銀杏黃酮對人單核細(xì)胞泡沫化形成的作用研究

陳薇　劉力豪　劉婉贏　王良波　蔡琨　羅坤

【摘 要】 目的：銀杏黃酮具有多種生理活性，是臨床治療和預(yù)防心腦血管疾病的首選天然藥物。通過觀察銀杏黃酮對人單核細(xì)胞THP-1源性泡沫細(xì)胞膽固醇含量的影響，探討銀杏黃酮對人單核細(xì)胞THP-1泡沫化形成的機(jī)制。方法：以氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)人THP-1單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞模型，通過油紅O染色觀察銀杏黃酮對泡沫細(xì)胞形成的影響，膽固醇氧化酶法測定細(xì)胞內(nèi)總膽固醇蓄積情況。結(jié)果：利用ox-LDL能使人單核細(xì)胞THP-1形成穩(wěn)定的泡沫細(xì)胞模型，用銀杏黃酮干預(yù)后，泡沫細(xì)胞中總膽固醇的含量顯著減少。結(jié)論：銀杏黃酮能抑制 THP-1 源性泡沫細(xì)胞的形成，并減少 THP-1 源性泡沫細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量。

【關(guān)鍵詞】 銀杏黃酮；THP-1源性巨噬細(xì)胞；泡沫細(xì)胞；膽固醇

【中圖分類號】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2016）01-0021-02

動脈粥樣硬化（atherosclerosis， AS）是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，由 AS所致的心血管疾病已成為我國居民死亡的主要原因。銀杏在我國中藥應(yīng)用中有悠久的歷史，藥用范圍十分廣泛，主要的活性成分為銀杏黃酮及內(nèi)酯類。其中，銀杏黃酮具有多種生理活性，是較好的天然抗氧劑，能清除生物體內(nèi)過剩的自由基，阻止體內(nèi)脂質(zhì)過快氧化，改善神經(jīng)調(diào)節(jié)作用，提高機(jī)體的免疫力，抑制細(xì)胞凋亡，抗腫瘤、抗衰老等，是臨床治療和預(yù)防心腦血管疾病的首選天然藥物[1]。

動脈粥樣硬化發(fā)生的早期事件和關(guān)鍵環(huán)節(jié)是膽固醇酯的沉積和巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成[2-4]，減少細(xì)胞外膽固醇流入細(xì)胞內(nèi)，將有利于防止泡沫細(xì)胞形成，進(jìn)而達(dá)到防治動脈粥樣硬化的目的。研究以THP- 1源性巨噬細(xì)胞為研究對象，觀察銀杏黃酮對巨噬細(xì)胞泡沫化形成的影響，探討銀杏黃酮在動脈粥樣硬化防治中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 細(xì)胞株 THP-1細(xì)胞購自武漢典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 主要試劑 銀杏黃酮（中國藥品食品檢驗檢疫所）；胎牛血清、 PRMI 1640 培養(yǎng)基（美國 Hyclone 公司）；ox-LDL、PMA （Sigma公司）；膽固醇試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）。

1.1.3 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機(jī)（美國 Thermo 公司）；全自動酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 精確稱取銀杏黃酮10mg溶解在1ml的DMSO，使用前用培養(yǎng)基稀釋至終濃度400 mg/L、200 mg/L、100mg/L。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將THP-1細(xì)胞置于含10%胎牛血清和5%青鏈霉素混合液的RPMI1640培養(yǎng)基中，于 37°、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，細(xì)胞濃度控制在 1×108～9×108個/ml，每兩天換液一次，每四天傳代一次，傳至2～3代用于實驗。

1.2.3 泡沫細(xì)胞模型的建立 取對數(shù)生長期的THP-1細(xì)胞，用終濃度為160mmol/L的PMA孵育24h，誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞后加入終濃度為60mg/L的ox-LDL共培養(yǎng)48h，即得泡沫細(xì)胞。

1.2.4 實驗分組 將人THP-1單核細(xì)胞經(jīng)上述方法誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞后，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×108～9×108個/ml，接種于96孔板，隨機(jī)分為六組：空白對照組：用RPMI 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48h；泡沫細(xì)胞模型組：用終濃度為60mg/L的ox-LDL共同培養(yǎng)48h；銀杏黃酮高濃度組：加入60mg/L的ox-LDL預(yù)孵24h，再加入400mg/L的銀杏黃酮刺激24h；銀杏黃酮中濃度組：加入60mg/L的ox-LDL預(yù)孵24h，再加入200mg/L的銀杏黃酮刺激24h；銀杏黃酮低濃度組：加入60mg/L的ox-LDL預(yù)孵24h，再加入100mg/L的銀杏黃酮刺激24h；DMSO對照組：加入60mg/L的ox-LDL預(yù)孵24h，再加入20ml/L的DMSO培養(yǎng)24h。細(xì)胞培養(yǎng)終止后，用油紅O染色鑒定泡沫細(xì)胞模型，用膽固醇氧化酶法檢測細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量。

1.2.5 油紅O染色[5] 細(xì)胞培養(yǎng)終止后，倒去培養(yǎng)液，用PBS輕緩漂洗三次，用冰凍的4%多聚甲醛固定5min，PBS洗一次，加入0.5%油紅O丙二醇溶液，置于60℃烤箱染色30min，用60%丙二醇沖洗5min，再用PBS洗三次，置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 細(xì)胞內(nèi)總膽固醇測定 細(xì)胞培養(yǎng)終止后，將各組細(xì)胞吸去上清液，用PBS洗3遍，避免影響細(xì)胞內(nèi)膽固醇測定。按比例每106個細(xì)胞加0.1ml裂解液，混勻吹打細(xì)胞，靜置10min，使細(xì)胞充分裂解。隨后取500ul細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管里，室溫2000rpm離心5min，收集上清液用于酶學(xué)測定。取 190 μl 工作溶液加入96孔板，在各工作液中，分別加入10 μl標(biāo)準(zhǔn)品、DMSO（空白對照）及各組待測樣品。 37℃反應(yīng) 20 min然后進(jìn)行測定，將96孔板置于酶標(biāo)儀中，調(diào)節(jié)測定波長570nm開始測定各孔OD值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 計量數(shù)據(jù)均以（x±s）表示，組間比較采用單向方差分析。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對泡沫細(xì)胞形成的影響 模型組顯微鏡下觀察，細(xì)胞體積增大，胞漿疏松化，細(xì)胞漿內(nèi)有大量紅色脂滴存在，符合泡沫細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點（見圖1a）。銀杏黃酮高濃度組細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞散在分布，胞漿疏松，胞漿內(nèi)未見明顯脂滴（見圖1b）；銀杏黃酮中濃度組細(xì)胞數(shù)量較高濃度組較多，細(xì)胞體積較模型組小，細(xì)胞內(nèi)脂滴少見，可見培養(yǎng)基內(nèi)散在紅色脂滴（見圖1c）；銀杏黃酮低濃度組細(xì)胞較多，散在分布，細(xì)胞體積較小，可見細(xì)胞周圍散在紅色脂滴（見圖1d）。

2.2 銀杏黃酮對泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響 與空白組相比，模型組總膽固醇含量增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與模型組相比，銀杏黃酮高、中、低劑量組總膽固醇含量明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），且隨著藥物作用濃度的增大效果越明顯。見表1。

3 討論

動脈粥樣硬化變化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是巨噬源性泡沫細(xì)胞的形成。泡沫細(xì)胞的形成主要由單核細(xì)胞在血管內(nèi)皮細(xì)胞受損時通過內(nèi)皮間隙，在內(nèi)膜下分化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞通過A型清道受體吞噬大量ox-LDL，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)大量堆積，形成泡沫細(xì)胞[6]。泡沫細(xì)胞胞質(zhì)中含有脂質(zhì)空泡，其內(nèi)脂滴存在的主要脂質(zhì)是膽固醇酯。研究用人THP-1單核細(xì)胞，與終濃度為160mmol/L的PMA孵育24h。誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞后加入終濃度為60mg/L的ox-LDL共培養(yǎng)48h，采用油紅0染色，顯微鏡下觀察，細(xì)胞體積增大，胞漿疏松化，細(xì)胞漿內(nèi)有大量紅色脂滴存在，符合泡沫細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點，細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量也較空白對照組多，說明已建立THP-1源性泡沫細(xì)胞模型。

銀杏葉的藥用歷史悠久，李時珍的《本草綱目》中對其有詳細(xì)記載?，F(xiàn)代研究證明，銀杏葉富含的黃酮類活性物質(zhì)具有廣泛的生物活性，包括抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥等。臨床觀察證明，銀杏黃酮具有防止動脈硬化的功效，但具體機(jī)制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞泡沫化的過程中加入不同濃度的銀杏黃酮作用后，細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴減少，細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量減少，且有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系，表明銀杏黃酮可以減少巨噬細(xì)胞中膽固醇的蓄積，減緩泡沫細(xì)胞形成?？偰懝檀嫉男罘e是形成動脈粥樣硬化的主要原因，總膽固醇含量過高，會引起粥樣斑塊的沉積，因此減輕細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)負(fù)荷量，可能是銀杏葉抗動脈粥樣硬化的機(jī)制之一。但具體通過何種途徑減緩泡沫細(xì)胞形成、抑制泡沫細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積，仍需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2015.10.26）