清香木內(nèi)生菌對酪氨酸酶活性的影響

李洪文　聶奇華　李光富　張明　鄒云川

【摘 要】 目的：探討清香木內(nèi)生菌對酪氨酸酶活性的影響。方法：對新鮮清香木的莖和根部位進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離，經(jīng)顯微鑒定菌株分別為木霉屬、鐮孢屬和假絲酵母屬，然后將菌株的發(fā)酵液用多孔酶標(biāo)板法進(jìn)行酪氨酸酶抑制活性的檢測。結(jié)果：莖皮部的PZ-6-2對酪氨酸酶活性抑制作用最強(qiáng)，PZ-4次之；根皮部的QZ-1抑制活性也較強(qiáng)。結(jié)論：清香木內(nèi)生菌對酪氨酸酶活性具有一定的抑制作用。

【關(guān)鍵詞】 清香木；內(nèi)生真菌；酪氨酸；酪氨酸酶抑制劑

【中圖分類號】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2016）01-0018-01

Abstract：Objective To discuss the effect of endophytes from Pistacia weinmannifolia J. Poisson ex Franch on tyrosinase activity.Methods The endophytic fungi isolated from stems and roots of fresh Pistacia weinmannifolia J. Poisson ex Franch were belong to trichoderma， fusarium and candida through microscopic identification respectively， and next the inhibitory effect of strain fermented liquid on tyrosinase was determined.Result The PZ-6-2 from stem bark and QZ-1 from root bark had a stronger inhibitory effect on tyrosinase，and the effect of PZ-4 is weak.Conclusion The Endophytic fungi from Pistacia weinmannifolia J.Poisson ex Franch had a certain inhibitory effect on tyrosinase activity.

Keywords：Pistacia weinmannifolia J. Poisson ex Franch； Endophytic fungi； Tyrosine； Tyrosinase inhibitors

植物內(nèi)生菌是指生活史的一定階段生活在活體植物組織內(nèi)且不引起植物明顯病害的微生物[1]。研究表明，某些藥用植物的內(nèi)生菌可以產(chǎn)生與寄主相似的作用。清香木（Pistacia weinmannifolia J. Poisson ex Franch），別名香葉樹、清香樹等，為漆樹科黃連木屬植物，主要分布于云南中部、北部及四川南部等地。臨床以葉及樹皮入藥，具有消炎解毒、收斂止瀉的功效，并在美白和收縮毛孔方面有一定活性。酪氨酸酶又稱多酚氧化酶（EC.1.14.18.1），廣泛存在于微生物、動植物及人體中，是生物體合成黑色素等色素的限速酶[2]，與人的衰老、昆蟲的傷口愈合與發(fā)育、果蔬的褐變有密切關(guān)系。近年來，酪氨酸酶一直受到國內(nèi)外的關(guān)注，其研究涉及生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)、化學(xué)、藥學(xué)等多個學(xué)科和領(lǐng)域。本實驗以清香木內(nèi)生菌作為研究對象，以Kubo和Masuda的酪氨酸抑制模型[3-4]對代謝產(chǎn)物進(jìn)行篩選。

1 儀器與材料

1.1 儀器 KHB ST-360酶標(biāo)儀（上?？迫A）；Lambda 35紫外分光光度計（Perkin Elmer）；氣浴恒溫?fù)u床（Thermo）；DZF-6050真空干燥箱（上海星業(yè)）；顯微鏡（奧林巴斯）。

1.2 材料 樣本采自楚雄醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校校園植物園，經(jīng)鑒定為漆樹科黃連木屬植物Pistacia weinmannifolia J. Poisson ex Franch。

2 方法

2.1 內(nèi)生真菌的分離鑒定

2.1.1 培養(yǎng)基的配制 平板和發(fā)酵用培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉16 g，加入1 L蒸餾水中，攪拌均勻備用。斜面培養(yǎng)基：用高氏1號（可溶性淀粉20 g， KNO3 1.0 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，純化瓊脂粉16 g，加入蒸餾水1 L，調(diào)整pH至7.4）。

2.1.2 內(nèi)生真菌的培養(yǎng)分離 取新鮮清香木的莖和根，用自來水將表面沖洗干凈，稍干后切成適宜長度的小段，在75 %乙醇中浸泡3～5 min，用無菌水沖洗3～4次，無菌濾紙吸干。然后用無菌刀片將組織表皮削去。分別取韌皮部、木質(zhì)部并切成5 mm×5 mm×1 mm的小塊貼放于分離培養(yǎng)基上，置25～28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3～7 d，待培養(yǎng)基上各植物組織周圍長出菌絲后，采用尖端菌絲挑取法對所分離的內(nèi)生真菌進(jìn)行純化，即得內(nèi)生真菌。

2.1.3 內(nèi)生真菌的鑒定 參考文獻(xiàn)[3]采用插片培養(yǎng)和點(diǎn)植法對分離獲得的清香木內(nèi)生真菌進(jìn)行顯微形態(tài)特征的觀察、分類鑒定，結(jié)果見表1。經(jīng)鑒定，來源于清香木莖皮部的內(nèi)生真菌為木霉屬（PZ-6-2）和鐮孢屬真菌（PZ-4），來源于根皮部的為的假絲酵母屬真菌（QZ-1）

2.2 酪氨酸酶活性的研究

2.2.1 檢測樣品的制備 按照“2.1配制”培養(yǎng)基，然后于超凈工作臺中將純化后的菌種依次接種到裝有滅菌液體培養(yǎng)基的試管中，標(biāo)記后置入多孔泡沫板于搖床中28 ℃，160 r/min，5 d，發(fā)酵。

2.2.2 樣品處理及檢測 發(fā)酵后的液體于121 ℃，20 min滅活后，將上清液傾倒入7 ml的離心管中，12000 r/min離心5 min。取適量上清液至干凈的試管中，標(biāo)記后4℃保存。

對酪氨酸酶的抑制篩選參照Kubo和Masuda的方法并進(jìn)行改進(jìn)。反應(yīng)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行，共設(shè)4組，每組設(shè)3個復(fù)孔，分別為：Ⅰ.不含樣品，但含酪氨酸酶的陰性對照，每孔加入180 μl磷酸鹽緩沖液，20 μl 酶溶液。不含樣品及酪氨酸酶的空白對照，每孔加入200 μl緩沖液。包含樣品及酪氨酸酶，依次加入150 μl緩沖液，20 μl 酶溶液，30 μl樣品。Ⅳ.含樣品但不含酪氨酸酶的空白對照，每孔170 μl磷酸緩沖液，30 μl樣品。然后將培養(yǎng)板在30 ℃下孵化5 min，并在每孔中加入100 μl酪氨酸酶溶液。30 ℃反應(yīng)20 min后，于酶標(biāo)儀中測量475 nm處的吸光度值。提取物對酪氨酸酶活性的抑制按公式計算：

抑制率=[（Ⅰ-Ⅱ）-（Ⅲ-Ⅳ）] / （Ⅰ-Ⅱ）×100 %

3 結(jié)果

3.1 對酪氨酸酶活性的抑制作用 通過參考Kubo的酪氨酸酶活性篩選模型，將分離得到的清香木內(nèi)生真菌進(jìn)行活性篩選，通過計算抑制率，進(jìn)而作出篩選的標(biāo)準(zhǔn)。見表2。

4 討論

通過分離清香木中內(nèi)生真菌并進(jìn)行活性篩選，建立了酪氨酸酶活性的篩選模型，篩選出活性較好的三株菌株。接下來將通過對此三株菌株的產(chǎn)物活性跟蹤找到活性成分并進(jìn)行分離鑒定，希望獲得能夠在食品保鮮、美白方面有益的產(chǎn)物。

參考文獻(xiàn)

[1]Takakazu Kaneko，Kiwamu Minamisawa，Tsuyoshi Isawa， et al. Complete genomic structure of the cultivated rice endophyte Azospirillum sp.B510[J].DNA research，2010，17（1）： 37-50.

[2]Kubo I，Kinst-Hori I.Flavonols from saffron flower：tyrosinase inhibitory activity and inhibition mechanism[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，47（10）：4121-4125.

[3]Kubo I，Kinst-Hori I，Chaudhuri S K，et al.Flavonols from Heterotheca inuloides：tyrosinase inhibitory activity and structural criteria[J].Bioorganic and Medicinal Chemistry， 2000， 8（7）： l749-1755.

[4]Masuda T，Yamashita D，Takeda Y，et al.Screening for tyrosinase inhibitors among extracts of seashore plants and identification of potent inhibitors from Garcinia subelliptica[J]. Bioscience ， Biotechnology， and Biochemistry，2005，69（1）：197-201.

[5]魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979.

（收稿日期：2015.10.28）