惡性瘧原蟲(chóng)SURFIN4.1蛋白氨基端在介導(dǎo)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中作用機(jī)制的研究

梁怡凡， 何 洋， 曹雅明， 朱曉彤*

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110122；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110122)

惡性瘧原蟲(chóng)SURFIN4.1蛋白氨基端在介導(dǎo)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中作用機(jī)制的研究

梁怡凡1， 何 洋2， 曹雅明2， 朱曉彤2*

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110122；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110122)

惡性瘧原蟲(chóng)；SURFIN4.1；輸出蛋白；PNEPs

全球范圍內(nèi)有效的瘧疾防控措施已使瘧疾致死率在過(guò)去20年中下降40%，然而瘧疾作為世界范圍內(nèi)主要傳染性病原體，仍有3.1億人口受其感染威脅，每年200萬(wàn)人感染，100萬(wàn)人(86%為非洲地區(qū)5歲以下兒童)死亡[1]。近年，瘧疾流行區(qū)青蒿素耐藥蟲(chóng)株的出現(xiàn)和擴(kuò)散，使瘧疾的防治面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[2]。因此，開(kāi)發(fā)新型有效的瘧疾防控手段是瘧疾防治的當(dāng)務(wù)之急。惡性瘧原蟲(chóng)為主要致死性瘧原蟲(chóng)，其致病性與瘧原蟲(chóng)感染紅細(xì)胞(parasite infected red blood cells，pRBCs)的黏附性增強(qiáng)相關(guān)。pRBCs可黏附于胎盤(pán)、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板和未感染紅細(xì)胞，導(dǎo)致腦瘧和胎盤(pán)瘧疾等嚴(yán)重致死性并發(fā)癥[3]。惡性瘧原蟲(chóng)侵襲紅細(xì)胞后向pRBCs胞漿輸出上百種原蟲(chóng)蛋白，如KAHRP、PfEMP1、RIFIN和STEVORs等，上述表面定位蛋白與pRBCs黏附性增強(qiáng)密切相關(guān)[4-5]。茂氏點(diǎn)(Maurer’s clefts, MCs)是pRBCs胞漿中輸出蛋白運(yùn)輸?shù)摹爸修D(zhuǎn)站”[6]。同時(shí)，MCs定位蛋白如SBP1、MAHRP1、MAHRP2、REX1和REX2在原蟲(chóng)pRBCs表面黏附性相關(guān)致病蛋白如PfEMP1蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7-8]。惡性瘧蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，500多種瘧原蟲(chóng)外輸出蛋白的氨基端(N端)均含有5個(gè)氨基酸“RxLxE/Q/D”組成的輸出序列——PEXEL(PlasmodiumEXportELement)[9]。同時(shí)，惡性瘧輸出蛋白質(zhì)組中也存在一系列N端不含PEXEL序列的蛋白，即PNEPs(PEXEL-negative exported proteins)，包含已知的MCs定位蛋白。上述PNEPs輸出蛋白N端序列包含跨納蟲(chóng)胞膜(Parasitophorous vacuole membrane, PVM)轉(zhuǎn)運(yùn)至MCs的部分轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)，但其作用機(jī)制尚不明確。SURFIN4.1蛋白為MCs定位的瘧原蟲(chóng)輸出蛋白，其N(xiāo)端不含PEXEL序列，屬于PNEPs蛋白成員，由surf基因家族(surface-associated interspersed genes,surfgenes)編碼[10]。前期研究發(fā)現(xiàn)，SURFIN4.1蛋白N端50個(gè)氨基酸內(nèi)含兩個(gè)功能相同的轉(zhuǎn)運(yùn)序列，與其跨膜區(qū)和胞內(nèi)尾共同作用可介導(dǎo)SURFIN4.1蛋白經(jīng)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體經(jīng)典轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，跨PVM轉(zhuǎn)運(yùn)至MCs[10]。然而SURFIN4.1蛋白N端在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的作用方式和特點(diǎn)尚不明確。本研究旨在探討SURFIN4.1蛋白N端在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的特性和作用，從而探討PNEPs蛋白在惡性瘧中普遍機(jī)制，進(jìn)而為有效瘧疾疫苗的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.2 惡性瘧原蟲(chóng)株 惡性瘧原蟲(chóng)MS822株由日本長(zhǎng)崎大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所中澤秀介教授惠贈(zèng)。

1.1.3 主要試劑和儀器 RPMI 1640(Invitrogen)、AlbumaxI(Invitrogen)，10 μg/mL慶大霉素(Invitrogen)、次黃嘌呤(Sigma)、Incomplete Cytomix(120 mmol/L KCl、0.15 mmol/L CaCl2、2 mmol/L EGTA、5 mmol/L MgCl2、10 mmol/L K2HPO4/KH2PO4和25 mmol/L HEPES)由本室配制，限制性內(nèi)切酶MluI、EcoRV、EcoRI、PstI(NEB)、MultiSite Gateway technology(Invitrogen)、LB broth(GIBCO)、快速質(zhì)粒小提試劑盒(DP105，TIANGEN)、Q5?Site-Directed Mutagenesis Kit (NEB)、PierceTMCrosslink IP 試劑盒(ThermoFisher Scientific)、鼠抗GFP單克隆抗體(Abcam)、anti-cMyc抗體(Abcam)，兔抗PfEXP2抗體和兔抗PfSBP1抗體由愛(ài)媛大學(xué)無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)中心坪井教授饋贈(zèng)，ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司，WR99210(Sigma-Aldrich)，Gene PulserXcell電穿孔儀(Bio-Rad)，電轉(zhuǎn)杯(Bio-Rad)。

1.2 方法

2 結(jié)果與分析

圖和質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.1 Restriction enzyme digestion of plasmids and 載體EcoRV和MluI雙酶切鑒定，克隆 #1～#3，4～7：空；載體EcoRI和PstI雙酶切鑒定，克隆 #1～#4;M1:10 000 bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；M2:2 000 bp DNA分子標(biāo)準(zhǔn)A:Restriction enzyme digestion of plasmid with EcoRV and clone #1-#3,4-7:Blank;B:Restriction enzyme digestion of plasmid with EcoRI and clone #1-#4;M1:10 000 bp DNA marker; M2:2 000 bp DNA marker

圖重組蛋白在惡性瘧原蟲(chóng)的定位分析Fig.2 The location analysis of recombinant in Plasmodium falciparum重組蛋白結(jié)構(gòu)示意圖；B:重組蛋白熒光定位結(jié)果。DIC: 微差干涉反對(duì)，Nue: 細(xì)胞核，anti-Myc：抗Myc標(biāo)簽抗體，anti-EXP2：抗納蟲(chóng)胞膜(PVM)抗體，anti-SBP1：茂氏點(diǎn)(MCs)定位蛋白檢測(cè)抗體，anti-GFP：抗GFP抗體檢測(cè)重組蛋白熒光定位，Merge：熒光融合后圖片A:Schematic drawings of recombinant ；B:Representative fluorescence images showing the localization of recombinant . The differential interference contrast (DIC),fluorescence image with nucleus stain (Nue)，anti-Myc tagantibody,anti-EXP2：PVM marker, anti-SBP1: Maurer’s cleft detection antibody， anti-GFP: anti-GFP antibody detection of fluorescence signals for recombinant protein location,Merge: merge images

圖重組蛋白的可溶性分析Fig.3 Solubility analysis of recombinant proteinA:對(duì)比分析和重組蛋白的可溶性差異。Tris：0.01 mol/L Tris,Na2：0.1 mol/L Na2CO3,Tx-100：0.1% Triton-X-100,SDS：2% SDS,箭頭所示為目的蛋白條帶和重組蛋白Western Blot 結(jié)果灰度分析A:The comparison of protein solubility between recombinant (2MycN-T-C) and (N-T-C).Tris: 0.01mol/L Tris, Na2:0.1 mol/L Na2CO3, Tx-100: 0.1% Triton-X-100, SDS: 2% SDS, The arrow indicates the target recombinant protein;B:Signal intensity analysis of recombinant (2MycN-T-C) and (N-T-C)’s Western blot results

2.4 Co-IP和LC-MS/MS試驗(yàn)檢測(cè)與SURFIN4.1蛋白N端的相互作用蛋白

表1 SURFIN4.1重組蛋白N端相互作用蛋白LC-MS/MS結(jié)果分析

采用MS822野生株作為對(duì)照的Co-IP和LC-MS/MS分析結(jié)果顯示，SURFIN4.1蛋白N端與茂氏點(diǎn)定位蛋白膜相關(guān)聯(lián)組氨酸富含蛋白(membrane associated histidine-rich protein, MAHRP-1)相互作用。同時(shí)，SURFIN4.1蛋白N端與pRBCs表面蛋白PIESP2，Early transcribed membrane protein 10.2和Pf113，棒狀體頸部蛋白R(shí)AP3，惡性瘧原蟲(chóng)PVM轉(zhuǎn)運(yùn)子PTEX復(fù)合體成員-EXP2，伴侶蛋白HSP60相互作用(表1)。

3 討 論

惡性瘧原蟲(chóng)侵襲后向pRBCs胞漿輸出的大量原蟲(chóng)蛋白為其紅內(nèi)期生長(zhǎng)和發(fā)育提供基礎(chǔ)。盡管大部分輸出蛋白N端含PEXEL(PEXEL positive proteins)跨PVM膜轉(zhuǎn)運(yùn)序列，仍有一些惡性瘧致病性相關(guān)輸出蛋白屬于PNEPs(PEXEL negative proteins)蛋白家族，如MCs定位的I型跨膜蛋白-SURFIN4.1。因此，本研究旨在通過(guò)分析SURFIN4.1蛋白氨基端(N端)在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的作用機(jī)制及其伴侶蛋白，為PNEPs蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

早期研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的瘧原蟲(chóng)天冬氨酸蛋白酶-plasmepsinV可水解輸出蛋白N端的PEXEL序列，并乙酰化水解后殘端“xE/Q/D”，進(jìn)而介導(dǎo)輸出蛋白穿越PVM上的PTEX轉(zhuǎn)運(yùn)子進(jìn)入pRBCs胞漿[11-12]。本研究中，間接免疫熒光共定位研究結(jié)果顯示，與含PEXEL序列的輸出蛋白不同，SURFIN4.1蛋白的N端在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中不經(jīng)過(guò)進(jìn)一步水解，即N端不斷裂。這一結(jié)果與PfSBP1在惡性瘧轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的研究結(jié)果一致[13]，提示此機(jī)制可能普遍存在于PNEPs蛋白。

本研究首次檢測(cè)了惡性瘧原蟲(chóng)茂氏點(diǎn)定位蛋白SURFIN4.1蛋白N端在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的特性和其相互作用蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SURFIN4.1蛋白N端在轉(zhuǎn)運(yùn)中不經(jīng)過(guò)水解過(guò)程，且在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中與PVM轉(zhuǎn)運(yùn)子成員-EXP2、MCs定位蛋白、棒狀體蛋白和多種pRBCs表面表達(dá)蛋白相互作用。本研究為惡性瘧原蟲(chóng)PNEPs蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

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Functional Mechanism ofPlasmodiumfalciparumSURFIN4.1 Protein Amino (N) Terminal during Media-Induced Protein Transshipment

LIANG Yi-fan1, HE Yang2, CAO Ya-ming2, ZHU Xiao-tong2

(1. 98K7-Y-ProgramofReg.-and-Mast.Cont.Student,ChinaMed.Uni.,Shenyang110122; 2.Teach. &Res.Div.ofImmun.,Coll.ofBasicMed.Sci.,ChinaMed.Uni.,Shenyang110122)

Plasmodiumfalciparum; SURFIN4.1；exported protein; PNEPs

國(guó)家自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目(81301455)

梁怡凡 女，七年制在讀。主要研究方向?yàn)榭垢腥久庖?。E-mail：619752627@qq.com

* 通訊作者。女,副教授，博士，碩士生導(dǎo)師。主要研究方向?yàn)榭垢腥久庖?。E-mail: xtzhu@cmu.edu.cn

2016-08-25；

2016-09-03

Q939.93;R382.3+1

A

1005-7021(2016)06-0076-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.06.013