高鹽含油廢水中微生物篩選及系統(tǒng)發(fā)育研究

鄭 剛， 楊志堅， 董博林， 陳作國， 張心齊， 吳 敏*

(1.浙江大學(xué) 舟山海洋研究中心, 浙江 舟山 316021; 2.浙江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 杭州 310058;3.浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)院, 浙江 杭州 310058; 4.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院, 浙江 臨安 311300)

高鹽含油廢水中微生物篩選及系統(tǒng)發(fā)育研究

鄭 剛1， 楊志堅2， 董博林2， 陳作國3， 張心齊4， 吳 敏2*

(1.浙江大學(xué) 舟山海洋研究中心, 浙江 舟山 316021; 2.浙江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 杭州 310058;3.浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)院, 浙江 杭州 310058; 4.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院, 浙江 臨安 311300)

對舟山港口的油輪沖洗水樣品嗜鹽微生物進(jìn)行篩選，得到7株菌株，其中DG30-2b、T37-2b和DG30-3b對體積分?jǐn)?shù)為1.0%的稠油降解效果較好，降解率分別為28.5%、24.1% 和 18.7%。這3株菌分別為Bacilluscereus(蠟狀芽胞桿菌)、Lysinibacillusxylanilyticus(木糖短小芽胞桿菌) 和Thaueraaminoaro-matica(氨基脂陶厄氏菌)。對這3株菌進(jìn)行了降解條件優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)其在原油中的最適降解溫度均為30 ℃，最適pH為7.0，最適原油降解濃度為體積分?jǐn)?shù)0.5%。菌株DG30-2b和T37-2b的最適降解鹽度均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%，而菌株DG30-3b最適降解鹽度為質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.0%。將該3株菌按照體積比1∶1∶1混合后組成DGT菌群，對體積分?jǐn)?shù)為1.0%的石油污染的土壤進(jìn)行處理，并進(jìn)行GC/MS色譜測定后，對污染物的遷移規(guī)律做了初步分析，結(jié)果顯示C25以上的烷烴含量降低，C18左右的烷烴含量增多，表明菌群DGT有較好的降解效果，具有將長鏈烷烴降解為短鏈烷烴的能力。

高鹽廢水；嗜鹽微生物；系統(tǒng)發(fā)育分析；石油降解；污染物遷移

油輪是海上運輸石油的大型運輸設(shè)備，長期使用后油艙中會沉積大量原油污垢沉渣，通常使用含有洗滌液的熱海水對油渣進(jìn)行沖洗，使油渣受熱熔化并被清洗掉。但是，這樣會使油污中含有大量鹽分，鹽分可達(dá)15 000～45 000 mg/L。油污中含有的酸、硫化物等化學(xué)物質(zhì)都有一定的毒性和腐蝕性，如不作處理將其排入江河湖?；蜣r(nóng)田，對人和動、植物將產(chǎn)生危害，嚴(yán)重時可引起生物體中毒甚至死亡。石油是一種復(fù)雜的多組分均質(zhì)混合物，主要成分有烷烴、環(huán)烷烴和芳香烴，還有數(shù)量不多但很重要的非烴組分[1]，普通處理難度很大。在高鹽油污廢水的處理中，由于物理和化學(xué)方法具有處理不徹底、費用較高、容易造成二次污染等缺點，難以在實際處理中推廣，而經(jīng)濟(jì)、高效、安全且環(huán)保的生物處理技術(shù)為這一問題的解決提供了可能。嗜鹽菌是一類生長在高鹽環(huán)境下的微生物。由于獨特的生理性質(zhì)，嗜鹽菌在生物進(jìn)化和遺傳研究方面具有較高的研究價值，其功能酶具有極高的鹽耐受性、較高的熱耐受性和對有機(jī)溶劑的抗性。因此，嗜鹽菌在工業(yè)生產(chǎn)中有著廣泛的應(yīng)用前景，也成為近幾年研究的熱點[2-5]。 目前對油井、油田的采油廢水和污泥研究較多，但對海岸港口的油輪沖洗水后產(chǎn)生的含鹽含油污泥污染研究較少。其中分離到的常見的能夠降解石油烴的細(xì)菌種類涉及假單胞菌菌屬(Pseudomonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、食烷菌(Alcanivorax)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、芽胞桿菌屬(Bacillus)等，其中最常見的是假單胞菌類的細(xì)菌，可對短鏈、長鏈烷烴及芳香烴降解[6]。Mnif等[7]從油田采出水中分離得到l株耐鹽細(xì)菌Halomonassp. C2SS100，可以很好地降解正十六烷。Kapley等[8]將PseudomonasNCC. DSS6、PseudomonasNCC. DSS8、PseudomonasNCC. GSS3和Pseudomonasputida四株菌組成了混合菌，可利用原油不同的組分，在鹽度為3.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時接種48 h長勢良好。王春艷等[9]從大連石化隔油池污水中分離、純化出一株以柴油為唯一碳源的石油降解菌PseudomonsaeruginosaDW-1, 其最適生長鹽度為3.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))；汪杰等[10]從山東勝利油田、新疆克拉瑪依油田和陜西長慶油田三處的石油污染土壤中富集純化出3株高效的石油降解菌，WTS為檸檬酸桿菌(Citrobactersp.)，H4-1為木糖氧化產(chǎn)堿菌(Alcaligenesxylosoxydans) , Z3-P為芽胞桿菌(Bacillussp.)。本研究針對舟山港口油輪沖洗水產(chǎn)生的污泥含鹽含油的特點，篩選了高效嗜鹽石油降解菌，并初步建立了一個混合菌群，對污泥中污染物的遷移規(guī)律進(jìn)行了研究，以期為大規(guī)模含鹽含油污泥處理提供經(jīng)濟(jì)上合理、技術(shù)上可行的修復(fù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 油污廢水與污泥，取自舟山碼頭油輪沖洗水，其鹽度為3.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①富集培養(yǎng)基：酵母提取物 1 g，蛋白胨 5 g，尿素 1.6 g，磷酸氫二鉀 8 g，原油 10 g，海水1 000 mL，pH (7.0±0.5)；②篩選培養(yǎng)基：硝酸鈉1.5 g，硝酸銨1.5 g，七水磷酸氫二鉀1 g，七水硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，七水硫酸鐵0.01 g，氯化鈣0.002 g，酵母提取物1.5 g，氯化鈉30 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2，固體培養(yǎng)基加入20 g的瓊脂粉；③LB培養(yǎng)基；④原油降解培養(yǎng)基 (g/L)：磷酸氫二鉀5，硫酸銨1，硫酸鎂0.25，硝酸鈉2，氯化鈉5，三水磷酸氫二鉀1，原油10，pH 7.0。

1.1.3 主要儀器 PCR儀(A300，LongGene)，凝膠成像儀(BIO-BEST 300，Bio-Best)，高壓蒸汽滅菌鍋(BA-30，BIM)，快速溶劑萃取儀(APLE-3000，北京吉天)，氣相色譜質(zhì)譜(6890N-5973，Agilent)。

1.2 方法

1.2.1 樣品獲得 樣品采自舟山碼頭油輪清洗后產(chǎn)生的油污廢水與污泥，該地點的油污廢水與污泥具有鹽度大(鹽度為3.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)))、含油比例高的特點。油污廢水取自污染水體靜水層，取樣量為500 mL；污泥取自污染水體油污泥表層，取樣深度為0～5 cm，取樣量為0.5～1 kg。所有樣品均采用無菌器皿采集以避免二次污染。樣品采集結(jié)束后均在24 h內(nèi)進(jìn)行富集培養(yǎng)或置于4 ℃冰箱密封保存。

1.2.2 菌群富集純化 取10 mL混合均勻后的油污廢水和0.5 g 污泥樣品置于500 mL富集培養(yǎng)基中，25 ℃，140 r/min培養(yǎng)24 h，之后按上述方式繼續(xù)加入油污廢水和污泥樣品，25 ℃，140 r/min培養(yǎng)24 h，如此反復(fù)3次即得到實驗所需富集液。 取100 mL富集液經(jīng)0. 22 μm醋酸纖維素濾膜過濾收集富集液中的細(xì)菌，反復(fù)過濾3次以確保細(xì)菌的收集量，之后將濾膜投入裝有100 mL液體篩選培養(yǎng)基的250 mL的錐形瓶中，搖床37 ℃，140 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。將培養(yǎng)過的菌液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7濃度梯度進(jìn)行稀釋，取各個梯度的菌液100 μL涂布于篩選培養(yǎng)基平板，37 ℃光照培養(yǎng)。待菌落長出后，挑取單菌落反復(fù)劃線純化直至獲得純菌。觀察其菌落形態(tài)并挑入試管劃斜面，液蠟保存[11]，并對得到的純菌種進(jìn)行革蘭染色[12]。

1.2.3 油污降解實驗及降解率的測定 將保藏菌株分別接種到LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，OD600檢測菌液吸光度到0.3時，即菌株處于對數(shù)生長期時取3 mL菌懸液接入100 mL原油降解培養(yǎng)基中，以無菌的3 mL LB液態(tài)培養(yǎng)基接入100 mL原油降解培養(yǎng)基中作為對照，于30 ℃、200 r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)7 d。將各組培養(yǎng)液經(jīng)快速溶劑萃取儀萃取后，萃取液過柱得濾出液，濾出液采用紅外分光光度法，測定各原油濃度，每個處理重復(fù)測定3次[13-14]。菌株的原油降解率(%)=(對照原油質(zhì)量濃度-殘余原油質(zhì)量濃度)/對照原油質(zhì)量濃度×100[15]。

1.2.4 DNA的抽提與16S rDNA的擴(kuò)增 取對數(shù)期的菌液1 mL, 離心1 min, 棄上清；加入500 μL GTE溶液振蕩混勻后，加入5 μL 100 mg/mL溶菌酶混勻，37 ℃溫浴30 min ；再加入5 μL 10 mg/L蛋白酶K，55 ℃溫浴1 h, 加入1 510 μL的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)溶液，上下顛倒混勻，12 000 r/min離心5 min ；取上清用等體積的氯仿/異戊醇抽提一次，取上清于新的離心管，加入等同于1/10上清液體積的乙酸鈉(3 mol/L)，2倍體積的無水乙醇混勻，-20 ℃靜置沉淀DNA，4 ℃、12 000 r/min離心10 min, 去掉乙醇，晾干，用50 μL無菌水溶解。采用細(xì)菌16S rDNA通用引物(27F:5′-AGAGTTGTCATGGCTC-3′和1492R:5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′) 進(jìn)行PCR, PCR反應(yīng)體系為50 μL, PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 75 s，30個循環(huán)，72 ℃ 10 min。擴(kuò)增結(jié)果用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。DNA抽提和擴(kuò)增方法具體步驟見文獻(xiàn)[16].

1.2.5 擴(kuò)增產(chǎn)物的純化、克隆和測序 PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳(1%瓊脂糖凝膠、0.5×TAE緩沖液、140 V電泳20 min)確認(rèn)后，用UNIQ-10柱PCR產(chǎn)物純化試劑盒(上海生工)進(jìn)行純化。PCR產(chǎn)物純化后再采用T/A克隆法，即將PCR純化產(chǎn)物連接到pMD19-T質(zhì)粒(TAKARA公司)上。先連接PCR產(chǎn)物到質(zhì)粒上，質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞活化30 min后，在加有氨芐青霉素、X-gal、IPTG的LB板上涂布，挑選陽性克隆，菌落PCR或者抽質(zhì)粒PCR確認(rèn)重組質(zhì)粒，然后送至北京諾賽基因組研究中心測序。所用測序引物為M13-47、RV-M或者M(jìn)13-48。

1.2.6 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 各菌株的16S rDNA序列用GenBank數(shù)據(jù)庫中的Blastn做比較，并從該數(shù)據(jù)庫中獲取參比菌株的16S rDNA序列，并采用軟件Clustal X 1.8進(jìn)行多序列比對及匹配排列，采用軟件Mega 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過序列數(shù)據(jù)計算矩陣距離，采用Neighbor-joining算法，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹估算，重復(fù)數(shù)為1 000，計算各分支的置信度[17]。

1.2.7 GC/MS色譜分析 分別取未經(jīng)菌株處理及經(jīng)過菌株處理后的原油樣品各1 μL進(jìn)行GC/MS色譜分析。彈性石英毛細(xì)管色譜柱；程序升溫(初始溫度80 ℃保持4 min，以5 ℃/min升至250 ℃保持20 min,再以10 ℃/min升溫至280 ℃，保持10 min)；不分流進(jìn)樣；載氣：He, 1 mL/min。質(zhì)譜條件:離子源為EI源，其溫度為230 ℃，電子轟擊能量為70 eV; 掃描范圍15～500 amu[18-19]。

1.2.8 降解條件優(yōu)化 ①溫度：將篩選得到的石油降解菌株接種于原油降解培養(yǎng)基中，分別置于25、30、35和40 ℃條件下，均做3個平行，200 r/min振蕩培養(yǎng)7 d后，測定各菌株的生長情況，測定對原油的降解率。②pH：將菌懸液接種到pH為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的原油降解培養(yǎng)基中，均做3個平行，30 ℃、200 r/min下振蕩培養(yǎng)，觀察菌株生長情況，測定對原油的降解率。③鹽度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))：將菌懸液接種到NaCl濃度分別為3.0%、5.0%、10.0%、15.0%、20.0%、25.0%和30.0%的原油降解培養(yǎng)基中，均做3個平行，30 ℃、200 r/min下振蕩培養(yǎng)，觀察各菌株的生長情況，測定對原油的降解率。④原油的最適降解濃度(體積比)：將菌懸液接種到原油濃度分別為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的原油降解培養(yǎng)基中，均做3個平行，30 ℃、200 r/min下振蕩培養(yǎng)，觀察各菌株的生長情況，測定對原油的降解率。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離

油污廢水與污泥經(jīng)過富集、篩選分離后得到7株菌株。分離的這7株菌的菌落多為乳白或米白色，圓形，邊緣平滑或不規(guī)則，表面光滑或毛質(zhì)。多數(shù)菌1～2 d可形成肉眼可見的菌落，少數(shù)菌需培養(yǎng)5～7 d才呈現(xiàn)出肉眼可見的菌落，菌落特征見表1。

表1 部分菌株的形態(tài)及生化特征

2.2 油污降解效果

將分離到的7株菌株進(jìn)行油污降解實驗，經(jīng)過3 d的降解，測定各自的原油降解率后發(fā)現(xiàn)，這7株菌對原油的降解效率明顯不同。其中菌株DG30-2b、T37-2b和DG30-3b的原油降解效率較高，降解率分別為28.5%、24.1%和18.7%。菌株DG37-2c、N30-2a、T30-2d、N37-2d(2)的原油降解效率較低。

圖1 分離菌株3 d后對體積分?jǐn)?shù)1.0%稠油降解率的測定結(jié)果Fig.1 The degradation rate of the isolated strains with 1.0% (v/v) heavy oil after 3 days

2.3 序列比對、系統(tǒng)發(fā)育分析及相關(guān)菌株介紹

將得到的7株菌在GenBank上進(jìn)行16S rDNA序列比對(見表2)，結(jié)果顯示7株菌株分別屬于Bacillus、Lysinibacillus、Brevibacillus和Thauera屬。從序列比對上看，效果較好的菌株DG30-2b、T37-2b和DG30-3b分別為Bacilluscereus、Lysinibacillusxylanilyticus和Thaueraaminoaromatica。

表2 有效序列比對結(jié)果

針對降解效果較好的BacilluscereusDG30-2b (B.cereusDG30-2b)、LysinibacillusxylanilyticusT37-2b (L.xylanilyticusT37-2b) 和ThaueraaminoaromaticaDG30-3b (T.aminoaromaticaDG30-3b)進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。通過Blastn比對獲取相近屬和種的標(biāo)準(zhǔn)菌株的有效序列，以其為基礎(chǔ)，用MEGA 5.0軟件構(gòu)建鄰位相連法(Neighbor-Joining)系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2。

圖2 菌株B. cereus DG30-2b、T. aminoaromatica DG30-3b和L. xylanilyticus T37-2b系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of B. cereus DG30-2b、T. aminoaromatica DG30-3b and L. xylanilyticus T37-2b

從圖2可以看出，3株菌株中，B.cereusDG30-2b和L.xylanilyticusT37-2b親緣關(guān)系相對較近，這兩株菌分離自油污廢水和污泥。3株菌的相關(guān)信息如下。

蠟質(zhì)芽胞桿菌Bacilluscereus屬于芽胞桿菌屬，陳愛輝等[20]分離出的一株降解硝基苯的優(yōu)勢菌，菌種投加量為12.97%，培養(yǎng)溫度 29.4 ℃，pH 7.1，在此條件下硝基苯的理論預(yù)測降解率為91.14%。伍曉林[21]以蠟狀芽胞桿菌(Bacilluscereus) HP為研究對象,針對大慶油田的油層物化環(huán)境,研究了微生物采油(Microbial Enhanced Oil Recovery, MEOR)的基本原理和驅(qū)油機(jī)制,并通過礦場試驗驗證了該方法的推廣應(yīng)用。候兆偉等[22]申請授權(quán)一種新的BacilluscereusHP能有效改善原油的性質(zhì)。解木糖賴氨酸芽胞桿菌Lysinibacillusxylanilyticus屬于賴氨酸芽胞桿菌屬，由Chang等[23]從森林腐殖質(zhì)中分離，該菌株可降解木聚糖，可利用阿拉伯糖、檸檬酸鹽、麥芽糖、鼠李糖、蜜二糖、山梨醇、蔗糖、木糖等。車建美等[24]篩選到Lysinibacillusxylanilyticus可以產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)抑制枇杷炭疽病菌。Thaueraaminoaromatica屬于陶厄氏菌屬，最初由Mechichi等[25]報道，該菌株可在芳香族化合物如2-氨基苯甲酸、芳香族氨基酸下生長，在缺氧條件，苯甲酸、2-羥基苯甲酸、3-羥基苯甲酸、2-氨基苯甲酸、2-氟苯甲酸、甲苯、乙酸鹽、琥珀酸鹽等物質(zhì)都可以被利用。Thauera屬細(xì)菌在廢水處理系統(tǒng)中有重要意義,是具有多種芳香族污染物降解能力的重要功能類群[26]。

2.4 降解條件優(yōu)化結(jié)果

分別探究菌株B.cereusDG30-2b、T.aminoaromaticaDG30-3b和L.xylanilyticusT37-2b對原油降解最佳的溫度、pH、鹽度及原油濃度條件，降解情況及條件見圖3～6及表3。

圖3 菌株B. cereus DG30-2b、T. aminoaromatica DG30-3b和L. xylanilyticus T37-2b對體積分?jǐn)?shù)1.0% 原油的最適降解溫度的結(jié)果Fig.3 The result of optimum degradation temperature of strain B. cereus DG30-2b、T. aminoaromatica DG30-3b and L. xylanilyticus T37-2b with 1.0% (v/v) heavy oil

圖4 菌株B. cereus DG30-2b、T. aminoaromatica DG30-3b和L. xylanilyticus T37-2b對體積分?jǐn)?shù)1.0% 原油的最適降解pH的結(jié)果Fig.4 The result of optimum degradation pH of strain B. cereus DG30-2b、T. aminoaromatica DG30-3b and L. xylanilyticus T37-2b with 1.0% (v/v) heavy oil

圖5 菌株B. cereus DG30-2b、T. aminoaromatica DG30-3b和L. xylanilyticus T37-2b對體積分?jǐn)?shù)1.0%原油的最適降解鹽度的結(jié)果Fig.5 The result of optimum degradation salinity of strain B. cereus DG30-2b、T. aminoaromatica DG30-3b and L. xylanilyticus T37-2b with 1.0% (v/v) heavy oil

表3 菌株B. cereus DG30-2b、T. aminoaromatica DG30-3b和 L. xylanilyticus T37-2b的降解條件的優(yōu)化

結(jié)果顯示，菌株B.cereusDG30-2b、T.aminoaromaticaDG30-3b和L.xylanilyticusT37-2b對原油的最適降解溫度均為30 ℃，最適降解pH為7.0，最適的原油降解體積分?jǐn)?shù)為0.5%。菌株B.cereusDG30-2b和L.xylanilyticusT37-2b的最適降解鹽度均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%，而菌株T.aminoaromaticaDG30-3b最適降解鹽度為3.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

2.5 降解產(chǎn)物歸宿

三種降解效果較好的菌株B.cereusDG30-2b、T.aminoaromaticaDG30-3b和L.xylanilyticusT37-2b，待其生長至OD600值為0.3左右時，按照體積比1∶1∶1混合后組成DGT菌群，放置于體積分?jǐn)?shù)為1.0%的石油污染土壤中。在模擬海浪拍打及光照的裝置中，模擬兩周后取出土壤，進(jìn)行GC/MS色譜測定，結(jié)果見圖7。

圖7 DGT菌群降解1%含油量的土壤中污染物GC/MS色譜圖Fig.7 GC/MS chromatogram of the DGT flora degrading pollutants in soil which contains 1% oil

從圖7結(jié)果可見，C25以上的含量降低，C18左右的含量增多，明顯地呈現(xiàn)出長碳鏈降解為較短碳鏈的特征。在降解后的產(chǎn)物中，以C16、C18為主。從而可以得出菌群DGT具有較好的降解效果。

3 討 論

嗜鹽菌目前仍是研究的熱點，嗜鹽菌中具有特殊的功能酶基團(tuán)[27-30]。從嗜鹽菌中分離出的部分功能酶除了嗜鹽外，還表現(xiàn)出嗜(耐)熱性，甚至在沸水中煮數(shù)分鐘后仍可恢復(fù)活性[31]。目前已有一些主要的酶類從嗜鹽菌中分離出來并對其進(jìn)行了性質(zhì)研究[32-34]。本研究從含鹽含油樣品中分離出7株菌，其中3株效果較好。這幾株菌均從水樣中分離，其中T.aminoaromaticaDG30-3b和L.xylanilyticusT37-2b分別分離自舟山碼頭油輪沖洗水產(chǎn)生的油污廢水和污泥，石油降解效果最好的B.cereusDG30-2b在30 ℃、120 r/min搖床下培養(yǎng)，3 d后對體積分?jǐn)?shù)為1.0%的稠油降解效果達(dá)到了28.5%，并且對這3株菌的降解原油及鹽的條件進(jìn)行了優(yōu)化。

低硫高飽和烴的粗油最易降解，而高硫、高芳香烴類化合物的純油最難降解，所以目前對烴類化合物降解的研究主要集中在毒性較強(qiáng)的芳香族化合物。通過 GC-MS 圖譜分析也可以發(fā)現(xiàn)，污染物中高芳香烴類雖然有被降解的趨勢，但并未表現(xiàn)出很好的降解效果。對污染物的遷移規(guī)律做了初步的分析。初步認(rèn)定菌群DGT具有較好的石油降解效果，具有將長碳鏈烷烴降解為短碳鏈的能力。同時研究表明，非烴的降解率最低[35]，這也就造成了圖譜中降解產(chǎn)物大部分積聚于C20的區(qū)域內(nèi)。

張竹圓等研究了兩株河口濕地耐鹽石油降解菌的生物學(xué)特性及降解能力，分離出的一株菌在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%時仍然可以生長，對石油的降解率為20.9%；但是在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.0%時基本停止生長，基本喪失對石油的降解能力[36]。從實驗結(jié)果看，在鹽度為質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.0%的環(huán)境中，耐鹽菌B.cereusDG30-2b、L.xylanilyticusT37-2b和T.aminoaromaticaDG30-3b仍對石油表現(xiàn)出了不同的降解率，分別為28.5%、24.1%和18.7%。這說明，本研究中3種嗜鹽菌具有降解較高鹽度的含油廢水的能力。

目前對于耐鹽菌的研究，僅集中于鹽湖、腌制食物中，今后可以嘗試開辟新途徑，如高鹽生活廢水和工業(yè)廢水、中低度嗜鹽環(huán)境，不僅有益于研究環(huán)境微生物資源和生理代謝機(jī)制，而且可以為工業(yè)酶制劑的開發(fā)[32]、高含鹽水污染的治理等打下良好的基礎(chǔ)，如HalanaerobiaceaebacteriumSLA 1的發(fā)現(xiàn)用于研究砷的地球化學(xué)循環(huán)[33]，而Kapdan等[34]用Halanaerobiumlacusrosei來研究去除廢水COD等。同時還要開發(fā)嗜鹽厭氧微生物新資源，有助于了解不同生境中的嗜鹽微生物資源。

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Screening and Phylogenetic Studies of Halophiles in High Salinity Wastewater

ZHENG Gang1, YANG Zhi-jian2, DONG Bo-lin2, CHEN Zuo-guo3, ZHANG Xin-qi4,WU Min2

(1.OceanRes.Ctr.ofZhoushan,ZhejiangUni.,Zhoushan316021; 2.Coll.ofLifeSci.,ZhejiangUni.,Hangzhou310058; 3.Coll.ofChem. &Bio-Engin.,ZhejiangUni.,Hangzhou310058; 4.Schl.ofForest. &Bio-Tech.,ZhejiangA&FUni.,Lin’an311300)

Seven strains were screened and obtained from water sample of flashing sludge of oil tankers in Zhoushan port, among them strains DG30-2b, T37-2b, and DG30-3b had better degradation on 1.0% (v/v) thick oil with the rates at 28.5%, 24.1%, and 18.7% respectively. These three strains respectively belonged toBacilluscereus,Lysinbacillusxylanilyticus, andThaueraaminoaro-matica. The degradation conditions of these strains were optimized, the most suitable temperature to degrade crude oil was 30 ℃ with optimal pH at 7.0, and optimal crude oil concentration at 0.5% (v/v). And the optimal salinity of degradation of DG30-2b and T37-2b was 2.0% (w/v), while DG30-3b was 3.0% (w/v). When mixed these three strains with volume ratio at 1∶1∶1 to combine DGT bacterial group to treat 1.0% (v/v) oil polluted soil, and determined with GC/MS chromatography to analyze initially for the migrating law of the pollutant. The results showed that alkane of above C25 declined, however, alkane of about C18 increased, suggested that bacterial group of DGT had fine degradation effects, possessing the capability to degrade long chain alkane into short chain alkane.

salty wastewater; halophilic microorganisms; phylogenetic analysis; oil degradation; transport of pollutant

國家科技支撐計劃項目(2012BAB09B04)；舟山市科技計劃項目(2014C51022，2014C51020)

鄭剛 男，中級工程師，碩士。主要研究方向為環(huán)境生物技術(shù)。E-mail：zhenggang1029@163.com

* 通訊作者。男，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向為環(huán)境微生物的開發(fā)與應(yīng)用。E-mail: wumin@zju.edu.cn

2016-03-01；

2016-06-21

Q93

A

1005-7021(2016)06-0040-08

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.06.007