桑菊飲抗菌及對(duì)小鼠免疫功能影響的初步研究

蘇治?！堛`應(yīng)　萬(wàn)澤房　熊文林　杜昕如　雷昕　俞琦

【摘 要】 目的：觀察桑菊飲的抗菌作用和對(duì)小鼠免疫功能的影響，探討其治療上呼吸道感染等病癥的機(jī)制。方法：采用體外抗菌試驗(yàn)檢測(cè)桑菊飲對(duì)不同細(xì)菌的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）；將小鼠隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組、桑菊飲高/低劑量組，以生理鹽水和不同劑量桑菊飲連續(xù)灌胃7d，檢測(cè)各組小鼠免疫器官指數(shù)、脾淋巴細(xì)胞增殖能力和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力。結(jié)果：桑菊飲對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌均有抑制作用，對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌作用最強(qiáng)，MIC、MBC均為50mg/ml和100mg/ml。與生理鹽水對(duì)照組比較，桑菊飲能顯著提高小鼠胸腺、脾臟指數(shù)，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞增殖能力和巨噬細(xì)胞的吞噬功能（P<0.05）。結(jié)論：桑菊飲具有抗菌和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的活性，該活性是防治上呼吸道感染等癥的作用之一。

【關(guān)鍵詞】 桑菊飲；抗菌；免疫功能

【中圖分類號(hào)】R258.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2016）01-0016-02

桑菊飲出自清代《溫病條辨》，由桑葉、菊花、連翹、苦桔梗等八味中藥組成，為辛涼解表之劑，具有宣肺止咳、疏風(fēng)清熱的功效，臨床用于外感風(fēng)熱、咳嗽初起之證，如上呼吸道感染、急性氣管炎等均可加減運(yùn)用。臨床研究表明，桑菊飲對(duì)上呼吸道感染、咳嗽、支氣管炎等病癥具有顯著療效[1-4]，但對(duì)其作用機(jī)制的研究報(bào)道較少。本研究擬通過(guò)桑菊飲的抗菌試驗(yàn)和對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)、脾淋巴細(xì)胞功能和吞噬細(xì)胞吞噬能力的檢測(cè)，探討該方藥防治上呼吸道感染的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 桑葉、菊花、薄荷、苦桔梗、杏仁、連翹、葦根、生甘草均購(gòu)自同仁堂貴陽(yáng)藥店，經(jīng)鑒定為正品。按常規(guī)方法用水提取、濃縮，調(diào)整濃度為0.8g生藥/ml，濾過(guò)除菌后置4℃冰箱備用。

1.2 試劑 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號(hào)：131010）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：130731）購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；S.S瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：120725，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)GIBCO公司）；刀豆蛋白A（美國(guó)Sigma公司）；MTT（美國(guó)Amkesco公司）。

1.3 儀器 AB135-S型電子天平（梅特勒托利多上海公司）；3131型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；DG3021酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)BIO-TEK公司）；生物顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.4 菌種 金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、大腸埃希菌（ATCC25922）、銅綠假單胞菌（ATCC27853）、肺炎鏈球菌（ATCC49619）、肺炎克雷伯菌（ATCC700603）均購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種小鼠24只，體重（20±2）g，雌雄各半，購(gòu)自重慶騰鑫比爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷售有限公司，動(dòng)物合格證：SCXK（軍）2012-0011。

2 方法

2.1 體外抗菌試驗(yàn)

2.1.1 菌液的制備[5] 采取十倍稀釋法，肺炎鏈球菌以10% 胎牛血清營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)18 h，以相同培養(yǎng)基1∶[KG-*3/5]10稀釋為試驗(yàn)菌液；其他細(xì)菌以營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)后，制成1×103細(xì)菌懸液。

2.1.2 最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定 采用二倍稀釋法，用相應(yīng)液體培養(yǎng)基稀釋藥物，共8個(gè)藥物濃度，分別為800、400、200、100、50、25、12.5、6.25mg/ml，依次加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，1ml/每孔，各孔加入試驗(yàn)菌液50 μl，并設(shè)菌液和培養(yǎng)基對(duì)照孔，37℃培養(yǎng)18 h，肉眼和倒置顯微鏡下觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。以能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物最高稀釋度為最低抑菌濃度（MIC）。

2.1.3 最低殺菌濃度（MBC）測(cè)定[6] 分別取上述無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)物100 μl接種于相應(yīng)固體瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。以菌落數(shù)少于5個(gè)的藥物最高稀釋度為該藥的最小殺菌濃度（MBC）。

2.2 對(duì)小鼠免疫功能的影響

2.2.1 動(dòng)物分組及給藥 小鼠購(gòu)回適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組、桑菊飲高劑量組、桑菊飲低劑量組，每組8只。高、低劑量組分別按10 g/kg 和5 g/kg（體重）灌胃，每天2次，連續(xù)7d。生理鹽水對(duì)照組代以等體積生理鹽水。

2.2.2 免疫器官指數(shù)測(cè)定 末次給藥5 h后，脫頸椎處死小鼠，稱量小鼠體重，取腹腔液后，無(wú)菌分離小鼠的胸腺和脾臟，于電子天平上稱重。免疫器官系數(shù)=免疫器官重量∕體重。

2.2.3 脾淋巴細(xì)胞的制備 將分離的脾臟置于200目的篩網(wǎng)研磨，收集細(xì)胞懸液，4℃，600r離心8 min，棄上清。用Hank's液重懸細(xì)胞，加5 ml紅細(xì)胞裂解液作用5 min，再用Hank's液離心洗滌2次，用RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色，鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/ml。

2.2.4 MTT法測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖能力[7] 取脾細(xì)胞懸液加入到24孔培養(yǎng)板中，每孔1 ml，加入ConA液75 μl（同時(shí)設(shè)不加ConA的對(duì)照孔），置37℃，5% CO2，相對(duì)濕度為100%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68 h，每孔加入MTT 50 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)結(jié)束后，加入酸性異丙醇，充分混勻，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)570nm處測(cè)光密度值（OD）。

2.2.5 中性紅法檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬功能[8] 常規(guī)方法無(wú)菌取腹腔液，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106個(gè)/ml。將細(xì)胞置于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24h后，棄上清，加入含培養(yǎng)液的濃度為0.002 g /ml中性紅溶液200μl/孔，置37℃，5% CO2培養(yǎng)3 h，離心棄上清，PBS 洗2次，除去細(xì)胞外未被吞噬的中性紅，最后加細(xì)胞裂解液（乙酸∶[KG-*3/5]乙醇=1∶[KG-*3/5]1）200μl，待細(xì)胞全部裂解后，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在 520 nm測(cè)OD值。

2.3 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x[TX-*3]±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 體外抗菌作用 由表1可知，桑菊飲對(duì)受試的5個(gè)菌種均有明顯的抑制作用。其中，對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌作用最強(qiáng)，MIC、MBC分別為50mg/ml、100mg/ml。

3.2 對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響 由表2可知，與生理鹽水對(duì)照組比較，桑菊飲高劑量組胸腺、脾臟指數(shù)均明顯升高，低劑量組能顯著提高脾臟指數(shù)（P<0.01）。

3.3 對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞功能的影響 由表3可知，與生理鹽水對(duì)照組比較，桑菊飲高、低劑量組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力均顯著提高（P<0.05）。

4 討論

上呼吸道感染屬于中醫(yī)外感疾病范疇，與“感冒”、“傷風(fēng)”、“傷寒”、“冒暑”、“傷風(fēng)發(fā)熱”等多種中醫(yī)病證有關(guān)[9]，主要由病毒、細(xì)菌等微生物入侵引起上呼吸道炎癥，表現(xiàn)為頭痛、咳嗽、流涕、咽痛等局部癥狀及發(fā)熱、乏力等全身癥狀。西醫(yī)治療以對(duì)癥治療和支持治療為主，尚無(wú)特效藥。大量臨床研究表明，中醫(yī)藥防治上呼吸道感染具有療效好、副反應(yīng)小、不易耐藥等特點(diǎn)，臨床應(yīng)用越來(lái)越廣泛。桑菊飲為辛涼解表劑，具有宣肺止咳、疏風(fēng)清熱的功效。藥理研究表明，方中的桑葉、菊花、連翹等具有明顯抗菌作用；杏仁、苦桔梗、生甘草具有抗炎止咳等功效。但對(duì)其組成方藥后的藥理作用研究很少，為探索該方藥防治上呼吸道感染的作用機(jī)制，我們對(duì)桑菊飲的抗菌作用和對(duì)小鼠免疫功能的影響進(jìn)行了初步研究。

金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌是上呼吸道感染常見的病原體，可經(jīng)外源性或內(nèi)源性感染途徑進(jìn)入呼吸道，并大量繁殖產(chǎn)生毒力。研究結(jié)果顯示，桑菊飲對(duì)以上菌種均有抑制作用，尤其是對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌作用最強(qiáng)，表明桑菊飲能通過(guò)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)而減輕感染癥狀。胸腺是中樞免疫器官，脾臟是最大的外周免疫器官，其重量可在一定程度上反映機(jī)體的免疫功能；脾臟T淋巴細(xì)胞是介導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫的主要細(xì)胞，巨噬細(xì)胞參與了非特異性免疫和特異性免疫，在其中發(fā)揮重要的吞噬效應(yīng)和抗原提呈作用。研究結(jié)果顯示，與生理鹽水對(duì)照組比較，桑菊飲能顯著提高小鼠胸腺、脾臟指數(shù)，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞增殖能力和巨噬細(xì)胞的吞噬功能（P<0.05），高劑量組作用最明顯。提示桑菊飲對(duì)機(jī)體的免疫功能具有調(diào)節(jié)作用，其可通過(guò)增強(qiáng)免疫器官功能、加強(qiáng)特異性和非特異性免疫反應(yīng)，從而達(dá)到抗菌、抗感染的治療效果，其作用具有一定的量效關(guān)系。提示桑菊飲臨床防治上呼吸道感染的機(jī)制可能與其抗菌作用和增強(qiáng)機(jī)體的免疫力有關(guān)。

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（收稿日期：2015.10.20）