高產(chǎn)莫納可林K低產(chǎn)桔霉素紅曲霉菌株的篩選和發(fā)酵條件初步優(yōu)化

蔣冬花 ， 馮青青， 任 浩， 章 婷， 鄭婕施， 韓肖飛

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004)

高產(chǎn)莫納可林K低產(chǎn)桔霉素紅曲霉菌株的篩選和發(fā)酵條件初步優(yōu)化

蔣冬花 ， 馮青青， 任 浩， 章 婷， 鄭婕施， 韓肖飛

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004)

采集全國各地紅曲霉制品中的紅曲霉資源，經(jīng)分離獲278株紅曲霉菌株。高效液相色譜(HPLC)法測定各菌株發(fā)酵液中莫納可林 K(Monacolin K)和桔霉素含量，篩選獲1株Monacolin K產(chǎn)量較高、桔霉素含量較低的紅曲霉菌株編號為M-22。依據(jù)形態(tài)特征和ITS基因序列，參照紅曲霉屬分類檢索表，鑒定M-22菌株為紫色紅曲霉(Monascuspurpureus)。通過搖瓶發(fā)酵對溫度、初始pH、碳源、氮源、碳氮比(C/N)等因素進行優(yōu)化，確定M-22菌株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K適宜條件為發(fā)酵溫度26 ℃、初始pH 5.0、轉(zhuǎn)速160 r/min，甘油為碳源、蛋白胨為氮源、碳氮比(C/N)為5∶1，Monacolin K產(chǎn)量顯著提高，最高為107.16 mg/L。以優(yōu)化的發(fā)酵條件對M-22菌株進行5 L發(fā)酵罐發(fā)酵，發(fā)酵液中Monacolin K產(chǎn)量最高為189.83 mg/L，桔霉素含量32.53 μg/L，紅曲色素色價為16.38 U/mL。

紅曲霉；Monacolin K；桔霉素；篩選；發(fā)酵條件

紅曲霉(Monascus)是我國釀造微生物中的一個重要的屬，至今已有數(shù)百年的歷史[1]。近幾年紅曲霉的許多功效相繼被證實，其發(fā)酵產(chǎn)物γ-氨基丁酸、莫納可林 K(Monacolin K)、紅曲色素等已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥保健、食品加工及相關(guān)領(lǐng)域中[2-3]。1979年，日本學(xué)者Endo等[4]從紅色紅曲霉(Monascusruber)發(fā)酵液中分離得到一種可抑制體內(nèi)膽固醇合成的活性物質(zhì)，命名為Monacolin K。Monacolin K是一種甲基戊二酞輔酶A還原酶(HMG-CoA還原酶)的抑制劑，有降低膽固醇、降血脂作用，其分子式為C24H36O5，分子量404[5]?，F(xiàn)國內(nèi)已有以紅曲為主要成分的中成藥如“血脂康”和“地奧脂必妥”等上市應(yīng)用，且療效確切，其關(guān)鍵成分就是Monacolin K。1995年法國學(xué)者Blanc等[6]首先在紅曲霉中發(fā)現(xiàn)毒性物質(zhì)——桔霉素，使紅曲霉制品在國內(nèi)外的推廣受到了一定限制。因此，從各地紅曲霉制品中分離紅曲霉資源，篩選高產(chǎn)有益產(chǎn)物Monacolin K、低產(chǎn)桔霉素的紅曲霉菌株，對我國傳統(tǒng)微生物資源的保護和利用有積極的意義。由于Monacolin K的多種生理活性，產(chǎn)Monacolin K的紅曲霉及其發(fā)酵制品一直都是國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點[2,5,7]。但目前國內(nèi)缺乏優(yōu)良高效菌種，對于Monacolin K的生產(chǎn)也處于粗放狀態(tài)，其發(fā)酵生產(chǎn)還處于探索和完善的階段[8-9]，篩選穩(wěn)定高產(chǎn)的Monacolin K紅曲霉菌株是Monacolin K工業(yè)化生產(chǎn)的源頭和核心，對進一步發(fā)掘和保護紅曲霉菌株資源具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 紅曲霉菌株 從全國各地購買或采集市售的紅曲米、紅曲酒、紅曲腐乳等紅曲霉制品，經(jīng)分離純化篩選獲得。

1.1.2 主要培養(yǎng)基 ① PDA培養(yǎng)基和PD培養(yǎng)基[7]：用于紅曲霉各菌株的分離、純化、篩選和種子培養(yǎng)；② 基礎(chǔ)培養(yǎng)基(質(zhì)量分數(shù)，%)：葡萄糖6，蛋白胨2，KH2PO40.2，MgSO4·7H2O 0.1，NaNO30.2，水100 mL，pH 6.0。用于發(fā)酵條件的優(yōu)化；③ 發(fā)酵培養(yǎng)基(質(zhì)量分數(shù)，%)：甘油13，大米水解液5，大豆蛋白胨3，酵母膏0.5，MgSO4·7H2O 0.1，NaNO30.2，KH2PO40.1，ZnSO40.2，水100 mL，pH 5.0。用于5 L發(fā)酵罐發(fā)酵。

1.2 方法

1.2.1 紅曲霉菌株的分離純化與保藏 紅曲米等紅曲霉制品0.5 g研磨成粉，取少量均勻灑入PDA培養(yǎng)基表面，28 ℃培養(yǎng)48 h，待白色絨毛狀菌絲長出后，挑取少許菌絲轉(zhuǎn)接于另一PDA培養(yǎng)平板上繼續(xù)培養(yǎng)1周，顯微鏡觀察具有紅曲霉的典型特征，挑取少許邊緣菌絲純化3次，得性狀均一的紅曲霉純菌株，編號后保存于25%甘油中，置于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 高產(chǎn)Monacolin K、低含量桔霉素菌株的篩選 紅曲霉各菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d；轉(zhuǎn)接種于PD培養(yǎng)液中，26 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)5 d，取發(fā)酵液用HPLC檢測。① HPLC法檢測發(fā)酵液中Monacolin K含量[10]：取發(fā)酵液1 mL，煮沸10 min，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，上清液用HPLC法檢測Monacolin K產(chǎn)量。配制梯度濃度的Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)品用下述色譜條件測定產(chǎn)量并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。色譜條件：Agilent TC-C18液相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，A溶液為乙腈(0.45 μm有機相濾膜過濾)，B溶液為pH值2.5的磷酸溶液(0.45 μm水相濾膜過濾)。檢測波長λ=237 nm；流速0.6 mL/min；柱溫50 ℃。得出相關(guān)系數(shù)高的標(biāo)準(zhǔn)曲線后，發(fā)酵上清液用相同的色譜條件測定Monacolin K產(chǎn)量。② TLC結(jié)合HPLC法檢測發(fā)酵液中桔霉素含量[10]：在5 mL的離心管中吸取發(fā)酵液1 mL，加入2 mL 的甲醇，混勻后用封口膜和保鮮膜封好管口，與磁力攪拌轉(zhuǎn)子綁在一起，放在60 ℃的集熱式磁力攪拌器內(nèi)攪拌1 h，取出后在4 ℃、3 000 r/min的條件下離心15 min；取上清液，用毛細吸管點于制好的硅膠板上，用展開劑V(甲苯)∶V(乙酸乙酯)∶V(甲酸)= 6∶3∶1展開，在紫外燈下觀察，Rf值在0.7～0.8之間的黃綠色條帶即為桔霉素顯色條帶明暗程度。刮取桔霉素條帶的硅膠加入甲醇溶解，HPLC法定量檢測。配制梯度濃度的桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品用下述色譜條件測定含量并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。Agilent TC-C18液相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，V(流動相乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=70∶10∶20，熒光檢測器(檢測波長λex=331 nm、λem=500 nm)，流速1 mL/min，柱溫28 ℃。得出相關(guān)系數(shù)高的標(biāo)準(zhǔn)曲線后，發(fā)酵上清液用相同的色譜條件測定桔霉素含量。

1.2.3 紅曲霉目的菌株的鑒定 用柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒，按操作說明提取PDA上培養(yǎng)7 d的紅曲霉M-22菌株基因組DNA，用真菌通用引物: ITS1-TCCGTAGGTGAACCTGCGG; ITS4-TCCTCCGCTTATTGATATGC 進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，1%瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收目的條帶送上海生工公司測序。顯微鏡觀察M-22菌株的形態(tài)特征，結(jié)合ITS基因序列Blast比對結(jié)果，確定M-22菌株的分類地位。

1.2.4 搖瓶優(yōu)化發(fā)酵條件提高Monacolin K產(chǎn)量 M-22菌株28 ℃、200 r/min液體培養(yǎng)7 d，探討培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件對M-22菌株產(chǎn)Monacolin K的影響。① 碳源：葡萄糖、大米粉、木糖、淀粉、甘油；② 氮源：牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、硝酸鈉、硫酸銨；③碳氮比(C/N，質(zhì)量比)：2/1、3/1、4/1、5/1、6/1、7/1；④ 初始pH值：pH 4、pH 5、pH 6、pH 7、pH 8；⑤ 培養(yǎng)溫度：24、26、28、30、32 ℃；⑥ 搖床轉(zhuǎn)速：120、140、160、180、200、220 r/min。設(shè)3次重復(fù)，發(fā)酵液用HPLC法檢測Monacolin K產(chǎn)量。

1.2.5 5L發(fā)酵罐發(fā)酵及發(fā)酵產(chǎn)物動態(tài)變化檢測 M-22菌株在PD種子培養(yǎng)基中，26 ℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)5 d。過濾菌液菌絲，吸取孢子濃度為1×105個/mL的孢子液5 mL轉(zhuǎn)接到PD二級種子液中，26 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)5 d，按15%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行5 L發(fā)酵罐發(fā)酵。① M-22菌株生物量檢測和生長曲線制作：每4 h取樣30 mL，5 000 r/min、10 min離心棄上清，無菌水洗滌3次，60 ℃烘箱烘至恒重后進行稱量。以取樣時間為橫坐標(biāo)，M-22菌株菌絲干重為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。② Monacolin K產(chǎn)量隨發(fā)酵時間變化曲線繪制：HPLC法檢測上清液中Monacolin K含量。以發(fā)酵時間為橫坐標(biāo)，M-22菌株的Monacolin K產(chǎn)量為縱坐標(biāo)，繪制M-22菌株Monacolin K產(chǎn)量隨發(fā)酵時間變化曲線。③ 桔霉素含量隨發(fā)酵時間變化曲線繪制：HPLC法檢測上清液中桔霉素產(chǎn)量。以發(fā)酵時間為橫坐標(biāo)，M-22菌株的桔霉素含量為縱坐標(biāo)，繪制M-22菌株桔霉素含量隨發(fā)酵時間變化曲線。④ 紅曲色素提取、色價檢測和變化曲線繪制[10-11]：吸取1 mL發(fā)酵液于5 mL的離心管中，加入2 mL 70%的乙醇，混勻后，調(diào)節(jié)pH至6.0～7.0。靜置20 min后，5 000 r/min離心10 min，取上清液檢測。以70%乙醇溶液做參比，測定505 nm處的OD值。按公式計算：色價(U/mL)=稀釋倍數(shù)×吸光值。以發(fā)酵時間為橫坐標(biāo)，M-22菌株的色素色價為縱坐標(biāo)，繪制M-22菌株色素色價隨發(fā)酵時間變化曲線。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 用SPSS(Statistical Product and Service Solutions)軟件分析顯著性及相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC測定Monacolin K和桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖和標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.1 Monacolin K和桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖 如圖1所示，Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)品出峰時間為6.9 min左右，桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品出峰時間為16.96 min左右。

圖1 Monacolin K(A)和桔霉素(B)標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖 Fig.1 High performance liquid graph of Monacolin K (A)and citrinin (B)standard sample

2.1.2 Monacolin K和桔霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線 ①Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)曲線：以一系列不同Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。HPLC法檢測Monacolin K的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y = 44.653x + 14.445，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，符合要求。②桔霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線：以一系列不同桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制桔霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。HPLC法檢測桔霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y = 45.44x + 0.015 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，符合要求。

圖2 Monacolin K和桔霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of Monacolin K and citrinin

2.2 高產(chǎn)Monacolin K紅曲霉菌株的分離純化與篩選

分離純化篩選共獲278株紅曲霉純菌株，編號后，保藏于-80 ℃冰箱中。HPLC法檢測278株紅曲霉純菌株發(fā)酵液，篩選獲得11株Monacolin K產(chǎn)量較高菌株，其中M-22號菌株Monacolin K最高，達28.29 mg/L(表1)。

2.3 低產(chǎn)桔霉素紅曲霉菌株的篩選

利用甲醇浸提紅曲霉菌株發(fā)酵液(包括菌絲)中桔霉素，通過薄板層析(TCL)，在254 nm紫外光下觀察桔霉素條帶的明暗程度(圖3)，初步判別各轉(zhuǎn)化子桔霉素含量的高低；再將桔霉素?zé)晒鈼l帶刮下溶于甲醇中，HPLC法檢測桔霉素含量(表1、圖3)。結(jié)果表明M-22菌株發(fā)酵液中桔霉素含量最低，為8.83 μg/L(表1)。選取M-22菌株為后續(xù)實驗菌株。

表1 11株Monacolin K產(chǎn)量較高的紅曲霉菌株與桔霉素含量

注：Monacolin K產(chǎn)量、桔霉素含量為3次重復(fù)測定的平均值

圖3 9株代表性紅曲霉菌株發(fā)酵液桔霉素含量薄層層析結(jié)果Fig.3 Results of citrinin TLC from fermentation broth of 9 Monascus strains1:桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品;2～10:紅曲霉不同菌株發(fā)酵液桔霉素甲醇提取物1:Citrinin standard sample;2-10:Methanol extract citrinin of 9 Monascus strains

2.4 紅曲霉M-22菌株的鑒定

2.4.1形態(tài)特征 M-22紅曲霉菌株P(guān)DA上28 ℃培養(yǎng)15 d，PDA培養(yǎng)基上的菌落呈橘紅色絨毛狀，邊緣呈白色，菌落直徑達60 mm；顯微鏡觀察菌絲有隔膜和色素顆粒；分生孢子近球形或倒梨形，單生或成鏈，大小為(6～10) μm×(7～9) μm；閉囊殼呈球形，囊內(nèi)孢子可見，子囊孢子橢球形，大小為(5～6) μm×(3～5) μm，透明淡紅色(圖4)。

圖4 M-22菌株的菌落(A)、菌絲和分生孢子(B)及閉囊殼和子囊孢子(C)Fig.4 The colony (A), hypha and conidia (B) and cleistothecia and ascospores (C) of strain M-22

2.4.2 ITS基因序列 M-22菌株的基因組DNA和ITS PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜見圖5，ITS 基因序列分析結(jié)果見圖6，其長度為551 bp，基于紅曲霉屬ITS序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖7，與紫色紅曲霉(Monascuspurpureus)的相似度最高，為99%。

2.4.3 M-22菌株鑒定結(jié)果 根據(jù)M-22菌株形態(tài)特征和ITS 基因序列，結(jié)合李鐘慶和郭芳紅曲霉分種檢索表[1]，鑒定為紫色紅曲霉(Monascuspurpureus)。

圖5 M-22菌株的基因組DNA和ITS基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.5 The genomic DNA and ITS gene electrophoresis diagram of strain M-22

圖6 M-22菌株ITS基因序列(551 bp)Fig.6 The ITS gene sequence of strain M-22(551 bp)

2.5 M-22菌株搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

以Monacolin K產(chǎn)量為指標(biāo)，經(jīng)單因素優(yōu)化M-22菌株適宜的發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度26 ℃、pH 5.0、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min時，甘油為碳源、蛋白胨為氮源、C/N(甘油∶蛋白胨)為5∶1(質(zhì)量比)時，Monacolin K產(chǎn)量最高為107.16 mg/L(圖8)。

圖7 基于12株紅曲霉屬ITS基因序列建立的M-22菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of strain M-22 based on ITS gene sequence of 12 Monascus strains

圖8 培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件對M-22菌株Monacolin K產(chǎn)生的影響Fig.8 The effect of culture medium and fermentation conditions on production of Monacolin K of strain M-22

2.6 5 L發(fā)酵罐發(fā)酵M-22菌株及代謝產(chǎn)物的動態(tài)檢測

按15%接種量，26 ℃、pH 5.0、轉(zhuǎn)速160 r/min，通氣量80～120 L/h，罐壓0.1～0.5 MPa條件下，用發(fā)酵培養(yǎng)基進行5 L發(fā)酵罐發(fā)酵M-22菌株，并檢測代謝產(chǎn)物的動態(tài)變化。

① M-22菌株的生長曲線：發(fā)酵0～24 h為延滯期(圖9A)，24～92 h進入對數(shù)期，92～120 h處于穩(wěn)定期，120 h以后進入衰亡期；生物量最大值為191.23 g/L；② 發(fā)酵液中Monacolin K產(chǎn)量動態(tài)變化：發(fā)酵68 h后Monacolin K產(chǎn)量開始快速增長，144 h達到最高，為189.83 mg/L(圖9A)；③ 發(fā)酵液中桔霉素含量動態(tài)變化：68～116 h桔霉素含量增長較快；140 h之后基本處于穩(wěn)定，桔霉素最高含量為32.53 μg/L(圖9B)；④ 發(fā)酵液中紅曲色素色價動態(tài)變化：M-22菌株發(fā)酵液中紅曲色素最高色價為16.38 U/mL(圖9B)。

圖9 M-22菌株發(fā)酵過程中生物量和Monacolin K(A)、色價和桔霉素(B)的變化Fig.9 Time courses of biomass and Monacolin K (A), color value and citrinin (B) of strain M-22 during the fermentation process

3 討 論

本研究篩選獲1株Monacolin K產(chǎn)量較高、桔霉素含量較低的紅曲霉菌株(編號為M-22)。依據(jù)形態(tài)特征和ITS基因序列，參照紅曲霉屬分類檢索表，鑒定M-22菌株為紫色紅曲霉(Monascuspurpureus)。張朝暉等[12]利用添加酵母膏的葡萄糖-甘油培養(yǎng)基，使紫色紅曲霉產(chǎn)量達104 mg/L；徐偉等[13]優(yōu)化了影響發(fā)酵的主要因素，使紅曲霉M5028菌株的Monacolin K產(chǎn)量達到了168.73 μg/mL；胡文效等[8]對紅曲霉MS-12菌株進行紫外照射、LiCl誘變以及硫酸二乙酯處理與LiCl復(fù)合誘變?nèi)握T變，最終Monacolin K產(chǎn)量提高到264.7 μg/mL；陳泉等[14]通過原生質(zhì)體融合技術(shù)和發(fā)酵條件優(yōu)化，使Monacolin K產(chǎn)量提高到1 216 mg/L。本研究篩選的紅曲霉M-22菌株在初步優(yōu)化條件下Monacolin K產(chǎn)量為189.83 mg/L，通過培養(yǎng)基配方的進一步優(yōu)化，結(jié)合理化誘變和原生質(zhì)體融合等技術(shù)，產(chǎn)量有望大幅度提高[7,14]。

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ScreeningMonascusstrains and Initial Optimization Fermentation Conditions of Higher-Yielding Monacolin K and Low-Yielding Citrinin

JIANG Dong-hua, FENG Qing-qing, REN Hao, ZHANG Ting, ZHENG Jie-shi, HAN Xiao-fei

(Coll.ofChem. &LifeSci.,ZhejiangNormalUni.,Jinhua321004)

278Monascusstrains were isolated fromMonascusresources collection ofMonacusproducts around the country. AMonascusstrain (No: M-22) which produces higher monacolin K and lower citrinin was screened from the isolated strains with HPLC determination. Based on their ITS sequence and morphology characteristics, and referred to classification searching table ofMonascus, the strain M-22 was classified asMonascuspurpureus. Through factors optimization of the fermentation temperature, initial pH, carbon source, nitrogen source, ratio of carbon and nitrogen (C/N) etc. the suitable conditions for monacolin K production in shaking flask fermentation were: temperature 26 ℃, initial pH 5.0, 160 r/min, glycerol as carbon source, peptone as nitrogen source, with C/N ratio at 5∶1. The monacolin K production was significantly increased with the highest at 107.16 mg/mL. With the same optimized fermentation conditions applied to amplified fermentation in 5 L fermentation tank. The highest production of monacolin K was at 189.83 mg/mL, and the content of citrinin was 32.53 μg/L and monascus pigment value of was 16.38 U/mL.

Monascus; monacolin K; citrinin; screening; fermentation conditions

國家自然科學(xué)基金項目(31270061，31570013)

蔣冬花 女, 教授，博士, 碩土生導(dǎo)師。研究方向為應(yīng)用微生物學(xué)。E-mail: jdh@zjnu.cn

2016-01-18；

2016-04-02

Q93

A

1005-7021(2016)06-0010-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.06.002