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    BMP-7對(duì)高糖環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞Id2和E2A蛋白表達(dá)的影響*

    2016-03-05 02:20:53曾令萍張瑩瑩張昌志吳德佩李圓圓石明雋
    中國(guó)病理生理雜志 2016年2期
    關(guān)鍵詞:高糖腎小管纖維化

    曾令萍, 肖 瑛, 張瑩瑩, 張昌志, 吳德佩, 李圓圓, 石明雋, 郭 兵

    (貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室,貴州 貴陽 550025)

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    BMP-7對(duì)高糖環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞Id2和E2A蛋白表達(dá)的影響*

    曾令萍,肖瑛△,張瑩瑩,張昌志,吳德佩,李圓圓,石明雋,郭兵

    (貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室,貴州 貴陽 550025)

    [摘要]目的: 通過觀察高糖環(huán)境下給予外源性骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP-7)對(duì)腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)表達(dá)分化抑制因子2(Id2)和轉(zhuǎn)錄因子E2A的影響,探討B(tài)MP-7減輕高糖誘導(dǎo)的腎小管纖維化病變的可能機(jī)制。方法: 將體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E分為3組:對(duì)照(control)組、高糖(HG)組和不同濃度BMP-7(10 μg/L和20 μg/L)干預(yù)組,HG組和干預(yù)組分別設(shè)12 h、24 h和48 h 3個(gè)時(shí)點(diǎn)。Western blot方法檢測(cè)Id2、E2A、上皮細(xì)胞鈣粘蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和Ⅰ型膠原(Col-Ⅰ)蛋白的表達(dá),real-time PCR方法檢測(cè)Id2 mRNA的表達(dá)。結(jié)果: 與control組相比,HG組Id2的mRNA和蛋白水平及E-cadherin的蛋白水平明顯下調(diào),E2A、α-SMA和Col-Ⅰ的蛋白水平明顯上調(diào)(P<0.05);與HG組相比,20 μg/L BMP-7干預(yù)組Id2的mRNA和蛋白水平及E-cadherin的蛋白水平均較同時(shí)點(diǎn)顯著上調(diào),E2A、α-SMA和Col-Ⅰ的蛋白水平顯著下調(diào)(P<0.05)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,Id2蛋白與E2A蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論: BMP-7可阻斷高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的纖維化,其機(jī)制可能與促進(jìn)Id2蛋白并抑制E2A蛋白的表達(dá)有關(guān)。

    [關(guān)鍵詞]NRK-52E細(xì)胞; 高糖; 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7; 分化抑制因子2; E2A

    糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)常見而嚴(yán)重的并發(fā)癥,進(jìn)行性發(fā)展可導(dǎo)致終末期腎衰竭,深入研究防治DN纖維化病變的發(fā)生機(jī)制,對(duì)疾病的轉(zhuǎn)歸具有重要意義。分化抑制因子(inhibitor of differentiation,Id)屬于螺旋-環(huán)-螺旋(helix-loop-helix,HLH)轉(zhuǎn)錄因子家族,因缺乏堿性區(qū)域,可以與堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子(basic helix-loop-helix,bHLH)E2A相結(jié)合形成異二聚體,從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞含4種Id蛋白:Id1、 Id2、Id3和Id4。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),DM大鼠隨病程的延長(zhǎng)腎組織中Id2蛋白逐漸減少,促進(jìn)了腎小管上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)及腎間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的沉積;控制血糖后Id2水平被上調(diào),恢復(fù)了Id2對(duì)腎纖維化的負(fù)調(diào)節(jié)作用,從而使EMT過程逆轉(zhuǎn),ECM沉積減輕[1]。另有研究發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(bone morphogenetic protein 7,BMP-7)具有抗纖維化作用,已有研究表明在肝纖維化、腎纖維化和肺纖維化疾病中BMP-7都能明顯降低細(xì)胞的纖維化水平[2-4]。在小鼠晶狀體上皮細(xì)胞中過表達(dá)BMP-7后可上調(diào)Id2、Id3的表達(dá),從而逆轉(zhuǎn)小鼠因損傷誘導(dǎo)的EMT[5]。這些都提示在EMT的發(fā)生發(fā)展中BMP-7、Id2和E2A之間有著密切的聯(lián)系,而在高糖環(huán)境中三者的關(guān)系尚不清楚。本研究旨在觀察外源性BMP-7對(duì)高糖環(huán)境中腎小管上皮細(xì)胞Id2和E2A表達(dá)的影響,探討B(tài)MP-7減輕高糖狀態(tài)下腎小管纖維化的作用機(jī)制。

    材料和方法

    1細(xì)胞

    大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E細(xì)胞株購(gòu)于上海中科院細(xì)胞庫(kù)。

    2主要試劑

    兩步法免疫組化檢測(cè)試劑、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋);I抗稀釋液、ECL 顯色劑、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、牛血清白蛋白(碧云天);苯甲基磺酰氟(phenyl methyl sulfonyl fluoride,PMSF)和RIPA細(xì)胞裂解液(索萊寶);PVDF膜、3 mm Whatman濾紙(Millipore);低糖DMEM 培養(yǎng)基、胰酶蛋白、青霉素和鏈霉素(HyClone);胎牛血清(Gibco);RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo);iQTMSYBR?Green Supermix(Bio-Rad);Id2、E2A抗體(Santa Cruz);rhBMP-7(Sigma);Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ,Col-Ⅰ)抗體(北京博奧森);α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、上皮細(xì)胞鈣黏蛋白(E-cadherin)、β-actin抗體(武漢博士德)。

    3主要方法

    3.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組把NRK-52E細(xì)胞復(fù)蘇接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中,用含10% 胎牛血清的DMEM(含5.5 mmoL/L葡萄糖)培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察,待細(xì)胞融合度達(dá)80%~90%時(shí)進(jìn)行傳代。將狀態(tài)良好的細(xì)胞同步化處理后隨機(jī)分為3組:對(duì)照(control)組:用含有2% 胎牛血清的DMEM (含5.5 mmoL/L葡萄糖)培養(yǎng),同步化后不予任何處理;高糖(high glucose,HG)組:用含有2% 胎牛血清的DMEM(含25 mmoL/L葡萄糖)培養(yǎng);10 μg/L和20 μg/L BMP-7干預(yù)組:在含有2% 胎牛血清的DMEM(含25 mmoL/L葡萄糖)中加入不同濃度的BMP-7,使其終濃度分別為10 μg/L和20 μg/L。在高糖誘導(dǎo)和BMP-7干預(yù)后的12 h、24 h和48 h 3個(gè)時(shí)點(diǎn)收集RNA或蛋白進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    3.2免疫細(xì)胞化學(xué)染色將NRK-52E細(xì)胞接種至鋪有22 mm×22 mm蓋玻片的6孔板中,生長(zhǎng)融合度達(dá)80%時(shí),細(xì)胞同步化處理,PBS漂洗,細(xì)胞固定液固定,3% H2O2浸泡消除內(nèi)源性過氧化物酶,10% 牛血清白蛋白封閉,予細(xì)胞角蛋白18(cytokeratin,CK18; 1∶50)、E-cadherin(1∶100)和α-SMA(1∶300)特異性抗體4 ℃孵育過夜。PBS漂洗后滴加即用型生物素標(biāo)記的 II 抗,DAB室溫顯色,蘇木素復(fù)染,脫水,透明,晾干后,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察并攝取圖像。

    3.3Western blot檢測(cè)目的蛋白棄去細(xì)胞培養(yǎng)基后用生理鹽水清洗3次,加入細(xì)胞蛋白裂解液裂解細(xì)胞,12 000 r/min離心10 min,將上清轉(zhuǎn)移置一新的EP管中,取部分蛋白使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。然后根據(jù)蛋白濃度加入上樣緩沖液配制成統(tǒng)一濃度的蛋白樣品,煮沸10 min。蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,TBST洗膜,分別加入Id2(1∶100)、E2A(1∶300)、E-cadherin(1∶200)、α-SMA(1∶200)和Col-Ⅰ(1∶200)的 I抗,4 ℃孵育過夜,TBST洗膜后加入相應(yīng) II 抗室溫孵育1 h,ECL顯影,壓片并分析結(jié)果。

    3.4Real-time PCR檢測(cè)Id2 mRNA的表達(dá)TRIzol法提取總RNA,核酸蛋白儀檢測(cè)RNA濃度和純度后,使用Thermo試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。通過Bio-Rad CFX 96TM熒光定量PCR分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè),以β-actin為內(nèi)參照,目的基因的相對(duì)含量以2-△△Ct表示,引物序列和退火溫度見表1。

    表1PCR引物序列及擴(kuò)增條件

    Table 1.The sequences and conditions of primers used in real-time PCR

    Name Sequences(5'-3')AnnealingtemperatureId2Forward:TACGAGCAGCATGAAAGCCT58℃Reverse:GAGCTTGGAGTAGCAGTCGTβ-actinForward:GCCAACACAGTGCTGTCT58℃Reverse:AGGAGCAATGATCTTGATCTT

    4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    所有數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組比較采用單因素方差分析,若方差齊時(shí),采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn);若方差不齊時(shí),則采用Games-Howell法檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié)果

    1NRK-52E細(xì)胞中CK-18、α-SMA和E-cadherin的表達(dá)

    免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,在培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞中腎小管上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白CK-18、E-cadherin蛋白表達(dá)陽性,α-SMA表達(dá)陰性,說明培養(yǎng)的細(xì)胞為大鼠腎小管上皮細(xì)胞,見圖1。

    2BMP-7對(duì)高糖培養(yǎng)不同時(shí)點(diǎn)NRK-52E細(xì)胞中E-cadherin、α-SMA和Col-Ⅰ蛋白表達(dá)的影響

    Western blot結(jié)果顯示,與control組相比,HG組E-cadherin蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05),以HG刺激24 h組減少最為顯著;與HG組比較,10 μg/L BMP-7干預(yù)組E-cadherin蛋白僅24 h時(shí)增多(P<0.05);而20 μg/L BMP-7干預(yù)組E-cadherin蛋白在12 h、 24 h和48 h表達(dá)均顯著高于同期HG組(P<0.05),24 h達(dá)最高峰。

    Figure 1.Immunocytochemistry staining of CK-18, E-cadherin and α-SMA in NRK-52E cells (×400).

    圖1CK-18、E-cadherin和α-SMA在NRK-52E細(xì)胞中的表達(dá)

    α-SMA在control組有少量表達(dá),HG 12 h、24 h和48 h其表達(dá)均顯著高于control組(P<0.05);加入外源性10 μg/L的BMP-7干預(yù)后,HG 12 h和24 h組α-SMA的表達(dá)顯著低于同期HG組(P<0.05),而20 μg/L BMP-7干預(yù)組,各時(shí)點(diǎn)的α-SMA的表達(dá)均顯著低于同期HG組(P<0.05)。

    在control組Col-I有少量表達(dá),HG 12 h、24 h和48 h其表達(dá)均顯著高于control組(P<0.05);加入外源性BMP-7(10 μg/L或20 μg/L)后,Col-Ⅰ的蛋白表達(dá)較同期HG組均下調(diào)(P<0.05),見圖2。

    3BMP-7對(duì)高糖培養(yǎng)不同時(shí)點(diǎn)NRK-52E細(xì)胞中Id2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

    Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示,與control組相比,HG組Id2的mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);20 μg/L BMP-7干預(yù)組,各時(shí)點(diǎn)Id2的mRNA和蛋白的表達(dá)較同期HG組明顯上調(diào)(P<0.05);而在10 μg/L BMP-7干預(yù)組,Id2的mRNA和蛋白僅在24 h時(shí)點(diǎn)表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05),見圖3。

    4BMP-7對(duì)高糖培養(yǎng)不同時(shí)點(diǎn)NRK-52E細(xì)胞中E2A蛋白表達(dá)的影響

    Western blot結(jié)果顯示,與control組相比,HG 12 h、24 h和48 h組E2A的表達(dá)均明顯增多(P<0.05);BMP-7干預(yù)組(10 μg/L和20 μg/L)組各時(shí)點(diǎn)E2A表達(dá)較同期HG組均明顯下調(diào)(P<0.05),見圖4。

    Figure 2.The effects of BMP-7 on the protein expression of E-cadherin, α-SMA and Col-I in NRK-52E cells under different conditions. Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsHG group.

    圖2BMP-7對(duì)高糖培養(yǎng)不同時(shí)點(diǎn)NRK-52E細(xì)胞中E-cadherin、α-SMA 和Col-Ⅰ蛋白表達(dá)的影響

    Figure 3.The effects of BMP-7 on the mRNA and protein expression of Id2 in NRK-52E cells under different conditions. Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol group;*P﹤0.05vsHG group.

    圖3BMP-7對(duì)高糖培養(yǎng)不同時(shí)點(diǎn)NRK-52E細(xì)胞中mRNA和Id2蛋白表達(dá)的影響

    Figure 4.The effects of BMP-7 on the protein expression of E2A in NRK-52E cells under different conditions. Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsHG group.

    圖4BMP-7對(duì)高糖培養(yǎng)不同時(shí)點(diǎn)NRK-52E細(xì)胞中E2A蛋白表達(dá)的影響

    5高糖條件下不同時(shí)點(diǎn)NRK-52E細(xì)胞中Id2蛋白與E2A蛋白表達(dá)量的相關(guān)性分析

    相關(guān)性分析結(jié)果顯示,Id2蛋白與E2A蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān),在12 h、24 h和48 h這3個(gè)時(shí)點(diǎn)的相關(guān)系數(shù)分別為-0.869、-0.957和-0.991(P<0.05),見圖5。

    Figure 5.Correlation analysis between Id2 and E2A protein expression at different time points in NRK-52E cells under high glucose conditions.

    圖5高糖條件下不同時(shí)點(diǎn)NRK-52E細(xì)胞中Id2蛋白與E2A蛋白表達(dá)量的相關(guān)性分析

    討論

    大量研究表明,腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT后伴隨ECM的生成增多和降解減少,是腎小管間質(zhì)纖維化包括DN發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一[6]。本研究顯示,高糖培養(yǎng)NRK-52E細(xì)胞12 h、24 h和48 h后,腎小管上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白E-cadherin的表達(dá)顯著減少,間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白α-SMA的表達(dá)明顯增多,并伴有Col-Ⅰ的高表達(dá),這表明在高糖持續(xù)刺激下NRK-52E細(xì)胞發(fā)生了EMT,同時(shí)合成和分泌大量ECM。這與本課題前期研究結(jié)果一致[7]。

    Id 蛋白是一種廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)錄因子的負(fù)調(diào)控蛋白,屬于HLH 轉(zhuǎn)錄因子家族特別成員,哺乳動(dòng)物含有4種Id因子(Id1~I(xiàn)d4),119~199 個(gè)氨基酸殘基。Id蛋白缺乏堿性DNA結(jié)合區(qū),可以與bHLH形成異二聚體,抑制bHLH與DNA及其它組織特異性bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,抑制細(xì)胞分化并促進(jìn)細(xì)胞的增殖[8]。目前有研究發(fā)現(xiàn),Id2與一些臟器纖維化有關(guān),并且有維持細(xì)胞正常生物學(xué)形態(tài)和抑制轉(zhuǎn)分化的作用。過表達(dá)Id2可以維持肺泡上皮細(xì)胞表型,減輕肺纖維化[9]。在肝星狀細(xì)胞中,通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染Id2可顯著抑制α-SMA和Col-Ⅰ的mRNA表達(dá),調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化[10]。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究Id2在腫瘤、免疫系統(tǒng)及纖維化疾病中的作用機(jī)制時(shí),都涉及到bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子E2A基因[11-13]。E2A基因(又稱TCF3,免疫球蛋白增強(qiáng)子結(jié)合因子E12/E47,ITF1)可以編碼2種不同類型的蛋白產(chǎn)物,分別為E47和E12。已有研究證明E12和E47抑制E-cadherin表達(dá)并且可以調(diào)控α-SMA的表達(dá)[14-15]。免疫抑制劑環(huán)孢菌素A誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2發(fā)生EMT過程中E2A表達(dá)逐漸增多;另外過表達(dá)E2A后α-SMA表達(dá)增多,E-cadherin表達(dá)減少,表明E2A在環(huán)孢菌素A誘導(dǎo)的EMT進(jìn)展中有著重要作用[16]。Kondo等[11]研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1誘導(dǎo)小鼠乳腺上皮細(xì)胞NMuMG的過程中能與E2A相互作用的Id蛋白表達(dá)下調(diào),E2A產(chǎn)物增多并直接抑制E-cadherin表達(dá),最終發(fā)生EMT。本研究顯示,高糖刺激NRK-52E細(xì)胞后,Id2的蛋白和mRNA表達(dá)減少而E2A表達(dá)增多,且二者呈顯著的負(fù)相關(guān)并伴隨E-cadherin的表達(dá)顯著減少,α-SMA的表達(dá)明顯增多及Col-Ⅰ的增多,提示高糖環(huán)境中Id2和E2A蛋白參與了腎小管上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生過程。

    BMP-7作為一種成骨蛋白,屬于TGF-β超家族中的一員,是維持腎臟正常發(fā)育的重要因子。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),高糖刺激腎小管上皮細(xì)胞,BMP-7的蛋白和mRNA表達(dá)顯著減少[17]。相反,Wang等[18]運(yùn)用基因轉(zhuǎn)染動(dòng)物在DN病程中過表達(dá)BMP-7,可減輕尿蛋白的含量,改善腎功能,減少腎間質(zhì)Col-Ⅰ及FN的沉積。Veerasamy等[19]也發(fā)現(xiàn)外源性的BMP-7可以通過Smad1/5信號(hào)通路上調(diào)Id2的表達(dá)來抑制TGF-β1刺激人近端腎小管上皮細(xì)胞后引起的α-SMA增多。然而,在高糖狀態(tài)下,腎小管上皮細(xì)胞Id2和E2A表達(dá)變化是否受到BMP-7調(diào)節(jié),目前還不清楚。因此,我們體外培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞,在高糖環(huán)境中同時(shí)加入不同劑量的BMP-7(10 μg/L和20 μg/L),并設(shè)12 h、24 h和48 h 3個(gè)時(shí)點(diǎn),觀察BMP-7對(duì)高糖狀態(tài)下Id2和E2A表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,BMP-7可以顯著逆轉(zhuǎn)同時(shí)點(diǎn)高糖誘導(dǎo)的Id2的mRNA和蛋白下調(diào)及E2A蛋白的上調(diào),使E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào),而α-SMA和Col-Ⅰ蛋白表達(dá)下調(diào),提示Id2的mRNA和蛋白減少及E2A蛋白增多,可能是高糖狀態(tài)下腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT,腎間質(zhì)出現(xiàn)ECM沉積的原因之一,而BMP-7可能通過Smad1/5信號(hào)通路誘導(dǎo)Id2表達(dá),抑制E2A活性,恢復(fù)E-cadherin的表達(dá),減輕腎小管上皮細(xì)胞的EMT,減少腎間質(zhì)ECM的沉積,減輕腎纖維化病變。但是Id2是直接還是通過某些機(jī)制調(diào)控E2A的還不清楚,需要進(jìn)一步研究。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1]文菁穎,蘇博,肖瑛,等. DM大鼠腎組織Id2蛋白表達(dá)變化與纖維化病變發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究[J]. 貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2015, 40(4):330-336.

    [2]Yang G, Zhu Z, Wang Y, et al. Bone morphgenetic protein inhibits silica-induced pulmonary fibrosis in rat[J]. Toxicol Lett, 2013, 220(2):103-108.

    [3]Wang SL, Yang CQ, Qi XL, et al. Inhibitory effect of bone morphogenetic protein-7 on hepatic fibrosis in rats[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2013, 6(5):897-903.

    [4]Wang Z, Zhao J, Zhang J, et al. Protective effect of BMP-7 against aristolochic acid-induced renal tubular epithelial cell injury[J]. Toxicol Lett, 2010, 198(3):348-357.

    [5]Saika S, Ikeda K, Yamanka O, et al. Adenoviral gene transfer of BMP-7, Id2, or Id3 suppresses injury-induced epithelial-to-mesenchymal transition of lens epithelium in mice[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2006, 290(1):C282-C289.

    [6]Galichon P, Finianos S, Hertig A. EMT-MET in renal disease:should we curb our enthusiasm?[J]. Cancer Lett, 2013, 341(1):24-29.

    [7]石春花,石明雋,王圓圓,等. MG132對(duì)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞SnoN蛋白表達(dá)及纖維化效應(yīng)的影響[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2015, 31(1):64-68.

    [8]Ling F, Kang B, Sun XH. Id proteins:small molecules, mighty regulators[J]. Curr Top Dev Biol, 2014, 110:189-216.

    [9]Yang J, Velikoff M, Agarwal M, et al. Overexpression of inhibitor of DNA-binding 2 attenuates pulmonary fibrosis through regulation of c-Abl and Twist[J]. Am J Pathol, 2015, 185(4):1001-1012.

    [10]Tajima K, Terai S, Takami T, et al. Importance of inhibitor of DNA binding/differentiation 2 in hepatic stellate cell differentiation and proliferation[J]. Hepatol Res, 2007, 37(8):647-655.

    [11]Kondo M, Cubillo E, Tobiume K, et al. A role for Id in the regulation of TGF-β-induced epithelial-mesenchymal transdifferentiation[J]. Cell Death Differ, 2004, 11(10):1092-1101.

    [12]Masson F, Ghisi M, Groom JR, et al. Id2 represses E2A-mediated activation of IL-10 expression in T cells[J]. Blood, 2014, 123(22):3420-3428.

    [13]Patel D, Morton DJ, Carey J, et al. Inhibitor of differentiation 4 ( ID4) :from development to cancer[J]. Biochim Biophys Acta, 2015, 1855(1):92-103.

    [14]Peinado H, Marin F, Cubillo E, et al. Snail and E47 repressors of E-cadherin induce distinct invasive and angiogenic propertiesinvivo[J]. J Cell Sci, 2004, 117(13):2827-2839.

    [15]Kumar MS, Hendrix JA, Johnson AD, et al. Smooth muscle alpha-actin gene requires two E-boxes for proper expressioninvivoand is a target of class I basic helix-loop-helix proteins[J]. Circ Res, 2003, 92(8):840-847.

    [16]Slattery C, McMorrow T, Ryan MP. Overexpression of E2A proteins induces epithelial-mesenchymal transition in human renal proximal tubular epithelial cells suggesting a potential role in renal fibrosis[J]. FEBS Lett, 2006, 580(17):4021-4030.

    [17]肖瑛,方開云,石明雋,等. P38MAPK介導(dǎo)高糖下調(diào)腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)BMP-7[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2010, 26(9):1759-1763.

    [18]Wang S, de Caestecker M, Kopp J, et al. Renal bone morphogenetic protein-7 protects against diabetic nephropathy[J]. J AM Nephrol, 2006, 17(9):2504-2512.

    [19]Veerasamy M, Phanish M, Dockrell ME. Smad mediated regulation of inhibitor of DNA binding 2 and its role in phenotypic maintenance of human renal proximal tubule epithelial cells[J]. PLoS One, 2013, 8(1):e51842.

    (責(zé)任編輯: 陳妙玲, 余小慧)

    Effects of BMP-7 on Id2 and E2A expression in NRK-52E cells exposed to high glucoseZENG Ling-ping, XIAO Ying, ZHANG Ying-ying, ZHANG Chang-zhi, WU De-pei, LI Yuan-yuan, SHI Ming-jun, GUO Bing

    (DepartmentofPathophysiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,China.E-mail:yxhx20060725@126.com)

    [ABSTRACT]AIM: To investigate the effects of bone morphogenetic protein 7 (BMP-7) on the expression of transcription factor E2A and inhibitor of differentiation 2 (Id2) in the renal tubule epithelial cells(NRK-52E)exposed to high glucose, and to explore its possible mechanism of improving renal tubular fibrosis induced by high glucose. METHODS: The NRK-52E cells were divided into control group, high glucose (HG) group and high glucose with different doses of BMP-7 (10 μg/L and 20 μg/L) group. The cells in HG group and BMP-7 group were cultured for 12 h, 24 h and 48 h. The protein expression of Id2, E2A, E-cadherin, α-smooth muscle actin (α-SMA) and collagen-I was detected by Western blot. In addition, the mRNA expression of Id2 was detected by real-time PCR. RESULTS: Compared with control group, the mRNA and protein levels of Id2 and the protein level of E-cadherin were down-regulated, while the protein levels of E2A, α-SMA and collagen-I were up-regulated in HG group (P<0.05). Compared with HG group, the mRNA and protein levels of Id2 and the protein level of E-cadherin were significantly up-regulated, while the protein expression of E2A, α-SMA and collagen-I was significantly down-regulated in 20 μg/L BMP-7 group (P<0.05). The correlation analysis showed that the Id2 protein level was negatively correlated with the E2A protein level (P<0.05). CONCLUSION: BMP-7 may intercept the process of renal tubule fibrosis induced by high glucose via promoting the expression of Id2 and inhibiting the expression of E2A at protein level.

    [KEY WORDS]NRK-52E cells; High glucose; Bone morphogenetic protein-7; Inhibitor of differentiation 2; E2A

    doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.022

    [中圖分類號(hào)]R363; R 573.1

    [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

    通訊作者△Tel: 0851-8174011; E-mail: yxhx20060725@126.com

    *[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81360116);貴州省科學(xué)技術(shù)基金(黔科合J字[2011]2120號(hào));貴州省衛(wèi)生廳科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(黔衛(wèi)發(fā)[2013]71號(hào))

    [收稿日期]2015- 08- 28[修回日期] 2015- 12- 08

    [文章編號(hào)]1000- 4718(2016)02- 0321- 06

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