(duì)照組；L-TWP組：低劑量雷公藤多苷治療組；M-TWP組：中劑量雷公藤多苷治療組；H-TWP組：高劑量雷公藤多苷治療組；NF-κB：核因子-κB；ICAM-1：細(xì)胞間黏附分子-1；IL-6：白細(xì)胞介素-6；與NC組相比，aP<0.05；與DNC組相比，bP<0.05；與L-TWP組相比，cP<0.05圖5 Western印跡檢測(cè)各組腎組織中核因子-κB、ICAM-1、IL-6蛋白的相對(duì)表達(dá)量

ICAM-1是細(xì)胞黏附分子免疫球蛋白家族中的重要成員，通過受體與配體結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞之間，細(xì)胞和基質(zhì)之間的黏附作用，是細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)擴(kuò)張及腎小球硬化的分子生物學(xué)基礎(chǔ)[10]。而IL-6可促進(jìn)糖尿病時(shí)腎小球纖維化的發(fā)生、發(fā)展。與既往的研究結(jié)果一致，本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明核因子-κB在NC組無或少量表達(dá)，而DNC組核因子-κB、ICAM-1、IL-6 mRNA及蛋白表達(dá)量明顯增加，提示核因子-κB、ICAM-1、IL-6參與了DN的發(fā)生及發(fā)展過程。

TWP是衛(wèi)矛科雷公藤植物的根，含少量二萜類及生物堿成分，具有抗炎、緩解腎臟系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生，改善電荷屏障等作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)DNC組尿白蛋白增多的同時(shí)伴隨炎性因子核因子-κB、ICAM-1、IL-6升高，而經(jīng)TWP治療后，各治療組白蛋白尿減少的同時(shí)伴隨核因子-κB、ICAM-1、IL-6降低，首次證實(shí)TWP通過抑制核因子-κB信號(hào)通路來延緩DN進(jìn)展。

TWP抑制免疫作用表現(xiàn)為抑制細(xì)胞免疫和體液免疫[5]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)不同劑量TWP治療組能夠呈劑量依賴性降低核因子-κB、ICAM-1、IL-6水平，尤其在中、高劑量組作用更明顯。然而，由于TWP劑量過大所致的肝、腎毒性，使其臨床應(yīng)用一直存在爭(zhēng)議，孔巖等[12]已證實(shí)，當(dāng)TWP劑量達(dá)到24 mg·kg-1·d-1時(shí)，可導(dǎo)致腎毒性。而本研究最高劑量為9 mg·kg-1·d-1，所以大鼠肝、腎功能未出現(xiàn)異常，本實(shí)驗(yàn)最后造模成功率為93.3%，大多數(shù)是在STZ注射1周內(nèi)死亡，筆者將死亡大鼠進(jìn)行尸檢并抽取大鼠血液，并未發(fā)現(xiàn)肝、腎結(jié)構(gòu)及功能的異常，考慮可能由于飼養(yǎng)時(shí)正值夏季酷暑，飼養(yǎng)室潮濕悶熱，加之大鼠飲食不規(guī)律，免疫力低下，STZ注射后的二次創(chuàng)傷導(dǎo)致死亡。

本實(shí)驗(yàn)表明TWP能抑制DN大鼠腎組織核因子-κB信號(hào)通路，從而下調(diào)ICAM-1和IL-6表達(dá)，減少白蛋白尿，表明TWP通過抑制核因子-κB信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)DN大鼠腎臟的保護(hù)作用。然而，本課題只進(jìn)行了動(dòng)物研究，還需體外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探究核因子-κB信號(hào)通路在DN進(jìn)展中的作用機(jī)制。

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Effectsoftriperygiumwilfordiipolyglucosideonnuclearfactor-κBsignalingpathwayinratswithdiabeticnephropathy

YangWei*,LiChunjun,SunBei,LiLi,WangShanshan,GuoXin,ZhangXiaona,MaZejun,ChenLiming.

*TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China

Correspondingauthor：ChenLiming，Email：xfx22081@vip.163.com

ObjectiveTo investigate the effects of different doses of triperygium wilfordii polyglucoside (TWP) on the nuclear factor-κB signaling pathway in rats with diabetic nephropathy (DN).MethodsA total of 60 Sprague-Dawley (SD) rats were seleted. DN rats model were established by high-glucose and high fat diet, in combination with streptozotocin injection from tail vein. DN rats were divided into diabetic normal control group (DNC group,n=8), low dose of TWP group(L-TWP group，3 mg·kg-1·d-1,n=8) group, median dose of TWP group(M-TWP group，6 mg·kg-1·d-1,n=8), and high dose of TWP group (H-TWP group，9 mg·kg-1·d-1,n=10) according to the random number table method. Ten healthy rats were used as control group. After 8 weeks of intervention, body weight(BW), kidney weight/body weight(KW/BW), urine microalbumin(UMA), blood glucose, liver function and renal function were examined. HE staining was used to observe the changes of kidney morphology. Immunohistochemical method, q-PCR and Western blotting were used to analyze the location and expression level of nuclear factor-κB, intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) and interleukin-6(IL-6). The effects of different doses of TWP on the expression of nuclear factor-κB, ICAM-1 and IL-6 in rats with DN.ResultsTWP therapy decreased UMA but did not affect BW, KW/BW, liver function and renal function. TWP also down-regulated the expression of nuclear factor-κB,ICAM-1,IL-6 mRNA (tNuclear factor-κB=8.89-16.88,tICAM-1=9.56-11.67,tIL-6=10.16-25.78, allP<0.05) as well as the protein level (tNuclear factor-κB=9.87-17.38,tICAM-1=8.54-16.95,tIL-6=9.76-20.18, allP<0.05) in dose-dependent manner; the effects were robust in L-TWP and H-TWP group (allP<0.05).ConclusionTWP suppresses inflammatory signaling pathways of nuclear factor-κB in a dose-dependent manner.

Triperygium wilfordii polyglucoside；Diabetic nephropathy; Nuclear factor-κB；Intercellular adhesion molecule-1；Interleukin-6

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81273915)；天津市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(14JCYBJC26200)

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2016.02.008

300070 天津醫(yī)科大學(xué)(楊薇)；300070 天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院糖尿病腎病科，衛(wèi)生部激素與發(fā)

育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(李春君，孫蓓，厲莉，王珊珊，郭欣，張曉娜，馬澤軍，陳莉明)

陳莉明，Email:xfx22081@vip.163.com

FundprogramNational Natural Science Foundation(81273915); Natural Science Foundation of Tianjin(14JCYBJC26200)

2016-07-09)