心臟后負荷增加大鼠不同階段心臟全基因表達差異的研究

田國祥，李彥川，張薇，王曉兵，馬曉慧，魏萬林

· 論著 ·

心臟后負荷增加大鼠不同階段心臟全基因表達差異的研究

田國祥1，李彥川2，張薇1，王曉兵1，馬曉慧2，魏萬林3

目的探討后負荷增加型大鼠不同時間點心臟全基因譜差異表達情況。方法納入雄性SD大鼠70只，術前隨機取10只進行處理，相關參數(shù)作為基線數(shù)據(jù)；其余60只，隨機分為模型組（2周亞組、8周亞組、18周亞組）和假手術組（2周亞組、8周亞組、18周亞組），每組30只（每亞組10只）。模型組大鼠采用縮窄腹主動脈的方法建立心臟后負荷增加模型，假手術組大鼠腹主動脈只穿線不進行縮窄。各組大鼠分組后分別在術前、術后2周、8周、18周采用小動物超聲實時影像系統(tǒng)及頸動脈插管檢測大鼠心臟結構及血流動力學相關指標。完成上述步驟后，處死大鼠，取左心室，進行大鼠心臟RNA建庫，使用Illumina HiSeqTM2500/MiseqTM對文庫進行高通量測序，并進行生物信息分析。結果在術后第2周、第8周、第18周，模型組大鼠平均動脈壓、左室重量、左室舒張末內(nèi)徑、左室舒張末壓較基線顯著升高（P均＜0.05），心臟每搏輸出量、左室射血分數(shù)、左室內(nèi)壓最大上升速率較基線顯著下降（P均＜0.05）；假手術組大鼠平均動脈壓、左室舒張末內(nèi)徑、心臟每搏輸出量、左室射血分數(shù)、左室內(nèi)壓最大上升速率與基線比較則無顯著變化（P均＞0.05）；大鼠后負荷增加模型建立成功。模型組與假手術組大鼠在第2周、第8周相較基線時差異表達的基因個數(shù)有升高趨勢，至第18周差異表達的基因個數(shù)有所回落。模型組較假手術組在同時間段差異表達的基因明顯增加。在第2周、第8周、第18周，模型組與假手術組大鼠心臟差異表達的基因個數(shù)分別為119、43和49個基因，差異基因的個數(shù)隨時間有顯著下降。不同時間點模型組與假手術組大鼠心臟差異表達的基因功能富集（GO）及通路富集（KEGG）有很大差異。結論腹主動脈縮窄后負荷增加大鼠與假手術組比較，在術后早期差異基因明顯增加，術后中晚期差異基因數(shù)量逐漸下降；不同時間點差異基因功能及相關通路有很大差異。

心臟；后負荷；基因表達；大鼠

心力衰竭（心衰）是由心肌組織中某些相關基因表達與調(diào)控異常引起的[1]，既往通過對心臟基因表達譜的研究，已發(fā)現(xiàn)細胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導等多條心衰相關分子途徑[2-4]。但目前對心衰基因表達譜的研究多為橫斷面而非縱向序貫性研究，不同的心衰階段心臟基因表達譜存在較大的差異，這種橫斷面研究不能觀察心衰發(fā)展過程中基因表達譜的差異[5]。本研究設計對后負荷增加型大鼠心衰不同階段心臟全基因譜的表達情況進行檢測，以期發(fā)現(xiàn)在心衰不同發(fā)展階段表達差異的基因系列，尋找干預心衰的新靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組雄性SD大鼠，SPF級，體重200～220 g，70只。由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。屏障動物房飼養(yǎng)，溫度20～25℃，相對濕度40%～60%，每籠5只，自由飲食，每日更換墊料。70只大鼠，術前隨機取10只進行處理，相關參數(shù)作為基線數(shù)據(jù)；其余60只，隨機分為模型組（2周亞組、8周亞組、18周亞組）和假手術組（2周亞組、8周亞組、18周亞組），每組30只（每亞組10只），在術后2周、8周、18周分別進行相關處理。

1.2 方法

1.2.1 心臟后負荷增加大鼠模型造模方法采用Cutilleta[6]及Anversa[7]等縮窄腹主動脈的方法建立大鼠后負荷增加心衰模型。大鼠適應性飼養(yǎng)1周，術前12 h禁食，自由飲水。測量體質(zhì)量后用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉。麻醉后，經(jīng)左脊肋角區(qū)去毛，備皮，1%碘伏消毒，縱向切開皮膚，切口長約2 cm，鈍性分離肌層，暴露腹主動脈，分離左腎動脈起始部上段腹主動脈約1 cm，以直徑為0.7～0.8 mm的不銹鋼探針（或使用7-8號注射針，磨圓針頭）與腹主動脈一起使用4號線結扎，抽出探針形成腹主動脈狹窄（50%～60%），6號絲線縫合肌層，4號線縫合手術切口，同時腹腔一次性注射青霉素10萬u預防感染。假手術組腹主動脈只穿線不進行縮窄，其他手術步驟同模型組。

1.2.2 小動物超聲實時影像系統(tǒng)及頸動脈插管檢測大鼠心臟結構及血流動力學相關指標各組大鼠分組后分別在術前、術后2周、8周、18周采用小動物超聲實時影像系統(tǒng)（采用加拿大產(chǎn)Visual Sonics Vevo@2100小動物超聲儀，MS250線陣探頭，探頭頻率為21MHz）及頸動脈插管（采用Powerlab八導電生理記錄儀，ML870，澳大利亞AD Instruments公司）檢測左室舒張末壓、收縮期左心室內(nèi)壓上升的最大變化速率，舒張期左心室內(nèi)壓下降的最大變化速率，動物血壓等血流動力學指標檢測。

1.2.3 大鼠心臟組織取材各組大鼠分別在術前、2周、8周、18周，麻醉后，取動脈血，離心，收集血清后放入液氮中凍存。剖殺動物，快速取心臟、沖凈、稱重，取左心室，切成綠豆大，裝入凍存管，放入液氮中保存。送北京諾和致源生物信息科技有限公司進行高通量測序。

1.2.4 心臟標本建庫測序流程由北京諾和致源生物信息科技有限公司按照以下步驟進行：①Total RNA樣品檢測；②文庫構建；③文庫質(zhì)量檢測；④上機測序（圖1）。

1.2.5 生物信息分析流程由北京諾和致源生物信息科技有限公司按照以下步驟進行：①原始序列數(shù)據(jù)；②測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估；③參考序列比對分析；④基因表達水平分析；⑤RNA-seq整體質(zhì)量評估；⑥基因差異表達分析；⑦差異基因GO富集分析；⑧差異基因KEGG富集分析；差異基因蛋白互作網(wǎng)絡分析。本研究使用Illumina HiSeqTM2500/ MiseqTM對文庫行高通量測序（圖2）。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 15.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學處理，計算各組動物的實驗數(shù)據(jù)平均值及標準差，不同時間段兩組間均數(shù)的比較采用成組t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 腹主動脈縮窄對大鼠心臟重構及血流動力學的影響假手術組大鼠平均動脈壓術后第2周、第8周、第18周隨時間變化有升高趨勢，但各時間點血壓無顯著統(tǒng)計學差異（P均＞0.05）；模型組大鼠在術后第2周、第8周血壓顯著升高，到第18周時血壓稍有回落，各時間點血壓與基線及同時間點假手術組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。 假手術組大鼠各時間點心臟每搏輸出量及左室射血分數(shù)與基線比較無統(tǒng)計學差異（P均＞0.05），模型組大鼠從術后第2周、第8周、第18周與基線及同時間段假手術組比較均有明顯下降（P均＜0.05）。假手術組大鼠左室重量在術后第2周、第8周、第18周呈增加趨勢，第18周時假手術組左室重量與基線有統(tǒng)計學差異（P均＞0.05）；模型組大鼠左室重量在術后第2周、第8周呈顯著增加趨勢，至第18周出現(xiàn)回落，模型組左室重量與基線及同時間段假手術組比較均有顯著增加（P均＜0.05）。假手術組大鼠左室舒張末內(nèi)徑和左室舒張末壓在術后第2周、第8周、第18周呈略微增加趨勢，第18周時假手術組左室舒張末壓與基線有統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；模型組大鼠左室舒張末內(nèi)徑和左室舒張末壓在術后第2周、第8周、第18周呈顯著增加趨勢，與基線及同時間段假手術組比較均有顯著增加（P均＜0.05）。假手術組大鼠心率（BPM）在術后第2周、第8周、第18周變化不明顯（P＞0.05）；模型組大鼠心率在術后第2周顯著增加，較基線及同時間段假手術組顯著增加（P均＜0.05），在第8周及第18周呈回落趨勢。假手術組大鼠在各時間點左心室內(nèi)壓最大上升速率與基線比較無顯著統(tǒng)計學差異（P均＞0.05），模型組大鼠術后第2周、第8周、第18周與基線及同時間段假手術組比較均有明顯下降（P均＜0.05）（表1）。

2.2 不同時間和組別大鼠心臟差異表達基因數(shù)量比較假手術組大鼠在第2周、第8周相較基線時差異表達的基因個數(shù)有升高趨勢，至第18周差異表達的基因個數(shù)有所回落，分別為568、1938、1097個基因。模型組大鼠在第2周、第8周相較基線時差異表達的基因個數(shù)亦呈升高趨勢，至第18周差異表達的基因個數(shù)同樣回落，分別為1615、2770、1558個基因（表2）。模型組較假手術組在同時間段差異表達的基因明顯增加。在第2周、第8周、第18周，模型組與假手術組大鼠心臟差異表達的基因個數(shù)分別為119、43和49個基因，差異基因個數(shù)隨時間顯著下降（圖3）。

2.3 模型組和假手術組不同時間點差異基因GO富集柱狀圖基因個體（Gene Ontology簡稱 GO, http://www.geneontology.org/）是基因功能國際標準分類體系。GO分為分子功能（Molecular Function）、生物過程（biological process）、和細胞組成（cellular component）三個部分?；蚧虻鞍踪|(zhì)可以通過ID對應或者序列注釋的方法找到與之對應的GO編號，而GO編號可用于對應到Term，即功能類別或者細胞定位。通過差異基因GO（Gene Ontology，GO）富集柱狀圖，可直觀觀察到模型組和假手術組大鼠心臟在術后第2周、第8周和第18周時在生物過程、細胞組分和分子功能富集的GO term上差異基因的個數(shù)分布情況（圖4）。從圖4a中可以看出，差異基因主要集中于生物過程中的小分子代謝過程、代謝過程和細胞代謝過程及分子功能中結合功能中；從圖4b中可以看出，差異基因比較分散，但在生物過程中的細胞粘附及生物粘附稍微突出；從圖4c中可以看出，差異基因主要集中于生物過程中的氧化還原過程及單一的器官代謝過程以及分子功能中的氧化還原活動。

表1 小動物超聲實時影像系統(tǒng)及頸動脈插管比較不同時間大鼠心臟結構及血流動力學相關指標（n=10）

表2 不同時間和組別大鼠心臟差異表達基因數(shù)量比較

圖3 差異基因火山圖[有顯著性差異表達的基因用紅色點（上調(diào)）和綠色點（下調(diào)）表示，無顯著性差異表達的基因用藍色點表示；橫坐標代表基因在不同樣本中表達倍數(shù)變化；縱坐標代表基因表達量變化差異的統(tǒng)計學顯著性]

2.4 模型組和假手術組不同時間點差異基因KEGG富集分析結果KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是系統(tǒng)分析基因功能、基因組信息數(shù)據(jù)庫，它有助于把基因及表達信息作為一個整體網(wǎng)絡進行研究。KEGG富集程度通過Rich factor、Qvalue和富集到此通路上的基因個數(shù)來衡量。其中Rich factor指該代謝途徑（pathway）中富集到的差異基因個數(shù)與注釋基因個數(shù)的比值。Rich factor越大，表示富集的程度越大。Qvalue是做過多重假設檢驗校正之后的Pvalue，Qvalue的取值范圍為[0,1]，越接近于零，表示富集越顯著。從圖5a中可看出，差異基因主要富集于癌癥蛋白聚糖、點狀粘附及癌癥MicroRNAs等通路中；從圖5b中可看出，差異基因主要主要富集于緊密連接、p53信號通路、點狀粘附等通路中；從圖5c中可看出，差異基因主要富集于PI3K信號通路、HIF-1信號通路等。

圖4 GO富集柱狀圖[縱坐標為富集的GO term，橫坐標為該term中差異基因個數(shù)。不同顏色用來區(qū)分生物過程、細胞組分和分子功能。富集最顯著的30個GO term在圖中展示，如果不足30條，則全部展示]

3 討論

3.1 關于心臟后負荷增加大鼠模型的建立本研究采用Cutilleta[6]或Anversa[7]等縮窄腹主動脈的方法建立大鼠心臟后負荷增加模型，并采用小動物超聲實時影像系統(tǒng)及頸動脈插管檢測大鼠心臟結構及血流動力學相關指標。結果顯示與基線比較，模型組大鼠平均動脈壓在術后第2周明顯上升，至第8周血壓有非常顯著升高，而第18周時血壓則稍有回落，各時間點血壓與基線及同時間點假手術組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）；隨著平均動脈壓及心臟后負荷的增加，大鼠左心室重量、左室舒張末內(nèi)徑、左室舒張末壓較基線顯著升高（P均＜0.05），心臟每搏輸出量、左室射血分數(shù)、左室內(nèi)壓最大上升速率較基線顯著下降（P均＜0.05）；表明模型組大鼠心臟功能進行性衰退并發(fā)生心臟肥大性重構。而假手術組大鼠在術后第2周、第8周、第18周時平均動脈壓、左室舒張末內(nèi)徑、心臟每搏輸出量、左室射血分數(shù)、左室內(nèi)壓最大上升速率與基線比較則無顯著變化（P均＞0.05），表明假手術組大鼠心臟血流動力學及心臟結構與基線比較未有顯著變化。因此通過縮窄大鼠腹主動脈建立的心臟后負荷增加模型是成功的。

圖5 差異基因KEGG富集散點圖[縱軸表示pathway名稱，橫軸表示Rich factor，點的大小表示此pathway中差異表達基因個數(shù)多少，而點的顏色對應于不同的Qvalue范圍。圖中挑選了富集最顯著的20條pathway條目進行展示，若富集的pathway條目不足20條，則全部展示]

3.2 不同時間點模型組與假手術組心臟差異表達基因?qū)Ω鲿r間亞組大鼠心臟基因表達水平進行分析，結果顯示，假手術組大鼠在術后第2周、第8周相較基線時差異表達的基因個數(shù)有升高趨勢，至第18周差異表達的基因個數(shù)有所回落，分別為568、1938、1097個基因。模型組大鼠在第2周、第8周相較基線時差異表達的基因個數(shù)亦呈升高趨勢，至第18周差異表達的基因個數(shù)同樣回落，分別為1615、2770、1558個基因。表明心臟后負荷增加大鼠模型組較假手術組在同時間段差異表達的基因數(shù)量明顯增加。進一步分析顯示，在術后第2周、第8周、第18周，模型組與假手術組大鼠心臟差異表達的基因數(shù)量分別為119、43和49個基因，差異基因的數(shù)量隨時間推移有下降趨勢（圖3）。

GO分類是一種基因功能國際標準分類體系，其中GO可分為分子功能、生物過程、和細胞組成三個部分。對模型組和假手術組大鼠心臟不同時間差異基因進行GO富集柱狀圖分析，在術后第2周亞組，差異基因主要集中于生物過程中的小分子代謝過程、代謝過程和細胞代謝過程及分子功能中結合功能中；在術后第8周亞組，差異基因比較分散，但在生物過程中的細胞粘附及生物粘附稍微突出；在術后第18周亞組，差異基因主要集中于生物過程中的氧化還原過程及單一的器官代謝過程以及分子功能中的氧化還原活動。表明在腹主動脈縮窄，心臟后負荷增加的情況下，在術后不同時間段心臟代謝及重構過程中基因表達有非常大的差異[3,9]。

在生物體內(nèi)，不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學功能，通過通路（pathway）顯著性富集能確定差異表達基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導途徑。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是系統(tǒng)分析基因功能、基因組信息數(shù)據(jù)庫的方法，它有助于把基因及表達信息作為一個整體網(wǎng)絡進行研究。作為Pathway相關的主要公共數(shù)據(jù)庫（Kanehisa，2008），KEGG提供的整合代謝途徑查詢十分出色，包括碳水化合物、核苷、氨基酸等的代謝及有機物的生物降解，不僅提供了所有可能的代謝途徑，而且對催化各步反應的酶進行了全面的注解，包含有氨基酸序列、PDB庫的鏈接等等，是進行生物體內(nèi)代謝分析、代謝網(wǎng)絡研究的強有力工具。本研究中，在術后第2周亞組，模型組與假手術組差異基因主要富集于癌癥蛋白聚糖、點狀粘附及癌癥MicroRNAs等通路中；在術后第8周亞組，差異基因主要富集于緊密連接、p53信號通路、點狀粘附等通路中；在術后第18周亞組，差異基因主要富集于PI3K信號通路、HIF-1信號通路等。在術后不同時間段差異基因通路有很大差異。后面課題組需要進一步將不同時間段差異基因的功能及相關通路進行深入分析[10]。

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本文編輯：姚雪莉

Study on the difference of cardiac gene expression at different stages of cardiac afterload in rats

TIAN Guo-xiang*, LI Yan-chuan, ZHANG Wei, WANG Xiao-bing, MA Xiao-hui, WEI Wan-lin.*Department of Fourth Cadres Ward, PLA Army General Hospital, Beijing 100700, China.

WEI Wan-lin, E-mail: wei_wanlin@126.com

ObjectiveTo investigate the differential expression of cardiac whole gene at different time points after afterload increasing rats.Methods10 of 70 male SD rats were randomly selected for the preoperative treatment, relevant parameters were collected as the baseline data; the rest of 60 rats were randomly divided into model group (2- weeks’ subgroup, 8- weeks’ subgroup, 18 weeks’ subgroup) and sham operation group (2-weeks’ subgroup, 8-weeks’ subgroup, 18 weeks’ subgroup) with 10 rats in each subgroup. Rats in the model group were treated with coarctation abdominal aorta to establish the model of cardiac afterload increase, and the abdominal aorta of the sham operation group was not constricted. Cardiac structure and hemodynamics were measured before operation, 2 weeks, 8 weeks and 18 weeks after operation by small animal ultrasound real-time imaging system and carotid artery cannulation. Then rats were sacrificed and the left ventricle was harvested. The rat cardiac RNA library was constructed. The library was sequenced using Illumina HiSeqTM2500 / MiseqTMand the bioinformatics analysis was performed.ResultsAt 2 weeks, 8 weeks, and 18 weeks after surgery, The mean arterial pressure, left ventricular mass, left ventricular end-diastolic dimension and left ventricular end-diastolic pressure of model group were significantly higher than those of baseline (P＜0.05). Left ventricular ejection fraction (LVE) and left ventricular pressure (LVP) were significantly lower than baseline (P＜0.05). There were no significant changes in mean arterial pressure, left ventricular end diastolic diameter, stroke volume, left ventricular ejection fraction, and left ventricular pressure in sham - operated rats compared with baseline (P＞0.05). The rat model of afterload increase was established successfully. The number of genes differentially expressed between the model group and the sham-operated group increased at the 2nd week and the 8th week compared with the baseline, and the number of the differentially expressed genes decreased at the 18th week. Compared with the sham group, the expression of genes in the model group was significantly increased at the same time. At the 2nd week, 8th week and 18th week,the number of genes differentially expressed between the model group and the sham operation group were 119, 43 and 49 genes respectively, and the number of different genes decreased significantly with time. At different time points, there was a significant difference in gene functional enrichment (GO) and pathway enrichment (KEGG) between the model group and the sham-operated group.ConclusionCompared with the sham-operated group, the number of differentially expressed genes in the early postoperative period increased significantly, and the number of the differentially expressed genes in the middle and late post-operation decreased gradually. There were significant differences in the function of different genes and related pathways at different time points.

Heart; Afterload; Gene expression; Rat

R541

A

1674-4055(2016)12-1435-06

國家自然科學基金面上項目(81273971)

1100700 北京,陸軍總醫(yī)院干四科;2300410 天津,天士力研究院藥理毒理研究中心;3100700 北京,陸軍總醫(yī)院心內(nèi)科

魏萬林,E-mail:wei_wanlin@126.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.12.07