咪達(dá)普利對氯化銨所致急性肺損傷大鼠血?dú)狻DA及AngⅡ、CD54蛋白表達(dá)的影響

黃叢富，　郝雪琴，　鄧　雯，　劉傳發(fā)，　王婷婷，　溫小利，　陶中蓉

(河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院藥學(xué)系，河南 洛陽 471003)

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咪達(dá)普利對氯化銨所致急性肺損傷大鼠血?dú)?、MDA及AngⅡ、CD54蛋白表達(dá)的影響

黃叢富，郝雪琴△，鄧雯，劉傳發(fā)，王婷婷，溫小利，陶中蓉

(河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院藥學(xué)系，河南 洛陽 471003)

[摘要]目的： 本研究通過復(fù)制氯化銨致大鼠肺損傷模型，研究咪達(dá)普利對肺損傷大鼠動脈血?dú)?、MDA、肺形態(tài)學(xué)和AngⅡ、CD54蛋白表達(dá)的影響。方法: 將30只雄性大鼠隨機(jī)分為3組：空白對照組、肺損傷模型組和藥物組。對照組大鼠腹腔注射生理鹽水2 mL/kg；肺損傷模型組大鼠腹腔注射等量6%氯化銨；藥物組大鼠在注射6%氯化銨后，每天1次灌胃咪達(dá)普利(3 mg/kg)，連續(xù)灌胃7 d；在實(shí)驗(yàn)第7天，用2%的戊巴比妥鈉麻醉，采集腹主動脈血和腹腔靜脈血樣本；肺組織經(jīng)4%多聚甲醛灌注、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋和切片。ELISA法測定血清TNF-α和IL-6水平，化學(xué)發(fā)光法測定血清MDA含量，HE染色觀察肺部形態(tài)學(xué)變化，免疫組織化學(xué)染色法觀察肺組織AngⅡ和CD54蛋白表達(dá)。結(jié)果: 與對照組相比，模型組PaCO2明顯升高(P<0.05)，血清TNF-α、IL-6和MDA濃度顯著增加(P<0.01)，氯化銨腹腔注射的肺損傷模型組大鼠出現(xiàn)肺水腫、肺炎、肺泡壁瘀血、肺泡腔出血和肺泡壁增生等損傷，肺組織AngⅡ和CD54蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，藥物組PaCO2明顯降低(P<0.05)，血清TNF-α、IL-6和MDA濃度以及肺組織AngⅡ、CD54蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)。結(jié)論: 咪達(dá)普利可顯著改善氯化銨所致肺損傷大鼠血?dú)?，抑制脂質(zhì)過氧化和血清炎癥細(xì)胞因子，降低肺組織AngⅡ和CD54蛋白表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]咪達(dá)普利； 急性肺損傷； 氯化銨

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是指由各種肺內(nèi)外致病因素中的心源性以外的因素導(dǎo)致的急性、進(jìn)行性缺氧性呼吸衰竭，并伴隨一系列嚴(yán)重的肺部炎癥過程[1-2]。作為臨床急癥之一，其發(fā)病迅速，病因復(fù)雜，搶救困難，致死率高。ALI的病因多達(dá)百余種，可以分為直接病因和間接病因。溺水、誤吸入毒物、肺挫傷和肺感染等構(gòu)成直接病因；膿毒血癥、肺部外的嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克、外科手術(shù)、重癥胰腺炎和全身嚴(yán)重感染等構(gòu)成了間接病因[3]。急性肺損傷加重則發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。目前的治療手段多為對癥治療，尚未有特效藥物。有研究表明，咪達(dá)普利(imidapril)對吸入性肺炎有較好的預(yù)防作用，它通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)活性阻斷血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)的生成[4]，從而起到預(yù)防和緩解損傷肺、消除炎癥反應(yīng)的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了咪達(dá)普利對ALI的治療作用以及對血?dú)庵笜?biāo)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、AngⅡ和CD54蛋白表達(dá)及相應(yīng)炎癥因子的影響。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)動物分組及模型制備

30只SPF級雄性SD大鼠，由華中科技大學(xué)同濟(jì)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號為SCXK(鄂)2010-0007，飼養(yǎng)于河南科技大學(xué)動物牧場，大鼠籠和所用器皿等均嚴(yán)格消毒，將SD大鼠雄鼠隨機(jī)平均分成3組：對照組、模型組和藥物組。對照組大鼠腹腔注射生理鹽水2 mL/kg；肺損傷模型組大鼠腹腔注射等量6% NH4Cl[5-6]；藥物組大鼠在注射6% NH4Cl 后，每天1次灌胃咪達(dá)普利(3 mg/kg)，連續(xù)灌胃7 d；在實(shí)驗(yàn)第7天，用2 %的戊巴比妥鈉麻醉，采集腹主動脈血和腹腔靜脈血樣本；肺組織經(jīng)4%多聚甲醛灌注、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋和切片。

2觀察指標(biāo)與實(shí)驗(yàn)方法

2.1血?dú)饧癟NF-α、IL-6和MDA濃度的測定采集的動脈血在洛陽市中心醫(yī)院呼吸科于37 ℃下測定pH、PaCO2、PaO2、Na+、K+、Ca2+、Hct等參數(shù)；靜脈血在3 000 r/min離心分離血清后用ELISA試劑盒特異性顯色，用多功能酶標(biāo)儀測定TNF-α和IL-6的濃度，化學(xué)發(fā)光法測定MDA濃度。

2.2HE染色取固定好的大鼠肺臟用手術(shù)刀修塊，從低到高梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后切片，染色前將切片于60 ℃烘箱烤片30 min，二甲苯中脫蠟，從高到低梯度乙醇浸泡復(fù)水，蘇木精染液染色5 min，自來水稍洗，1%鹽酸乙醇溶液分化5～10 s，自來水洗返藍(lán)，0.5%伊紅(水溶性)染色2 min，由低到高梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察并拍照。

2.3免疫組化染色將制作好的切片60 ℃烤片1 h，二甲苯脫蠟，高濃度乙醇到低濃度乙醇水化，3% H2O2溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶；電磁爐進(jìn)行熱抗原修復(fù)暴露抗原決定簇，冷卻后PBS沖洗2～3次，于濕盒中用5%的BSA室溫封閉非特異性蛋白20 min，甩去余液，滴加 I 抗，4 ℃孵育過夜；PBS水洗3次，II 抗37 ℃孵育30 min；PBS水洗后滴加SABC復(fù)合物37 ℃反應(yīng)20 min，DAB顯色后雙蒸水終止反應(yīng)，滴加蘇木精染液對細(xì)胞核進(jìn)行襯染，1%鹽酸乙醇分化并用自來水藍(lán)化，由低到高梯度乙醇脫水、二甲苯透明后中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察。

2.4圖像處理采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，每組免疫組化后的肺切片選取8張圖片，獲取肺組織AngⅡ和CD54蛋白表達(dá)的積分吸光度(IA)。

3統(tǒng)計學(xué)處理

各組計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多重比較用Tukey法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1咪達(dá)普利對急性肺損傷大鼠血?dú)庵笜?biāo)的影響

與對照組比較，氯化銨誘導(dǎo)的急性肺損傷模型大鼠PaCO2明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，咪達(dá)普利藥物組能明顯降低氯化銨誘導(dǎo)的急性肺損傷模型大鼠的PaCO2(P<0.05)，見表1。

2咪達(dá)普利對急性肺損傷大鼠血清TNF-α、IL-6和MDA濃度的影響

與對照組比較，氯化銨誘導(dǎo)的急性肺損傷模型大鼠血清中TNF-α、IL-6和MDA的濃度顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，咪達(dá)普利藥物組能顯著降低大鼠血清中TNF-α、IL-6和MDA的濃度(P<0.01)，見圖1、表2。

表1　各組血?dú)庵笜?biāo)測定結(jié)果

*P<0.05vsmodel group.

Figure 1.Comparison of serum concentrations of TNF-α, IL-6 and MDA in each group. Mean±SEM.n=10.**P<0.01vsmodel.

圖1各組血清中TNF-α、IL-6和MDA濃度的比較

3咪達(dá)普利對急性肺損傷形態(tài)學(xué)的影響

肺組織形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果顯示，與對照組相比，肺損傷模型組支氣管周圍藍(lán)染細(xì)胞聚集較多，以I型肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷為主，肺泡間質(zhì)水腫伴大量炎癥細(xì)胞滲出，可見實(shí)變及肺泡塌陷及透明膜形成，有明顯的炎癥細(xì)胞(單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和白細(xì)胞)浸潤，尤其是在支氣管附近，而且在肺泡壁內(nèi)有大量紅細(xì)胞，瘀血嚴(yán)重，另外，肺泡壁厚度也明顯增加，有增生現(xiàn)象；與肺損傷模型組相比，藥物治療組I型肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度減輕，藥物組肺泡壁的厚度明顯變小，而且厚度與對照組相當(dāng)，增生現(xiàn)象減弱或消失，肺泡腔和肺泡壁中的紅染相對較少，紅細(xì)胞滲出不太明顯，出血或瘀血現(xiàn)象在一定程度上得到控制，見圖2。

4咪達(dá)普利對急性肺損傷大鼠肺組織AngⅡ表達(dá)的影響

免疫組化染色后經(jīng)蘇木精襯染，可見藍(lán)紫色細(xì)胞核。與對照組相比，模型組大鼠肺組織棕色顆粒表達(dá)最多，表現(xiàn)為胞體外形肥大，突起變短增粗，染色加深；藥物組陽性表達(dá)相對較少，棕色顆粒數(shù)目有很大程度地下降，見圖3。

Figure 2.Morphology change of lung tissue in each group (HE staining,×400).

圖2各組大鼠肺臟形態(tài)學(xué)損傷表現(xiàn)

Figure 3.Immunohistochemical detection for Ang Ⅱ expression in lung (×400). Mean±SEM.n=10.**P<0.01vsmodel.

圖3免疫組化顯示肺臟Ang Ⅱ的表達(dá)

5咪達(dá)普利對急性肺損傷CD54蛋白表達(dá)的影響

免疫組化染色圖片顯示，CD54蛋白主要分布于肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞的胞膜和胞漿中，經(jīng)免疫組化染色，細(xì)胞核藍(lán)染，核周圍呈現(xiàn)棕染。對照組出現(xiàn)少量的棕染；模型組染色加深,陽性表達(dá)增多，藥物組陽性表達(dá)相對較少，棕色顆粒數(shù)目有很大程度的下降。與對照組相比，氯化銨模型組CD54蛋白陽性表達(dá)顯著增多(P<0.01)；與氯化銨組相比，咪達(dá)普利組CD54蛋白陽性表達(dá)顯著減少(P<0.01)，表明用氯化銨腹腔注射大鼠引發(fā)炎癥反應(yīng)使肺組織中的CD54蛋白表達(dá)增多，而咪達(dá)普利灌胃大鼠減輕炎癥反應(yīng)而使得肺組織中CD54蛋白表達(dá)減少，見圖4。

討論

隨著人口中國老齡化的加大和突發(fā)新發(fā)疾病的增多，ALI/ARDS作為危重病領(lǐng)域的難題，尋找更多更有效的治療途徑已經(jīng)激發(fā)了研究者們的濃厚興趣。ALI/ARDS引發(fā)局部肺組織水腫、充血、出血及凝血[7]，肺泡塌陷，肺毛細(xì)血管膜損傷及伴隨肺間質(zhì)的纖維化，臨床表現(xiàn)呼吸頻數(shù)增加，呼吸窘迫，頑固性低氧血癥，胸部X線顯示雙肺彌漫性浸潤，易并發(fā)多器官衰竭[8]。與正常組相比，ALI/ARDS模型血清中TNF-α含量明顯升高。TNF-α作為巨噬細(xì)胞的功能蛋白，能夠特異性反映巨噬細(xì)胞分布的變化。TNF-α對肺臟有一定的毒性，它能夠增加肺組織血管通透性，活化內(nèi)皮細(xì)胞，組織中TNF-α濃度的增加使肺組織損傷加劇[9-10]。因此，在組織病理學(xué)層面，觀察肺組織形態(tài)的變化，測定巨噬細(xì)胞的分布和細(xì)胞因子的濃度，能夠了解肺部組織的炎癥和損傷情況。

早期的ALI病理表現(xiàn)為肺血?dú)馄琳贤ㄍ感栽龈?，肺泡與肺間質(zhì)內(nèi)積聚有大量的水腫液，水腫液中含多種炎癥細(xì)胞，其中中性粒細(xì)胞占主要成分。附著在損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的中性粒細(xì)胞，逐漸移向肺間質(zhì)和肺泡腔中，并釋放大量炎癥細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6等)和過氧化物等，這些炎癥介質(zhì)進(jìn)一步誘導(dǎo)了肺損傷。除此之外，凝血和纖溶發(fā)生的紊亂也加重了ALI的病程，引發(fā)血管栓塞以及微循環(huán)結(jié)構(gòu)受損[7]。

Figure 4.Immunohistochemical detection for CD54 protein expression in lung (×400). Mean±SEM.n=10.**P<0.01vsmodel.

圖4免疫組化顯示肺臟CD54蛋白的表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)中，血?dú)庵笜?biāo)顯示，我們構(gòu)建的模型組PaCO2有所升高(P<0.05)，動脈血液中CO2分壓的升高說明肺臟氣體交換效率降低，影響機(jī)體換氣功能；同時300>P/F>200(PO2/FiO2≈ 278，F(xiàn)iO2=0.21)，實(shí)驗(yàn)應(yīng)用NH4Cl 8 h后取組織，損傷建立時間小于1周，依據(jù)柏林診斷標(biāo)準(zhǔn)[11-13]，該模型已構(gòu)成輕度ALI，實(shí)驗(yàn)建模成功。在藥物組，PaCO2明顯降低，表明肺臟氣體交換能力得到一定改善。咪達(dá)普利對ALI引發(fā)的PaCO2升高產(chǎn)生了明顯的緩解作用，這可能是咪達(dá)普利通過抑制脂質(zhì)過氧化和肺部炎癥反應(yīng)，提高血氧結(jié)合比，從而改善肺部功能。

通過免疫組化實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)模型組AngⅡ和CD54陽性表達(dá)比對照組顯著增多(P<0.01)。NH4Cl使血管通透性增加，引發(fā)水腫、充血和出血，這些炎癥變化使血漿中的單核細(xì)胞透過血管壁進(jìn)入肺組織中轉(zhuǎn)變?yōu)锳M，肺組織中的AM大量聚集，AngⅡ和CD54陽性表達(dá)增多。咪達(dá)普利組AngⅡ和CD54表達(dá)與模型組相比顯著降低，可能的原因是咪達(dá)普利在體內(nèi)代謝成咪達(dá)普利拉，后者抑制了ACE活性，使AngⅡ生成減少[17]，AngⅡ?qū)P-1和NF-κB的激活能力相應(yīng)減弱，NF-κB對細(xì)胞因子、黏附分子等基因轉(zhuǎn)錄的促進(jìn)作用相應(yīng)減弱，使單核細(xì)胞轉(zhuǎn)變成AM的數(shù)量減少[18-19]。

綜上所述，NH4Cl增加血管壁通透性，導(dǎo)致組織水腫、充血、出血、炎癥細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)滲出增多，I型肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，AngⅡ和CD54蛋白表達(dá)增高；炎癥使肺泡壁增厚，血?dú)饨粨Q降低，同時激活了RAS，使肺部脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)，MDA生成增多。咪達(dá)普利通過發(fā)揮ACEI作用，降低RAS活性，抑制脂質(zhì)過氧化和肺部炎癥反應(yīng)，使單核細(xì)胞向AM轉(zhuǎn)化減少，血氧結(jié)合比提高，肺功能得到一定程度改善。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Effects of imidapril on blood gas, oxidative stress and inflammatory factors in rats with acute lung injury induced by ammonium chlorideHUANG Cong-fu, HAO Xue-qin, DENG Wen, LIU Chuan-fa, WANG Ting-ting, WEN Xiao-li, TAO Zhong-rong

(DepartmentofPharmacy,CollegeofAnimalScienceandTechnology,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luo-yang471003,China.E-mail:haohaoxq@139.com)

[ABSTRACT]AIM: In this study, the rat lung injury model was induced by ammonium chloride for studying the effect of imidapril on blood gas, serum TNF-α, IL-6 and MDA concentrations, and AngⅡ and CD54 protein expression in rat lung tissue. METHODS: Male rats were randomly divided into 3 groups: control group, lung injury model group and drug group. The rats in control group were given saline (2 mL/kg), while the rats in lung injury model group were given 6% ammonium chloride (2 mL/kg). In drug group, imidapril (3 mg·kg-1·d-1) was given to the rats once daily for 1 week by intragastric gavage after given 6% ammonium chloride. On the 7th day, the rats were anesthetized with 2% so-dium pentobarbital. Abdominal aorta blood, venous blood and lung tissue were collected. The blood gas indexes and serum TNF-α, IL-6 and MDA concentrations were determined. The lung tissues were fixed and sliced, and the expression of AngⅡ and CD54 proteins was detected by immunohistochemistry. RESULTS: The PaCO2increased in lung injury model group compared with control group and drug group (P<0.05).The expression of AngⅡ and CD54, and the concentrations of TNF-α, IL-6 and MDA also increased significantly (P<0.01) in model group. Pulmonary edema, inflammation, alveolus congestion, hemorrhage and hyperplasia in model group were obvious compared with control group and drug group. CONCLUSION: Imidapril improves blood gas indexes, and reduces lipid peroxidation and inflammatory responses in the rats with lung injury induced by ammonium chloride.

[KEY WORDS]Imidapril; Acute lung injury; Ammonium chloride

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.015

[中圖分類號]R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

通訊作者△Tel： 0379-64280319； E-mail: haohaoxq@139.com

[收稿日期]2015- 08- 06[修回日期] 2015- 10- 09

[文章編號]1000- 4718(2016)02- 0278- 06