翻白草黃酮對2型糖尿病大鼠胰島細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制研究

宿世震　項(xiàng)東宇　孟繁偉　張欽德

264199　煙臺,山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校西醫(yī)教學(xué)部[宿世震(碩士研究生)、孟繁偉]，中藥系(項(xiàng)東宇、張欽德)

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·論著·

翻白草黃酮對2型糖尿病大鼠胰島細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制研究

宿世震項(xiàng)東宇孟繁偉張欽德

264199煙臺,山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校西醫(yī)教學(xué)部[宿世震(碩士研究生)、孟繁偉]，中藥系(項(xiàng)東宇、張欽德)

【摘要】目的研究翻白草黃酮對2型糖尿病大鼠胰島細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制。方法采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)大鼠6周后，腹腔注射鏈脲佐菌素復(fù)制2型糖尿病大鼠模型。成模大鼠隨機(jī)分為模型組、陽性藥物對照組(羅格列酮，4 mg/kg)、翻白草黃酮低劑量組(3 g/kg)、翻白草黃酮高劑量組(6 g/kg)，同批次健康大鼠作為實(shí)驗(yàn)的正常對照組，每組10只。藥物干預(yù)4周后，微量血糖儀檢測空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、放免法測定空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)并計算胰島素敏感性指數(shù)(insulin sensitivity index，ISI)、ELISA法測定腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)水平；部分胰腺組織勻漿后黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平、硫代巴比妥酸法測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量；取部分胰腺制作病理切片，光鏡下觀察胰腺組織形態(tài)變化。結(jié)果翻白草黃酮可降低大鼠的FBG、FINS、TNF-α、IL-6水平及改善胰島素抵抗，明顯提高大鼠胰腺組織中的SOD水平、降低MDA含量。病理切片顯示胰島細(xì)胞損傷明顯減輕，翻白草黃酮高劑量組(6.0 g/kg)作用明顯。結(jié)論翻白草黃酮對2型糖尿病大鼠胰島細(xì)胞具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用可能是通過減輕胰腺組織內(nèi)的氧化應(yīng)激水平及降低全身炎癥反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。

【關(guān)鍵詞】翻白草；黃酮；2型糖尿??；大鼠；保護(hù)作用

糖尿病是以慢性血糖升高為特征的代謝紊亂性疾病，發(fā)病率逐年上升，目前認(rèn)為，氧化應(yīng)激、炎癥因子與糖尿病的關(guān)系密切，二者均可導(dǎo)致胰島β細(xì)胞損傷[1-2]。翻白草PotentilladiscolorBung.屬薔薇科委陵菜屬，又名雞腿根、天青地白等，其味甘、微苦，性平，無毒，全草及根入藥，主要含有萜類、黃酮類、多酚類等成分，具有抗菌、利尿、降糖、調(diào)脂等作用[3]。研究顯示，翻白草具有改善糖尿病大鼠胰島素抵抗的作用[4]，而黃酮類是翻白草的主要活性部位，故通過動物實(shí)驗(yàn)的方法，探討翻白草黃酮對大鼠胰島細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制。

1材料和方法

1.1動物

健康Wister大鼠，SPF級，雄性，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物合格證號：SCXK(魯)20090001，體質(zhì)量195～206 g，飲水及攝食自由。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物

翻白草黃酮：翻白草，經(jīng)山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校鑒定教研室張欽德教授鑒定為中藥翻白草PotentilladiscolorBung.的全草，烘干粉碎，90%乙醇，料液比1∶8，提取3次，合并提取液，減壓濃縮、萃取，減壓回收后真空干燥、粉碎過篩，冷藏備用。提取物中黃酮含量為70.5%，1 g提取物相當(dāng)于生藥83 g，使用前，現(xiàn)配溶液濃度為72 mg/mL(相當(dāng)于生藥6 g/mL)、復(fù)溫至25～30℃后進(jìn)行灌胃治療。羅格列酮片(成都恒瑞制藥有限公司，批號:201400319)。

1.3試劑與儀器

鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)(美國Sigma公司，批號:S0130)。血清胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)，批號:20140326；白細(xì)胞介素-6(interleukins，IL-6)，批號:20140314；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)，批號:20140306；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，批號20140319；考馬斯亮蘭蛋白，批號:20140318；丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒，批號:20140318；以上試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

微量血糖儀及配套試紙(德國羅氏診斷公司)；680酶標(biāo)儀(美國Bio-rad公司)；SN-695 B型智能放免r測量儀(上海原子核研究所日環(huán)儀器一廠)；CX21BIM-SET6光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司)。

1.4模型制備、分組及給藥

60只大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量分層隨機(jī)數(shù)字表法取10只作為正常對照組，普通飼料喂養(yǎng)；余50只高脂高糖飼料(飼料配方：豬油18%、蔗糖20%、蛋黃3%、基礎(chǔ)飼料59%)喂養(yǎng)，4周后，禁食12小時，1% STZ按40 mg/kg腹腔注射，1周后測糖負(fù)荷2小時血糖值，≥11.1 mmol/L為初選指標(biāo)，穩(wěn)定1周后分組[5]，最終成模42只。成模大鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為四組，每組10只，即模型組、陽性藥物對照組(羅格列酮，4 mg/kg)、翻白草黃酮低、高劑量組(以生藥計，6 g/kg，12 g/kg)。正常對照組及模型組每次等體積的蒸餾水。灌胃給藥，每天1次，連續(xù)28天。

1.5指標(biāo)檢測

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后(禁食8小時)，剪尾取血，微量血糖儀檢測空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)。3%戊巴比妥麻醉后，腹主動脈取血，分離血清，-20℃保存待測。放射免疫法測定空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)，酶聯(lián)免疫法測定血清TNF-α、IL-6。計算胰島素敏感性指數(shù)(insulin sensitivity index，ISI)，ISI= 1/FBG×FINS。取血后立即取胰腺組織，部分用冷生理鹽水漂洗，拭干稱重、放入盛有預(yù)冷勻漿介質(zhì)的燒杯中，剪碎組織，倒入勻漿器中研磨成組織勻漿，30000 rmp離心10分鐘，吸取上清液待測，黃嘌呤氧化酶法測定SOD水平、硫代巴比妥酸法測定MDA水平。部分胰腺組織常規(guī)固定、包埋制備石蠟切片后HE染色。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理

表1　翻白草黃酮對糖尿病大鼠FBG、FINS、ISI 的影響±s，n=10)

注： 與正常對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01；與羅格列酮組比較，cP<0.01。

2結(jié)果

2.1翻白草黃酮對糖尿病大鼠一般狀態(tài)的影響

實(shí)驗(yàn)過程中，正常對照組大鼠活潑、毛發(fā)整齊光滑、反應(yīng)靈敏；造模大鼠在高脂高糖飼料喂養(yǎng)結(jié)束時形體肥胖、體質(zhì)量增加明顯，注射STZ后逐漸呈現(xiàn)精神萎靡、懶動、多食、多尿，墊料潮濕臊臭，每日需更換墊料2次，同時模型大鼠體質(zhì)量較造模前降低明顯。給予藥物干預(yù)4周后，與模型組比較，翻白草黃酮低、高劑量組大鼠的狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，進(jìn)食量、飲水量改善，體質(zhì)量有所增加，毛發(fā)較整齊、光滑，且活動增加。

2.2翻白草黃酮對糖尿病大鼠FBG、FINS、ISI的影響

模型組大鼠的FBG、FINS水平升高、ISI降低，與正常對照組比較差異顯著(P<0.01)，符合2型糖尿病的特點(diǎn)，提示模型復(fù)制成功。干預(yù)28天后，翻白草黃酮低、高劑量組的FBG、FINS水平下降，ISI升高，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，呈劑量依懶性，但作用不及羅格列酮，見表1。

2.3翻白草黃酮對糖尿病大鼠胰腺組織中SOD、MDA的影響

模型組大鼠胰腺組織中SOD水平下降、MDA含量升高，與正常對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。干預(yù)28天后，翻白草黃酮低、高劑量組胰腺組織中的SOD水平升高、MDA水平下降，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，作用優(yōu)于羅格列酮組(P<0.01)，翻白草黃酮高劑量組作用明顯，見表2。

2.4翻白草黃酮對糖尿病大鼠血清炎癥因子的影響

模型組大鼠TNF-α、IL-6水平呈現(xiàn)升高，與正常對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；干預(yù)28天后，翻白草低、高劑量組大鼠的TNF-α、IL-6水平均不同程度降低，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。高劑量組作用明顯，見表3。

表2　翻白草黃酮對糖尿病大鼠胰腺組織中SOD、

注： 與正常對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01，cP<0.05；與羅格列酮組比較，dP<0.01。

表3　翻白草黃酮對糖尿病大鼠血清

注： 與正常對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01，cP<0.05；與羅格列酮組比較，dP<0.01。

2.5翻白草黃酮對糖尿病大鼠胰腺形態(tài)的影響

每張切片觀察5個視野(×200)，計算細(xì)胞總數(shù)后取各張平均值進(jìn)行比較。正常對照組大鼠胰島β細(xì)胞數(shù)較多，細(xì)胞核清楚，細(xì)胞界限清晰。模型組大鼠胰島體積縮小，β細(xì)胞數(shù)減少。與模型組比較，羅格列酮組及翻白草黃酮給藥組胰島體積增加，β細(xì)胞數(shù)增多。表明翻白草黃酮對糖尿病大鼠的胰島具有保護(hù)作用，見圖1。

圖1　翻白草黃酮對糖尿病大鼠胰腺形態(tài)的影響

3討論

高脂高糖飼料喂養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素腹腔注射是近年來復(fù)制2型糖尿病大鼠模型較為常用的方法，本實(shí)驗(yàn)中也采用了此方法，模型組大鼠出現(xiàn)了多尿、多飲、體重下降等表現(xiàn)，同時FBG、FINS升高及ISI下降，提示大鼠出現(xiàn)高糖、胰島素抵抗表現(xiàn)，符合2型糖尿病模型特征。翻白草黃酮治療后，F(xiàn)BG及FINS水平下降、ISI提高，與文獻(xiàn)報道一致[4]，翻白草具有改善2型糖尿病大鼠糖代謝紊亂及胰島素抵抗的作用。同時在實(shí)驗(yàn)中觀察到，翻白草黃酮可緩解糖尿病模型大鼠的“三多一少”癥狀及精神狀態(tài)。

“共同土壤”[6]學(xué)說的提出，讓人們注意到了氧化應(yīng)激在糖尿病發(fā)生、發(fā)展中的作用。正常情況下，體內(nèi)在代謝過程中生成的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)或活性氮簇，可被機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)及時清除，若產(chǎn)生過多，超過機(jī)體清除能力，可導(dǎo)致組織、細(xì)胞的損傷，即為氧化應(yīng)激。胰島β細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶水平較低，對氧化應(yīng)激敏感，所以更容易受到ROS的攻擊而受損[7]。目前認(rèn)為，氧化應(yīng)激可激活c-Jun氨基酸末端激酶，繼而激活蛋白轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，直接調(diào)控β細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因的表達(dá)而促進(jìn)β細(xì)胞凋亡；增多的活性氧還可促使生物膜脂質(zhì)過氧化，致使細(xì)胞膜通透性增加，鈣內(nèi)流增加，繼而激活磷脂酶，促進(jìn)膜磷脂分解，導(dǎo)致β細(xì)胞損傷。而抗氧化劑可抑制β細(xì)胞凋亡[8]，進(jìn)一步說明了氧化應(yīng)激參與β細(xì)胞的損傷過程。在評價氧化應(yīng)激時多采用SOD、MDA的含量測定，SOD是機(jī)體主要的抗氧化酶，可以清除自由基而減輕氧化應(yīng)激損傷，其水平可以反映機(jī)體的抗氧化能力；MDA是生物膜脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其水平可以反映體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化程度。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠胰腺組織中的SOD水平降低、MDA水平升高，鏡下觀察胰島萎縮、體積縮小、β細(xì)胞減少，說明糖尿病大鼠胰腺組織中存在氧化應(yīng)激狀態(tài)，其自由基清除能力降低，抗氧化能力降低，β細(xì)胞損傷。翻白草黃酮治療后，與模型組大鼠比較，胰腺組織中的SOD水平升高、MDA水平降低，鏡下觀察胰島體積增加、β細(xì)胞數(shù)增加，表明翻白草黃酮對胰島β細(xì)胞具有修復(fù)作用，其機(jī)制可能與降低糖尿病大鼠胰腺組織內(nèi)的脂質(zhì)過氧化、提高其抗氧化能力有關(guān)。

近年來提出，2型糖尿病是一種自然免疫和低度炎癥性疾病，炎癥因子與糖尿病及其并發(fā)癥的關(guān)系密切，體內(nèi)的糖代謝紊亂可以刺激炎癥因子(如IL-6、TNF-α等)大量的生成，胰島β細(xì)胞同樣出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，繼而功能障礙和凋亡[2,9]。IL-6主要由白細(xì)胞合成分泌，可加速胰島素受體底物的降解，抑制酪氨酸自身磷酸化及磷脂酸肌醇-3-激酶活性，促進(jìn)胰島β細(xì)胞的凋亡；高濃度的IL-6還可以誘導(dǎo)胰腺β細(xì)胞胞漿內(nèi)不透明物質(zhì)產(chǎn)生、自體吞噬的出現(xiàn)和線粒體的變形等細(xì)胞超微機(jī)構(gòu)的變化，這些變化共同引起胰島β細(xì)胞死亡[10]。TNF-α主要由激活的巨噬細(xì)胞釋放，可以刺激β細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶在胰島細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)增加，促進(jìn)NO的合成，從而影響β細(xì)胞的生長和增殖[11]，NO又能激活巨噬細(xì)胞釋放促炎癥因子，可激活核轉(zhuǎn)錄因子-кB，通過Fas途徑引起β細(xì)胞凋亡[12]。因此，炎癥狀態(tài)可導(dǎo)致胰島β細(xì)胞損傷，促進(jìn)糖尿病的發(fā)生、發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)研究中，糖尿病模型組大鼠的TNF-α、IL-6水平顯著高于正常對照組，證實(shí)了2型糖尿病大鼠體內(nèi)存在炎癥因子的過度表達(dá)。翻白草黃酮治療后，糖尿病大鼠的TNF-α、IL-6水平降低，表明翻白草黃酮可降低糖尿病大鼠體內(nèi)的炎癥水平，從而保護(hù)胰島β細(xì)胞。

綜上所述，翻白草黃酮具有保護(hù)β細(xì)胞作用，促進(jìn)β細(xì)胞修復(fù)，其保護(hù)作用可能是通過減輕胰腺組織內(nèi)的氧化應(yīng)激水平及降低全身炎癥反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。今后將繼續(xù)深入研究，明確翻白草黃酮促進(jìn)β細(xì)胞修復(fù)的具體分子學(xué)機(jī)制。

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(本文編輯： 董歷華)

Flavonoids fromPotentilladiscolorBunge playing a protective and mechanical role for the type 2 diabetic rats islet cellXUShi-zhen，XIANGDong-yu，MENGFan-wei，etal.ShandongcollegeoftraditionalChinesemedicine，Yantai264199，China

【Abstract】ObjectiveThis article aims to study the protective mechanism of Flavonoids from Potentilla Discolor Bunge (PDB) to the type 2 Diabetic rats islet cell. MethodsUsing high fat-high sucrose diet to feed rats for 6 weeks, then the researchers copy the type 2 diabetic rats model with Streptozotocin(STZ). Model rats are randomly divided into the model group, the positive drug control group (rosiglitazone hydrochloride, 4 mg/kg), the low dose of flavone group (3 g/kg), and the high dose of flavone group (6 g/kg). At the same time, healthy rats are used as the experimental rats of normal group with 10 rats in each group. They are intervened by drug for 4 weeks. Then, trace blood sugar appearance tests fasting blood-glucose, radio immunity measures fasting insulin (FINS) and calculates insulin sensitivity index (ISI) and ELISA measures the level of tumor necrosis factor (TNF-α) and Interleukin-6(IL-6). Meanwhile, part of the pancreas tissue homogenate after xanthine oxidase method measures the level of SOD, and TBA measures the content of malondialdehyde (MDA). Take part of the pancreas pathological slices, and then observe the shape variation of the pancreas. ResultsFlavone from Potentilla Discolor Bunge(PDB) can reduce FBG, FINS, TNF alpha, and IL-6 levels and can improve insulin resistance. In addition, it is clear that it improves the level of SOD in the pancreatic tissue of rats and decreases MDA content. Pathological section shows an apparent reduction of the damage to islet cell, which is obvious in the high dose of flavonoids (6 g/kg). ConclusionFlavonoids from Potentilla Discolor Bunge (PDB) plays a protective role for type 2 Diabetic rats islet cell. In addition, the mechanism of its protective effect may through reducing the oxidative stress level in the pancreatic tissue and reducing the systemic inflammatory response.

【Key Words】Potentilla discolor；Flavonoids；Type 2 diabetes；Rat；Protective effect

(收稿日期：2015-08-12)

【中圖分類號】R285.5

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.02.005

作者簡介：宿世震(1979- )，2015級在讀碩士研究生，講師。研究方向：動物模型及解剖學(xué)研究。E-mail：ssz169@126.com