鎘脅迫下蛋白磷酸酯酶Msg5對MAPK蛋白激酶Slt2的調(diào)控

夏 婧， 蔣伶活

(江南大學生物工程學院 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122)

鎘脅迫下蛋白磷酸酯酶Msg5對MAPK蛋白激酶Slt2的調(diào)控

夏 婧， 蔣伶活*

(江南大學生物工程學院 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122)

鎘離子(Cd2+)是一種對人體具有致癌性的非必需金屬離子，能嚴重影響生物體的生長、發(fā)育和生殖。有絲分裂原蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)是調(diào)節(jié)細胞存活、增殖和分化中的重要信號分子。細胞壁完整性(Cell Wall Integrity，CWI)途徑是釀酒酵母細胞(Saccharomycescerevisiae)中的一個MAPK信號傳導途徑，參與鎘脅迫下的細胞應答。鎘脅迫導致CWI途徑的MAPK蛋白激酶Slt2激活并被磷酸化。在CWI途徑中，有4個蛋白磷酸酯酶Ptp2、Ptp3、Sdp1和Msg5可以調(diào)控Slt2的磷酸化和活性，但是它們在鎘脅迫條件下的功能未知。本研究通過同源重組的原理構(gòu)建了4個單基因缺失株之間的6個雙基因缺失株，利用倍比稀釋方法分析了這四個磷酸酯酶基因之間在鎘脅迫條件下的遺傳相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Msg5是鎘脅迫條件下調(diào)控Slt2的主要蛋白磷酸酯酶。

酵母細胞；MAP kinase；細胞壁完整性(CWI)途徑；磷酸酯酶；鎘脅迫

鎘是生物體的非必需金屬，可以通過飲食和吸煙攝入人體，危害人類健康[1]。世界衛(wèi)生組織確認了鎘對于公共健康的危害性[2]。鎘是一種對人體有致癌作用的嚴重的環(huán)境污染物，在國際癌癥研究機構(gòu)定義的I類人體致癌物中就有鎘[3]。另外，人體通過飲食等途徑長期、低劑量接觸鎘可能會導致心血管疾病的發(fā)生[4-5]。最近有研究表明，阿爾茨海默病和帕金森綜合癥等神經(jīng)性疾病的發(fā)生可能也與鎘有關[6-7]。細胞內(nèi)鎘離子(Cd2+)可以干擾多條信號傳導途徑[8]。有絲分裂原蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號轉(zhuǎn)導途徑是真核生物應答外界刺激的重要途徑之一[9-11]。在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)細胞中存在5個MAPK級聯(lián)系統(tǒng)[12]，其中細胞壁完整性(CWI)途徑包括細胞膜感受器Mid2、Wsc1、Wsc2、Wsc3、Hsc77，Slg1及其下游調(diào)節(jié)因子Rho1，蛋白激酶C(Pkc1)，MAPK級聯(lián)系統(tǒng)及其下游的效應器。其中，MAPK級聯(lián)系統(tǒng)包括 MAPK kinase kinase (Bck1)、MAPK kinase (Mkk1/2)和MAPK (Slt2，也稱為Mpk1)。蛋白激酶Pkc1磷酸化Bck1，進而激活Mkk1/2，最終使Slt2的Tyr192和Thr190位點被磷酸化而激活Slt2[13-14]。被磷酸化的Slt2通過激活轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生一系列細胞應答。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母細胞中CWI途徑參與了鎘脅迫下的細胞應答。鎘通過細胞膜上的感受器Mid2，將信號傳遞給調(diào)節(jié)因子Rho1，通過激活Pkc1進而激活Slt2[14-15]。在CWI途徑中Slt2的磷酸化除了受CWI途徑中的蛋白激酶調(diào)控外，還受到4個蛋白磷酸酯酶Ptp2、Ptp3、Sdp1和Msg5的調(diào)控[16]。本研究分析了鎘脅迫條件下這4個蛋白磷酸酯基因間的遺傳相互作用，發(fā)現(xiàn)Msg5是鎘脅迫條件下調(diào)控Slt2的主要蛋白磷酸酯酶。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 釀酒酵母菌株：野生型BY4741(MATahis3Δ1、leu2Δ0、met15Δ0、ura3Δ0)和BY4741為背景的酵母細胞單倍體單基因缺失株ptp2::kanMX4、ptp3::kanMX4、sdp1::kanMX4和msg5::kanMX4；質(zhì)粒：Y43由本實驗室保存。

1.1.2 引物實驗 所用引物見表1。

表1 實驗所用引物

1.1.3 培養(yǎng)基(質(zhì)量分數(shù)，%) LB培養(yǎng)基：蛋白胨1，酵母提取物0.5，NaCl 1。用1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0，定容，0.1 MPa壓力下滅菌20 min。配置固體培養(yǎng)基時加1.5%(質(zhì)量分數(shù))的瓊脂粉。YPD培養(yǎng)基：蛋白胨2，葡萄糖2，酵母提取物1，定容后0.1 MPa壓力下滅菌20 min，配置固體培養(yǎng)基時加入2%(質(zhì)量分數(shù))的瓊脂粉。

1.1.4 主要試劑 酵母敲除所用ssDNA、LiAc和PEG 3350等試劑購自Sigma公司；實驗所用藥物NAT和G418分別購自Werner BioAgents和上海生工；DNATaqpolymerase購自TransGene。

1.1.5 主要實驗儀器 PCR反應儀(德國艾本德公司)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(江蘇榮華儀器制造有限公司)、臺式冷凍離心機(日本日立公司)、立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 酵母細胞的敲除 挑取活化的酵母單菌落接種于3 mL YPD 液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)過夜至飽和。取500 μL過夜培養(yǎng)物接種到4.5 mL 2×YPD中，30 ℃培養(yǎng)3～4 h至對數(shù)期。將5 mL菌液分3管，室溫4 000 r/min離心1 min，棄上清，再用1 mL無菌水重懸并合并到1個EP管中，室溫4 000 r/min離心1 min。加100 μL 0.1 mol/L LiAc溶液混勻，12 000 r/min瞬時離心10 s收集菌體，再用100 μL 0.1 mol/L LiAc溶液洗一次。向細胞沉淀中依次加入240 μL 50%(質(zhì)量分數(shù))PEG，36 μL 1 mol/L LiAc，10 μL 10 mg/mL ssDNA，目的DNA(5～10 μg)，1 mL吸頭上下吸3～4次，渦旋充分混勻，置于30 ℃孵育30 min，42 ℃水浴熱激30 min。室溫4 000 r/min離心1 min收集菌體，用1 mL無菌水重懸菌體4 000 r/min離心1 min，棄上清，剩余100 μL水涂布到選擇性固體平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d，獲得酵母轉(zhuǎn)化子。

1.2.2 玻璃珠法提取釀酒酵母基因組DNA 挑取酵母單菌落接種于3 mL YPD 液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心1 min收集菌體(約30～50 μL)。加入和細胞體積相當?shù)乃嵝圆Ａе椋瑢⒓毎貞矣?00 μL STES溶液中，再加入200 μL氯仿和異戊醇的混合液(24∶1)。劇烈震蕩10×30 s，加入200 μL的TE，迅速混合，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。將上清轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL的離心管中，加入1/10體積的3.0 mol NaAc，2倍體積的無水乙醇，混勻后置于-80 ℃大約30 min，在4 ℃下12 000 r/min離心10 min，棄上清。加入500 μL的75%(體積分數(shù))的乙醇溶液后輕輕倒掉，將剩余的乙醇溶液用移液槍吸干凈，55 ℃干燥30 min，向離心管中加入50 μL 20 μg/mL RNase水，55 ℃消化30 min使沉淀溶解。瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 倍比稀釋法表型分析 在無菌超凈臺上準備5個滅過菌的離心管，依次標號為1、2、3、4、5號管。向2～4號離心管中加入450 μL無菌水，向1號離心管中加入500 μL細胞過夜培養(yǎng)物。從1號離心管中取50 μL加入到2號離心管中，置于渦懸器上混勻，立即取50 μL到3號離心管中，再混勻。依此類推，直至5號離心管，這樣菌液就被稀釋到10-4倍數(shù)。然后將這5個離心管依次排列，用移液器分別吸取2.5 μL點接到含有不同藥物的固體培養(yǎng)基平板上，點接之前先將平板標記好位置。要特別注意在點接過程中，每次拿起離心管，必須先渦懸混勻后再吸取菌液。點接完后，將平板倒置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4 d。

1.2.4 雙基因缺失株的構(gòu)建 以質(zhì)粒Y43為模板，用通用引物M13擴增出NAT敲除盒，在NAT敲除盒和KanMX4敲除盒的兩端有一段同源臂，因此利用NAT敲除盒在A::kanMX4基因缺失株中做敲除，這樣natMX4標記和kanMX4標記發(fā)生同源交換，獲得對NAT藥物耐受重組子A::natMX4，在YPD+100 μg/mL NAT培養(yǎng)基中涂板，30 ℃培養(yǎng)3 d，長出轉(zhuǎn)化子后提基因組進行驗證得到正確的重組子進行下一步實驗。以B::kanMX4基因缺失株為模板，用B基因的上下游引物擴出B基因的KanMX4敲除盒，用這個敲除盒在重組子A::natMX4中做敲除使KanMX4敲除盒與B基因發(fā)生同源交換，獲得對NAT藥物和G418藥物都耐受的重組子，在YPD+100 μg/mL NAT+150 μg/mL G418的培養(yǎng)基上涂板，30 ℃培養(yǎng)3 d，提基因組驗證，得到A::natMX4B::kanMX4雙基因缺失株(圖1)。

圖1 雙基因敲除策略Fig.1 The constructionstrategy of double-gene deletion mutants

2 結(jié)果與分析

2.1 雙基因缺失株的構(gòu)建及驗證

在釀酒酵母的細胞壁完整性(CWI)途徑中的Slt2受蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的雙重調(diào)控，其中調(diào)節(jié)Slt2的蛋白磷酸酯酶有Ptp2、Ptp3、Sdp1和Msg5。從單倍體單基因缺失株文庫(購自美國Invotrogen公司)中活化出這4個單基因缺失株ptp2::kanMX4、ptp3::kanMX4、sdp1::kanMX4、msg5::kanMX4，構(gòu)建它們之間的6個雙基因缺失株。首先需要驗證活化出的單倍體單基因缺失株的基因型，用基因的一端引物和KanMX4一端的引物來驗證?；蛐驼_則能擴增出條帶(圖2)。驗證基因型正確后，以Y43質(zhì)粒為模板，用通用引物M13來擴增出NAT敲除盒，利用1.2.1的方法在ptp2::kanMX4、ptp3::kanMX4、sdp1::kanMX4、msg5::kanMX4菌株中做敲除，使NAT敲除盒與KanMX4敲除盒發(fā)生同源交換，在YPD+100 μg/mL NAT培養(yǎng)基中長出單菌落后提基因組驗證。用4個基因各自的上下游引物進行PCR，ptp2::natMX4、ptp3::natMX4、sdp1::nat

MX4、msg5::natMX4正確的重組子能夠擴增出NAT敲除盒。分別以原始菌株ptp2::kanMX4、ptp3::kanMX4、sdp1::kanMX4、msg5::kanMX4的基因組為對照，擴增KanMX4敲除盒，NAT敲除盒和KanMX4敲除盒的大小不同，所以得到的條帶與對照大小不一的即為正確的重組子(圖3)。

圖2 基因缺失株的基因型驗證Fig.2 Genotype verification of gene gene deletion mutants從左到右4條泳道的擴增引物依次為KanMx4-F,PTP2-R；KanMx4-F,PTP3-R；KanMx4-F,SDP1-R和KanMx4-F,MSG5-RThe primers of lanes form left to right is KanMx4-F,PTP2-R；KanMx4-F,PTP3-R；KanMx4-F,SDP1-R and KanMx4-F,MSG5-R

圖3 NAT敲除盒與KanMX4敲除盒同源交換后的重組子的基因型驗證Fig.3 Genotype verification of recombinant after homologous crossoverNAT and KanMX4

然后，利用原始的單基因缺失株ptp2::kanMX4、ptp3::kanMX4、sdp1::kanMX4、msg5::kanMX4為模板擴增出各自的KanMX4的敲除盒，用KanMX4-ptp2、KanMX4-ptp3、KanMX4-sdp1、KanMX4-msg5來表示(圖4)。將KanMX4-ptp2敲除盒轉(zhuǎn)到ptp3::natMX4、sdp1::natMX4、msg5::natMX4菌株中，使KanMX4-ptp2敲除盒與PTP2基因發(fā)生同源交換，以敲掉PTP2。在YPD+100 μg/mL NAT+150 μg/mL G418的培養(yǎng)基上涂板，對于長出的重組子提基因組驗證，以野生型菌株BY4741做對照，用PTP2兩端的引物進行驗證。BY4741可以擴增出PTP2的ORF的大小，而正確的重組子ptp3::natMX4ptp2::kanMX4、sdp1::natMX4ptp2::kanMX4、msg5::natMX4ptp2::kanMX4可以擴出的條帶是KanMX4敲除盒的大小，可以得到帶有編號的重組子即為正確的(圖5A)。

同樣的方法，將KanMX4-ptp3敲除盒轉(zhuǎn)到ptp2::natMX4、sdp1::natMX4、msg5::natMX4中，敲掉PTP3基因，對于長出的重組子提基因組驗證，以野生型菌株BY4741做對照，用PTP3兩端的引物進行驗證，BY4741可以擴出PTP3的ORF的大小，而正確的重組子ptp2::natMX4ptp3::kanMX4、sdp1::natMX4ptp3::kanMX4、msg5::natMX4ptp3::kanMX4可以擴增出的條帶是KanMX4敲除盒的大小，可以得到帶有編號的重組子即為正確的(圖5B)。

利用KanMX4-sdp1敲除盒在ptp2::natMX4、ptp3::natMX4、msg5::natMX4中敲掉SDP1基因,對于長出的重組子提基因組驗證，以野生型菌株BY4741做對照，用SDP1兩端的引物進行驗證，BY4741可以擴增出SDP1的ORF的大小，而正確的重組子ptp2::natMX4sdp1::kanMX4、ptp3::natMX4sdp1::kanMX4、msg5::natMX4sdp1::kanMX4可以擴增出的條帶是KanMX4敲除盒的大小，可以得到帶有編號的重組子即為正確的(圖5C)。

圖5 雙基因缺失株基因型驗證Fig.5 Genotype verification of double-gene deletion mutants

2.2 Cd2+對單基因缺失株和雙基因缺失株的表型實驗

用1.2.3的方法對構(gòu)建成功的單倍體雙基因缺失株和各自的單基因缺失株進行倍比稀釋法表型分析，分別在YPD培養(yǎng)基、YPD+1 mol/L NaCl培養(yǎng)基、YPD+100 μmol/L CdCl2培養(yǎng)基和YPD+150 μmol/L CdCl2培養(yǎng)基進行點樣，30 ℃培養(yǎng)2～3 d后進行表型分析(圖6)。以YPD培養(yǎng)基和YPD+1 mol/L NaCl培養(yǎng)基為對照，在對照培養(yǎng)基中，單基因缺失株和雙基因缺失株的表型與野生型的表型基本是一致的。單基因缺失株ptp2、ptp3、sdp1及雙基因缺失株ptp2ptp3、ptp2sdp1、ptp3sdp1在YPD+100 μmol/L CdCl2培養(yǎng)基和YPD+150 μmol/L CdCl2培養(yǎng)基中，也沒有表現(xiàn)出明顯的敏感或抗性。然而，單基因缺失株msg5和雙基因缺失株ptp2msg5、ptp3msg5和sdp1msg5雖然在YPD+100 μmol/L CdCl2培養(yǎng)基中沒有表現(xiàn)出抗性，但這些基因缺失株卻對150 μmol/L CdCl2有抗性。由于有YPD+1 mol/L NaCl培養(yǎng)基作為對照，說明在YPD+150 μmol/L CdCl2培養(yǎng)基中表現(xiàn)出的抗性不是由Cl-引起的，而是由Cd2+引起的。結(jié)果表明，4個蛋白磷酸酯酶基因中，只有MSG5基因的缺失使酵母細胞對高濃度的Cd2+表現(xiàn)出抗性，因此初步表明Msg5可能是鎘脅迫下負調(diào)控CWI途徑中Slt2的主要蛋白磷酸酯酶。

圖6 不同基因缺失株在不同濃度Cd2+條件下的表型Fig.6 Phenotypes of different double genes mutants in reponse to cadmium stress

3 討 論

本研究利用同源重組的原理，通過NAT和G418兩種藥物抗性標記，構(gòu)建了酵母細胞的單倍體雙基因缺失株，并對ptp2、ptp3、sdp1、msg5四個單基因缺失株和它們之間的六個雙基因缺失株進行Cd2+敏感性表型分析。發(fā)現(xiàn)PTP2、PTP3、SDP1基因的缺失并沒有影響基因缺失株對Cd2+的敏感程度，而MSG5基因的缺失使菌株對高濃度Cd2+表現(xiàn)出抗性。有研究表明MSG5基因?qū)WI途徑中的Slt2起到負調(diào)控作用[16]，而Slt2是通過磷酸化來傳導鎘脅迫下的信號[14-15]。由此可以推測，MSG5基因的缺失可能導致Slt2的活性增加，所以酵母耐受鎘脅迫的能力增強。研究了磷酸酯酶對CWI途徑中應答鎘脅迫的作用，為進一步研究CWI途徑對鎘脅迫調(diào)控機理提供了參考，有助于酵母細胞內(nèi)Cd2+穩(wěn)態(tài)調(diào)控機理的深入研究。

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Regulation of MAPK Protein Kinase Slt2 by Protein Phosphatase Msg5 under Cadmium Coercion

XIA Jing, JIANG Ling-huo

(Schl.ofBiotech.,theNat’lEngin.Lab.forCerealFerment’nTechnol.,JiangnanUni.,Wuxi214122)

Cadmium ion is an inessential metal ion for human body, yet oncogenic. It could seriously affect the growth, development and reproduction of organisms. Mitogen-activate protein kinases (MAPKs) are important signaling molecules regulating cell survival, proliferation and differentiation. The cell wall integrity (CWI) pathway is one of the MAPK signaling pathways inSaccharomycescerevisiae, and is involved in the response to cadmium stress. Cadmium stress activates the CWI_MAPK SLT2 and leads to its phosphorylation. There are four protein phosphatases Ptp2, Ptp3, Sdp1 and Msg5 that regulate the phosphorylation of Slt2. However, their functions in cadmium stress are unknown. In this study, six double-gene deletion strains between these four protein phosphatase genes were constructed, and analyzed their genetic interactions in the response to cadmium stress. The data indicated that Msg5 is the major protein phosphatase in the regulation of Slt2 under cadmium stress.

Saccharomycescerevisiae; MAP kinase; Cell wall integrity (CWI) pathway; protein phosphatase; cadmium stress

國家自然科學基金項目 (81371784,81571966);江南大學自主研究計劃重點項目(JUSRP51313B);江蘇市農(nóng)業(yè)支撐項目(BE2014306)

夏婧 女，碩士研究生。從事酵母遺傳學與分子生物學研究。E-mail:1049698379@qq.com

* 通訊作者。男，博士，教授，博士生導師。從事酵母和絲狀真菌遺傳學與分子生物學研究。E-mail:linghuojiang@jiangnan.edu.cn

2016-03-07；

2016-03-31

Q814

A

1005-7021(2016)06-0017-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.06.003