糖尿病腎病兔模型的建立及功能磁共振成像的可行性研究

王蕊，楊學(xué)東，趙凱，林志勇，隋雪晴，張曉東，王霄英

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糖尿病腎病兔模型的建立及功能磁共振成像的可行性研究

王蕊，楊學(xué)東，趙凱，林志勇，隋雪晴，張曉東，王霄英

【摘要】目的：建立糖尿病腎?。―N）兔模型，并評(píng)價(jià)功能磁共振成像（f MRI）在早期DN兔模型中應(yīng)用的可行性。方法：12只（7只實(shí)驗(yàn)組，5只對(duì)照組）新西蘭大白兔禁食6～8 h后行基線腎臟MRI掃描，成像技術(shù)包括T2WI、血氧水平依賴（BOLD）成像、擴(kuò)散加權(quán)成像（DWI）、氧攝取分?jǐn)?shù)（OEF）成像、T1-map及動(dòng)脈自旋標(biāo)記（ASL）成像，均采集左腎軸面。隨后實(shí)驗(yàn)組兔經(jīng)耳緣靜脈注射四氧嘧啶（100 m g／kg），72 h后檢測(cè)靜脈血糖水平，血糖濃度＞16 .0 m m ol／L認(rèn)為糖尿病模型建立成功；對(duì)照組經(jīng)耳緣靜脈注射相同劑量0 .9 %生理鹽水。建模成功后3 d，所有兔再次行腎臟MRI掃描，并處死取左腎病理，行HE、PAS、Masson染色。兩名醫(yī)師分別獨(dú)立評(píng)價(jià)各序列圖像質(zhì)量。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組5只兔糖尿病模型建立成功，2只未成功，最終實(shí)驗(yàn)組5只、對(duì)照組5只完成實(shí)驗(yàn)。T2WI及各f MRI圖像（BOLD、DWI、OEF、T1-map及ASL）均具有良好的圖像信噪比（SNR）及空間分辨力，皮髓質(zhì)分界清楚。造模成功后3 d病理顯示實(shí)驗(yàn)組兔腎小管細(xì)胞空泡樣變性，管腔輕度擴(kuò)張，腎間質(zhì)局灶淋巴單核細(xì)胞浸潤(rùn)，符合DN模型。結(jié)論：耳緣靜脈注射四氧嘧啶（100 m g／kg）可成功建立DN兔模型，且無創(chuàng)性f MRI可應(yīng)用于該模型的評(píng)估。

【關(guān)鍵詞】糖尿病；糖尿病腎??；磁共振成像；疾病模型，動(dòng)物

作者單位：100034 北京，北京大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科（王蕊、楊學(xué)東、趙凱、林志勇、隋雪晴、張曉東、王霄英）；100053 北京，中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院放射科（楊學(xué)東）

糖尿病腎?。╠iabetes nephropathy，DN）是糖尿病患者最主要的并發(fā)癥之一，但其發(fā)病機(jī)制等仍有許多未解決的問題［1-2］。目前，多采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn)行DN相關(guān)的基礎(chǔ)研究，所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括大鼠、小鼠等［3-4］。兔腎較大，較適合進(jìn)行功能磁共振成像（functional magnetic resonance imaging，f MRI）掃描。本研究將探討DN兔模型的建立以及f MRI應(yīng)用于DN模型的可行性。

材料與方法

1 .實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。12只健康雄性新西蘭大白兔（購自北京大學(xué)第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），體重2 .5～4 .0 kg，自由采食法飼養(yǎng)。分為實(shí)驗(yàn)組7只、對(duì)照組5只。

2 .DN兔模型制備

將四氧嘧啶（Sig ma公司）用0 .9 %生理鹽水配制為2 .5 %溶液，實(shí)驗(yàn)組兔經(jīng)耳緣靜脈按100 m g／kg劑量于1 min內(nèi)注入，對(duì)照組兔注射相同劑量0 .9 %生理鹽水。打藥后72 h用血糖分析儀（美國Freestyle）測(cè)量末梢血糖，濃度＞16 .0 m m ol／L則糖尿病模型建立成功［5-6］。

3 .MRI檢查

使用3 .0 TMR掃描儀（Signa ExciteTM，GEMedical System，Milwaukee，Wis）。因兔右腎容易受到運(yùn)動(dòng)及腸氣等偽影影響而導(dǎo)致圖像質(zhì)量欠佳，故本實(shí)驗(yàn)僅掃描左腎。于造模前（基線）和造模成功后第3d分別對(duì)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組兔行MRI掃描，掃描前實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組兔均禁食6～8 h，自由進(jìn)水。掃描前5 min固定兔，經(jīng)面罩給予吸入式麻醉劑異氟烷，并觀察兔反應(yīng)，肌力消失、瞳孔散大、角膜反射減弱或消失可認(rèn)為麻醉成功。采用8通道膝關(guān)節(jié)表面線圈，兔呈仰臥位，足先進(jìn)，為防止腹部呼吸運(yùn)動(dòng)對(duì)圖像的干擾，在兔腹部與膝線圈間填充墊子。成像技術(shù)包括：左腎軸面T2WI、血氧水平依賴（blood oxygen level dependent，BOLD）成像、擴(kuò)散加權(quán)成像（diffusion weighted imaging，DWI）、氧攝取分?jǐn)?shù)（oxygen extraction fraction，OEF）成像、T1-map及流動(dòng)敏感交互反轉(zhuǎn)恢復(fù)-動(dòng)脈自旋標(biāo)記（flow-sensitive alternating inversion recovery-arterial spin labeling，F(xiàn)AIR-ASL）成像，掃描參數(shù)詳見表1。

表1　各成像技術(shù)的掃描參數(shù)

4 .掃描方法

T2WI掃描范圍覆蓋左側(cè)全腎，采用快速自旋回波（fast spin echo，F(xiàn)SE）序列。BOLD成像采用2 D多回波梯度回波（m ultiple gradient echo，m GRE）序列，回波鏈為12個(gè)，回波間隔為2 ms，掃描1層，層面為左腎門水平。DWI采用自旋回波-回波平面成像（spin echo-echo planar imaging）序列，b值取0和800 s／m m2，為提高空間分辨力，采用軸面小FOV掃描，層數(shù)3層，中間層面位于左腎門水平，同時(shí)在左腎外緣設(shè)置預(yù)飽和帶，以消除腹腔腸管磁敏感偽影的干擾。OEF成像、T1-map技術(shù)、ASL成像均采集左腎門水平，層數(shù)為1層。OEF成像采用多回波梯度自旋回波（m ulti echo gradient and spin echo，MEGSE）技術(shù)，在一個(gè)TR間期內(nèi)獲得32個(gè)回波，其中第7個(gè)回波是SE，前后為不對(duì)稱分布的GRE，因此可同時(shí)獲得T2和T2*信號(hào)，并利用Yablonskiy等［7-10］提出的MRI信號(hào)衰減模型而最終計(jì)算出OEF。T1-map采用3 D擾相梯度回波（spoiled gradient recalled，SPGR）序列，分3個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)只改變翻轉(zhuǎn)角，其他參數(shù)不變。ASL成像采用單激發(fā)快速自旋回波（single-shot fast spin echo，SSFSE）序列，分2次循環(huán)，第1循環(huán)采集對(duì)照相及標(biāo)記相圖像，第2循環(huán)關(guān)閉血管標(biāo)記，以獲得M0圖像。

5 .圖像后處理

BOLD成像及DWI圖使用AW4 .2中的Functool軟件進(jìn)行處理。OEF成像、T1-map技術(shù)、ASL成像圖使用Matlab軟件進(jìn)行分析。

6 .圖像質(zhì)量評(píng)估

所有圖像均上傳至AW4 .2工作站，由兩名有經(jīng)驗(yàn)的影像學(xué)醫(yī)師采用盲法分別對(duì)各f MRI圖進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。根據(jù)圖像有無偽影及變形，是否能分辨腎內(nèi)結(jié)構(gòu)等將圖像質(zhì)量分為優(yōu)、好、差3個(gè)等級(jí)。優(yōu)：無偽影、變形，腎內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰可辨；好：輕度偽影或變形，腎內(nèi)結(jié)構(gòu)可辨；差：明顯偽影或變形，腎內(nèi)結(jié)構(gòu)無法辨認(rèn)。

7 .組織學(xué)檢查

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死所有動(dòng)物，取左腎，在腎門水平取3～5 m m切片，用10 %福爾馬林固定24 h取材，用石蠟包埋、切片，行HE染色、碘酸雪夫反應(yīng)（PAS）染色、馬松（Masson）染色和封固。光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化。

8 .統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS16 .0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。兩名觀察者之間圖像質(zhì)量評(píng)分采取Kappa分析判斷其一致性，其中Kappa值＞0 .75為一致性良好，0 .4≤Kappa值≤0 .75為一致性較好，Kappa值＜0 .4為一致性差。

結(jié) 果

1 .DN模型的建立情況

實(shí)驗(yàn)組7只兔中5只糖尿病模型制備成功，2只打藥后72 h血糖濃度＜16 m m ol／L，最終，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組各5只完成實(shí)驗(yàn)，故最終評(píng)估實(shí)驗(yàn)組5只和對(duì)照組5只的基線及造模成功后3d掃描的MRI圖像。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死動(dòng)物并取左腎，對(duì)照組兔形態(tài)及色澤正常，表面光滑，光鏡下皮質(zhì)腎小球結(jié)構(gòu)清晰，未見肥大，腎小球基膜未見增厚，腎小管形態(tài)正常，未見空泡樣變性及壞死，集合管未見管型。實(shí)驗(yàn)組兔均可見光鏡下腎小球系膜細(xì)胞增生，腎小管細(xì)胞空泡樣變性，管腔輕度擴(kuò)張，腎間質(zhì)局灶淋巴單核細(xì)胞浸潤(rùn)，故認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組5只均成功建立DN模型。

2 .MRI圖像質(zhì)量評(píng)價(jià)

左腎MRI圖像中，T2WI可清楚顯示左腎皮質(zhì)（cortex，CO）、外髓外帶（outer stripes of the outer medulla，OS）、外髓內(nèi)帶（inner stripes of the outer medulla，IS）及內(nèi)髓（inner medulla，IM）（圖1），并與左腎大體病理橫軸面相對(duì)應(yīng)（圖2）。圖3～7分別為BOLD成像、DWI、OEF成像、T1-map技術(shù)、ASL成像圖像，均可清楚顯示CO、外髓（outer medullar，OM）和IM。10只兔子均于基線、造模成功后3 d進(jìn)行MRI掃描，其結(jié)果均參與評(píng)價(jià)。兩名觀察者一致性顯示：T2WI圖像質(zhì)量均為“優(yōu)”（“優(yōu)”均為20），Kappa值1 .00；BOLD成像圖像質(zhì)量均達(dá)到“好”（其中“優(yōu)”均為12），Kappa值0 .79；DWI圖像質(zhì)量均達(dá)到“好”（其中“優(yōu)”分別為10和11），Kappa值0 .70；OEF成像圖像質(zhì)量均達(dá)到“好”（其中“優(yōu)”分別為14和15），Kappa 值0 .88；T1-map圖像質(zhì)量均達(dá)到“好”（其中“優(yōu)”分別為8和9），Kappa值0 .69；ASL成像圖像質(zhì)量均為“優(yōu)”（“優(yōu)”均為20），Kappa值1 .00。

討 論

DN是糖尿病常見的重要并發(fā)癥。我國DN發(fā)病率逐年增多，在終末期腎病的病因中已位列第二，僅次于各種腎小球腎炎［11］。如果DN診治不及時(shí)，發(fā)展到腎病末期，則只能透析甚至進(jìn)行腎移植［12］。在DN發(fā)病過程中伴隨著復(fù)雜的病理生理改變，由于以糖尿病患者作為研究對(duì)象的局限性，多以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為研究對(duì)象，本文以早期DN兔模型為研究對(duì)象，探討無創(chuàng)性f MRI用于兔模型實(shí)驗(yàn)的可行性。

DN模型制備方法有：化學(xué)藥物誘導(dǎo)、自發(fā)性DN動(dòng)物模型、手術(shù)切除胰腺、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等［3，13］。自發(fā)性DN動(dòng)物模型雖在一定程度上減少了人為因素，更接近自然狀態(tài)下的人類疾病進(jìn)程，但動(dòng)物飼養(yǎng)條件要求高、發(fā)病率低、且病程長(zhǎng)、耗費(fèi)大。手術(shù)切除易形成惡性糖尿病，死亡率高。而轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)要求高，價(jià)格昂貴。故目前多采用化學(xué)藥物誘導(dǎo)法進(jìn)行模型制備，本研究采用四氧嘧啶，通過破壞兔胰島β細(xì)胞從而導(dǎo)致胰島素缺乏，形成不可逆的胰島素依賴性糖尿病，隨病程進(jìn)展形成DN。目前常用的DN動(dòng)物模型為大鼠和兔，因大鼠腎臟體積小，不利于f MRI檢查及反復(fù)采血［4］，故本文采用新西蘭兔行模型制備。

文獻(xiàn)報(bào)道［14］實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射四氧嘧啶前應(yīng)禁食、水24 h。本研究的預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兔禁食24 h后，腸腔內(nèi)容物較少，但積氣明顯增多，腎臟位于腸管后方，易受磁敏感偽影的影響；而禁食6～8 h既可減少腸腔內(nèi)容物，又無過多腸道積氣。本研究采用四氧嘧啶（100 m g／kg）耳緣靜脈注射，給藥后72 h模型成功率達(dá)71 %，略低于文獻(xiàn)報(bào)道［6］，可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量少有關(guān)。

由于腹部腸道氣體及呼吸運(yùn)動(dòng)等影響，目前，f M-RI在腹部臟器中的應(yīng)用尚存在一定挑戰(zhàn)性。本研究在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，由于兔雙腎在腹腔內(nèi)的相對(duì)距離較大，且右腎多隨肝臟移位至胸腔（圖像受胸腔呼吸及氣體偽影干擾重），因此僅采集左腎圖像。使用麻醉機(jī)以保證實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物麻醉深度一致。在擺位過程中，先將兔腹部?jī)A向右側(cè)，將腸管推移至右側(cè)，以減少左腎周圍腸管，從而減少掃描過程中磁敏感偽影。并將兔與線圈之間的空間用墊子填充，以減少呼吸運(yùn)動(dòng)偽影。

腎臟的f MRI研究中，DWI和BOLD成像的相關(guān)研究較多［15-18］。DWI作為目前唯一能無創(chuàng)性檢測(cè)活體組織中水分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)的方法，已廣泛應(yīng)用于臨床及科研。本研究為提高空間分辨力，采用小FOV掃描，病灶FOV外圍設(shè)置預(yù)飽和帶，以消除腸管造成的磁敏感偽影及卷褶偽影干擾。BOLD成像技術(shù)依賴于組織血氧水平變化。1936年P(guān)auling等首次發(fā)現(xiàn)去氧血紅蛋白具有順磁性，從而推測(cè)血液的磁性有賴于其氧合水平。1990年，Ogawa等［19］發(fā)現(xiàn)血液中順磁性的脫氧血紅蛋白使血管和周圍組織間產(chǎn)生較大的磁敏感差異，從而產(chǎn)生血氧水平依賴增強(qiáng)效應(yīng)。但僅靠BOLD成像技術(shù)，無法解釋腎臟氧合水平低下是由腎臟血供減少和／或氧代謝增加造成的［20］。因此，不少研究探討了ASL成像及OEF成像的可行性，并已驗(yàn)證ASL在腎臟、OEF成像在腦部應(yīng)用中的可行性［21，22］。

ASL成像在不引入對(duì)比劑的前提下，通過磁化標(biāo)記內(nèi)源性血液來量化評(píng)估腎臟血流量。研究表明，與動(dòng)態(tài)增強(qiáng)相比，ASL技術(shù)具有無創(chuàng)、安全的特性，尤其適用于腎功能不全的患者。目前已有部分研究使用BOLD成像及ASL成像來評(píng)價(jià)正常腎臟及腎臟干預(yù)前后氧合水平及腎血流量的變化［20，21，23-25］，但動(dòng)物模型以大鼠為多，而本研究以兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，圖像信噪比高，皮髓質(zhì)分界清晰。氧代謝是維持機(jī)體正常新陳代謝的重要生理活動(dòng)，因此組織氧代謝指標(biāo)的定量測(cè)定對(duì)相關(guān)疾病的病理認(rèn)識(shí)及診斷具有非常重要的指導(dǎo)作用。OEF成像可以無創(chuàng)性地獲得組織氧攝取分?jǐn)?shù)，最初被用于腦組織的相關(guān)研究中，關(guān)于腎臟方面的研究報(bào)道較少［26］。MEGSE序列通過連續(xù)激勵(lì)非對(duì)稱性偏倚180°重聚脈沖，同時(shí)保持TE時(shí)間不變，從而使采集的MR圖像信號(hào)只與磁場(chǎng)的不均勻性變化有關(guān)，以消除T2效應(yīng)的影響。從Yablonskiy等［7］的模型可知，如果將組織局部磁敏感效應(yīng)的總強(qiáng)度用R2′來表示，那么在穩(wěn)態(tài)條件下，R2′與組織毛細(xì)血管靜脈血容量λ及血管內(nèi)d Hb O2含量（即OEF）呈正相關(guān)。本研究首次應(yīng)用OEF成像來評(píng)估DN兔腎組織的氧攝取分?jǐn)?shù)，所有圖像質(zhì)量均達(dá)到“好”，偽影小，腎臟皮髓質(zhì)分解清晰，可用于評(píng)估。

本研究仍有很多不足之處：第一，實(shí)驗(yàn)組樣本量小，兩觀察者對(duì)圖像質(zhì)量評(píng)估的一致性Kappa值可能缺乏穩(wěn)健性，在后續(xù)研究中仍需進(jìn)一步擴(kuò)充樣本量；第二，本研究模型成功率略低于文獻(xiàn)報(bào)道，仍需進(jìn)一步優(yōu)化。

綜上，經(jīng)耳緣靜脈注射四氧嘧啶可以成功建立DN兔模型，無創(chuàng)性f MRI可成功應(yīng)用于DN兔模型的評(píng)估。

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·糖尿病影像學(xué)專題·

Establish ment of rabbit model of diabetic nephropathy and study on feasibility of renalfunctional MRimaging

WANGRui，YANGXue-dong，ZHAOKai，etal.Department of Radiology，Peking University First Hospital，Beijing 100034，P.R.China

【Abstract】Objective：To establish the rabbit m odel of diabetic nephropathy（DN）and evaluate the feasibility of functional MRimaging in studying the kidney of DNrabbits .Methods：Twelve New Zealand rabbits were enrolled and divided into 2 groups：7 rabbits in the experiment group and 5 rabbits in the control group .Rabbits in experiment group were intravenously injected with alloxan in the dosage of 100 m g／kg and rabbits in control group were intravenously injected with the same dosage of 0 .9 % saline .Blood glucose levels were checked 72 hours after the alloxan injection and rabbits with blood glucose levels of 16 .0 m m ol／Lor higher were identified as successful diabetes mellitus m odel.MRimaging was performed before alloxan injection（baseline）and 3 days after the m odel established successfully，respectively .Then，the rabbits were sacrificed and the left kidneys were taken for pathological examination .MRimaging included T2WI，blood oxygen level dependent（BOLD），diffusion weighted image（DWI），oxygen extraction fraction（OEF），T1-map and arterial spin labeling （ASL）.The image quality was evaluated by two radiologists independently .Results：For DNgroup，5 rabbits were detected with blood glucose level＞16 .0 m m ol／Lafter 72 hours of alloxan injection and 2 rabbits were detected with blood glucose level＜16 .0 m m ol／L.Finally，5 rabbits in control group and 5 in DNgroup finished the study .Renal damages of DNgroup included swelling and mild vacuolation of renal tubular cell and ly m phocytes infiltration .The image quality of each MRsequence all reached the standard of "good" .Conclusion：DNm odel can be induced in rabbits with 100 m g／kg alloxan injection . Also，satisfactory functional MRimaging can be obtained in rabbit kidney of DNm odel.

【Key words】Diabetes mellitus；Diabetic nephropathies；Magnetic resonance imaging；Disease m odels，animal

收稿日期：（2015-12-20 修回日期：2016-01-10）

基金項(xiàng)目：教育部博士點(diǎn)新教師基金（20110001120053）及首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(xiàng)項(xiàng)目（首發(fā)2011 - 4021 - 02）

通訊作者：楊學(xué)東，E-mail：yangxuedong1＠163 .co m

作者簡(jiǎn)介：王蕊（1999 -），女，河南南陽人，博士研究生，主要從事MR新技術(shù)工作。

DOI：10 .13609／j.cnki.1000-0313 .2016 .02 .004

【中圖分類號(hào)】R587 .24；R445 .2；R- 332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1000-0313（2016）02-0113-05