延緩衰老湯對衰老模型大鼠的保護(hù)作用

曹寶平　馬　超　李芳伶　葉厚春　曾令杰

(贛州市人民醫(yī)院藥劑科,江西　贛州　341000)

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延緩衰老湯對衰老模型大鼠的保護(hù)作用

曹寶平馬超李芳伶葉厚春1曾令杰2

(贛州市人民醫(yī)院藥劑科,江西贛州341000)

〔摘要〕目的探討延緩衰老湯(YT)對D-半乳糖所致衰老大鼠的保護(hù)作用。方法選擇健康SD大鼠40只，平均分成正常對照組、模型組、陽性對照組和給藥組。其中正常對照組不做任何處理，其余三組大鼠腹腔注射D-半乳糖和生理鹽水建立亞急性衰老模型，同時(shí)，陽性對照組灌胃維生素E，給藥組大鼠灌胃YT混懸液，正常對照組和模型組給予等量生理鹽水，連續(xù)培養(yǎng)2個(gè)月后，測定所有大鼠肝、腦組織中丙二醇(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量、外周血清白細(xì)胞介素(IL)-2含量及腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力指標(biāo)。結(jié)果與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠肝、腦組織中MDA含量明顯升高，SOD含量均顯著下降(P<0.01)；與模型組相比，陽性對照組和給藥組肝、腦組織中MDA的含量明顯降低，SOD的含量明顯提高(P<0.01)。模型組大鼠血清IL-2的含量明顯低于正常對照組(P<0.01)；而陽性對照組和給藥組大鼠血清IL-2含量均顯著高于模型組(P<0.01)。模型組吸光度A值明顯低于正常對照組(P<0.01)；而陽性對照組和給藥組吸光度A值均顯著高于模型組(P<0.01)。結(jié)論YT通過降低肝、腦組織中MDA含量，提高SOD含量，提高血清中IL-2含量和腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力來延緩D-半乳糖所致的大鼠衰老。

〔關(guān)鍵詞〕延緩衰老湯；抗衰老

1贛縣人民醫(yī)院藥劑科2尋烏縣人民醫(yī)院藥劑科。

第一作者：曹寶平(1973-)，男，副主任藥師，主要從事中醫(yī)藥研究。

報(bào)道顯示，衰老與機(jī)體體內(nèi)的自由基數(shù)量不斷增加有緊密關(guān)系〔1〕。D-半乳糖模型是建立衰老和腦老化模型常用的誘發(fā)劑，廣泛應(yīng)用于抗氧化、抗衰老實(shí)驗(yàn)中[2]。延緩衰老湯(YT)是我院多年應(yīng)用于抗衰老的中藥湯劑，由地黃、川芎、丹參等15種具有補(bǔ)腎益精、補(bǔ)氣養(yǎng)陰、壯腎陽、益精血的中藥組方而成，但其抗衰老機(jī)制仍不清楚。本研究旨在探討YT抗衰老能力的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物選擇健康SD大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量180~220 g，無特定病原體(SPF)級(jí)，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w左右，環(huán)境溫度25℃±3℃，相對濕度為45%~70%，自由進(jìn)食飲水。將大鼠40只隨機(jī)分為正常對照組、模型組、給藥組、陽性對照組，每組10只。正常對照組雌性4只，雄性6只，體質(zhì)量(198±0.2)g；模型組雌性5只，雄性5只，體質(zhì)量(200±0.25)g；給藥組雌性7只，雄性3只，體質(zhì)量(197±0.3)g；陽性對照組雌性4只，雄性6只，體質(zhì)量(203±0.1)g。四組雌雄比例、體質(zhì)量相比，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2藥品與試劑YT配制：取地黃30 g，川芎6 g，丹參20 g，當(dāng)歸10 g，澤瀉10 g，紅花6 g，黨參15 g，桃仁10 g，白術(shù)10 g，首烏15 g，田七8 g，茯苓15 g，熟地12 g，甘草3 g，枸杞6 g加入適量滅菌注射用水中，100℃煎煮1 h，過濾，調(diào)配成1 g/ml的YT，取濾液放冷密封，4℃儲(chǔ)存。D-半乳糖(Sigerma進(jìn)口分裝，批號(hào)1212495)：廣州華科化學(xué)技術(shù)有限公司；白細(xì)胞介素(IL)-2、丙二醇(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒均為南京建成生物工程研究所提供，批號(hào)：20120325。

1.3儀器UV-2550紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；BC-J80S型細(xì)胞培養(yǎng)箱，蘇州江東精密儀器有限公司。

1.4方法

1.4.1D-半乳糖衰老模型的建立及給藥正常對照組大鼠給予生理鹽水1 ml/d腹腔注射，其他各組給予100 mg·L-1·d-1D-半乳糖300 mg·kg-1·d-1腹腔注射，連續(xù)2個(gè)月。同時(shí)2個(gè)月中給藥組給予100 mg·kg-1·d-1延緩衰老湯灌胃，陽性對照組給予灌胃25 mg·kg-1·d-1維生素E，其他兩組以等量生理鹽水灌胃。2個(gè)月后，所有大鼠內(nèi)眥靜脈取血，處死大鼠。

1.4.2肝、腦組織中MDA和SOD含量測定使用20%烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠，斷頸處死大鼠，取出肝、腦組織，取材后立即存放在液氮中，然后使用冰冷的生理鹽水清洗組織表面的血液，使用濾紙吸干表面殘余的水分，放入小燒杯中，冰浴，稱重。在小燒杯中加入生理鹽水，剪碎臟器，倒入勻漿機(jī)，手工勻漿10 min，3 000 r/min離心15 min，取肝、腦組織勻漿上清備用，按試劑盒操作檢測SOD、MDA含量。

1.4.3測定外周血IL-2含量藥物干預(yù)后，從大鼠內(nèi)眥靜脈取血置于離心管中，靜置30 min后，3 000 r/min離心15min，取血清，按照試劑盒說明書操作，放射免疫法測定IL-2含量。

1.4.4腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力檢測無菌收集大鼠腹腔液，4℃離心，10 min，Hank液洗滌細(xì)胞3次，1640培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液。取3 ml置培養(yǎng)皿中，37℃，5%CO2培養(yǎng)2 h，巨噬細(xì)胞黏附于容器表面，用4℃ Hank液吹吸，收集黏附細(xì)胞，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為2×109/L，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后，棄上清和非貼壁細(xì)胞。取貼壁巨噬細(xì)胞，加0.1%中性紅生理鹽水，37℃繼續(xù)培養(yǎng)30 min，棄中性紅，用37℃磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)沖洗巨噬細(xì)胞，用50%乙酸和50%乙醇稀釋后，用UV-2550紫外分光光度計(jì)在540 nm波長測A值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1肝、腦組織中MDA和SOD含量與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠肝、腦組織中MDA含量明顯升高(P<0.01)，SOD含量均顯著下降(P<0.01)；與模型組相比，陽性對照組和給藥組肝、腦組織中MDA的含量明顯降低，SOD的含量明顯提高(P<0.01)；但是給藥組與陽性對照組大鼠MDA和SOD含量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1　肝、腦組織中MDA和SOD含量測定結(jié)果

與正常對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01

2.2大鼠血清IL-2含量模型組大鼠血清IL-2的含量為(3.29±0.16)ng/ml，明顯低于正常對照組的(5.23±0.15)ng/ml(P<0.01)；而陽性對照組和給藥組大鼠血清IL-2含量分別為(5.10±0.08)ng/ml、(5.04±0.14)ng/ml，均顯著高于模型組(P<0.01)，但正常對照組、陽性對照組和給藥組大鼠血清中IL-2的含量之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力模型組吸光度A值為(0.15±0.04)，明顯低于正常對照組的(0.30±0.01)(P<0.01)；且陽性對照組和給藥組吸光度A值分別為(0.29±0.03)、(0.27±0.05)，均顯著高于模型組(P<0.01)。但正常對照組、陽性對照組和給藥組吸光度A值之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3討論

關(guān)于衰老的機(jī)制有很多學(xué)說，具有代表性的是自由基學(xué)說。長期以來機(jī)體內(nèi)部自由基的產(chǎn)生和自由基的清除處于平衡狀態(tài)，隨著年齡的增長，機(jī)體內(nèi)部發(fā)生一系列變化，平衡狀態(tài)被打破，引起自由基數(shù)量增加〔3〕。過多的自由基會(huì)攻擊核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，誘導(dǎo)細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)，引起核酸及蛋白質(zhì)相互交聯(lián)，基因突變及生物酶活力下降，導(dǎo)致細(xì)胞受損，甚至衰老至死亡〔4〕。另外，在發(fā)生衰老的過程中，與人體免疫功能下降之間具有緊密聯(lián)系?，F(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證明具有補(bǔ)腎益精的中藥方劑可以提高老年大鼠血清中甲狀腺素水平，從而增強(qiáng)胸腺的功能，延緩衰老，促進(jìn)胸腺上皮細(xì)胞合成和分泌IL-2，最終達(dá)到增強(qiáng)衰老大鼠的免疫功能[5]。YT可以通過多系統(tǒng)、多環(huán)節(jié)維持機(jī)體的免疫功能，從而延緩衰老。建立衰老模型是評(píng)價(jià)抗衰老模型的關(guān)鍵，實(shí)驗(yàn)中衰老動(dòng)物模型主要有D-半乳糖衰老模型、臭氧衰老模型、去胸腺衰老模型及自然衰老模型等，其中D-半乳糖衰老模型應(yīng)用最廣泛，具有操作簡單、低成本、效果佳等特點(diǎn)〔6〕。本研究主要考慮到D-半乳糖在還原酶的作用下可以生成半乳糖醇，而半乳糖醇不被細(xì)胞代謝而在細(xì)胞內(nèi)沉積，從而增加細(xì)胞的滲透壓，影響細(xì)胞的代謝，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生衰老〔7〕。

SOD是機(jī)體重要的抗氧化酶之一，可以清除H2O2、·OH和 O-2·等自由基，在體內(nèi)的含量可以反映出機(jī)體清除自由基的能力高低，可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，隨著年齡的增長，其數(shù)量及活性逐漸下降，是衡量衰老程度的重要指標(biāo)〔8〕。MDA是脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，當(dāng)機(jī)體衰老后，機(jī)體內(nèi)MDA的含量會(huì)慢慢升高，從而反映氧自由基水平和過氧化反應(yīng)的程度〔9〕，也可以用于反映機(jī)體的衰老狀態(tài)。本研究提示YT和維生素E可以有效對抗D-半乳糖所致大鼠肝、腦的氧化損傷，均有清除自由基和抗氧化的作用，并且達(dá)到延緩衰老的目的。而且YT與維生素E的功效相似。近年來研究表明，YT中組方成分地黃、丹參、首烏、枸杞等具有抗自由基代謝、提高免疫力、防治心腦血管疾病、抗老年癡呆等功效〔10〕。衰老機(jī)體的免疫功能及非特異性免疫中巨噬細(xì)胞功能下降〔11〕，而IL-2主要由活化的CD4+和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生，是調(diào)控免疫應(yīng)答的主要因子，本研究表明YT和維生素E可以改善衰老大鼠的免疫功能，從而延緩衰老的進(jìn)程。

綜上所述，YT可以通過降低MDA的含量，升高SOD的含量，清除自由基，達(dá)到抗氧化的目的，同時(shí)也具有增強(qiáng)免疫功能的作用，兩個(gè)作用結(jié)合起來延緩衰老的進(jìn)程，具有一定的開發(fā)價(jià)值。

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〔2015-04-15修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：馬超(1984-)，男，碩士，主管藥師，主要從事臨床藥學(xué)方面的研究。

基金項(xiàng)目：贛州市2012年市科技局指導(dǎo)性科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2012006)

〔中圖分類號(hào)〕R28

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)03-0547-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.013