原癌基因c-jun在毒胡蘿卜素內(nèi)酯誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞凋亡中的作用

張　潔　周方舟　曹新冉　任宏生　楚玉峰　王愛紅　董　波　趙　鵬

(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院營養(yǎng)科，山東　濟(jì)南　250021)

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原癌基因c-jun在毒胡蘿卜素內(nèi)酯誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞凋亡中的作用

張潔周方舟1曹新冉1任宏生2楚玉峰2王愛紅1董波1趙鵬1

(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院營養(yǎng)科，山東濟(jì)南250021)

〔摘要〕目的探討原癌基因c-jun在毒胡蘿卜素內(nèi)酯(TG)誘導(dǎo)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制。方法應(yīng)用TG處理野生型(c-jun+/+)，基因敲除型(c-jun-/-)和基因重組型(c-jun Re)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞后觀察細(xì)胞生存率；流式細(xì)胞術(shù)(FACS)和DNA染色進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析；蛋白免疫印跡技術(shù)分析蛋白c-jun、caspase-12及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)分子伴侶Grp78、 Gadd153和α-tubulin的表達(dá)；共聚焦顯微鏡觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色及形態(tài)。結(jié)果不同濃度TG處理3組細(xì)胞4 h后觀察細(xì)胞生存率，TG在50 nmol/L及100 nmol/L時(shí)3組細(xì)胞生存率出現(xiàn)差異，c-jun+/+與c-jun-/-組較 c-jun Re組生存率減低(P<0.05);TG未處理與處理均未影響c-jun蛋白的表達(dá)，c-jun-/-無c-jun蛋白表達(dá)，c-jun Re高表達(dá)c-jun蛋白；FACS與DNA染色結(jié)果顯示，TG處理后c-jun-/-組較c-jun Re組DNA含量增高(P<0.05)，并在c-jun-/-組出現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞亞二倍體DNA；熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞DAPI染色，與c-jun Re組比較c-jun-/-組DNA染色弱且模糊紊亂；在c-jun+/+與 c-jun-/-組中12 h比24 h caspase-12蛋白表達(dá)低(P<0.05)，與c-jun+/+組比較，c-jun-/-組caspase-12蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.05)，而在c-jun Re組幾乎無caspase-12蛋白表達(dá)；經(jīng)TG處理后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)分子伴侶Grp78和Gadd153，c-jun Re組此兩種標(biāo)識(shí)物的表達(dá)明顯低于其在c-jun-/-組中的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)構(gòu)造在兩種細(xì)胞中的不同樣式，c-jun Re組相比c-jun-/-組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)更加完整豐富寬廣。結(jié)論TG可以引起小鼠成纖維細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。c-jun基因表達(dá)的不同改變了細(xì)胞凋亡的程度，這種改變是通過細(xì)胞對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的介導(dǎo)。c-jun基因的表達(dá)在TG誘導(dǎo)的小鼠成纖維細(xì)胞凋亡中起保護(hù)作用。

〔關(guān)鍵詞〕c-jun基因；毒胡蘿卜素內(nèi)酯；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；細(xì)胞凋亡

1心內(nèi)科2ICU

第一作者：張潔(1985-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事心臟病的臨床與基礎(chǔ)研究。

c-jun是一種核內(nèi)原癌基因，c-jun氨基末端激酶(JNK)的活化是通過c-jun氨基末端殘基磷酸化實(shí)現(xiàn)的，一旦被激活，胞質(zhì)中的JNK移位到細(xì)胞核中〔1〕。激活的JNK可進(jìn)一步使核內(nèi)c-jun等轉(zhuǎn)錄因子活性增強(qiáng)，主要以c-jun為底物并提高激活蛋白(AP)-1的轉(zhuǎn)錄活性。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是調(diào)節(jié)細(xì)胞生存和死亡的重要過程，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的分子伴侶提供有利于蛋白質(zhì)折疊的特殊環(huán)境。起主導(dǎo)作用的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶結(jié)合蛋白/葡萄糖相關(guān)蛋白質(zhì)78 kD蛋白(BiP/Grp78)在儲(chǔ)存內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+中起著重要作用，各種刺激因子如毒胡蘿卜素內(nèi)酯(TG)、肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+/ATP酶抑制劑促進(jìn)有效的未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答(UPR)〔2〕發(fā)生時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激活某些UPR靶基因，如促凋亡基因生長停滯DNA損傷基因(Gadd153)的表達(dá)〔3〕。本研究應(yīng)用c-jun基因敲除的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(c-jun-/-)、c-jun重組表達(dá)細(xì)胞(c-jun Re)和野生型小鼠成纖維細(xì)胞(c-jun+/+)，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的改變，明確原癌基因c-jun在TG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制。

1材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)處理和存活率檢測(cè)c-jun-/-細(xì)胞和c-jun Re細(xì)胞由美國Michael Karin博士的實(shí)驗(yàn)室提供，c-jun+/+細(xì)胞由中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)提供。培養(yǎng)基為加入了10%小牛血清(Life Technologies.Inc)的DulBecco改良Eagle培養(yǎng)基。利用臺(tái)酚藍(lán)染料排除法評(píng)估細(xì)胞存活率。

1.2流式細(xì)胞術(shù)(FACS)和DNA染色進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析小鼠成纖維細(xì)胞從TG處理24 h后的60 mm組織培養(yǎng)皿中取出。上清液收集在15 ml錐形管中，用0.05%的胰蛋白酶對(duì)貼壁細(xì)胞處理10 min使其分散開，然后用血清培養(yǎng)基終止消化。將兩種成分混合，2 500 r/min離心5 min。再懸浮細(xì)胞，在4 ml 1%多聚甲醛磷酸緩沖鹽水(PBS)中固定30 min，4℃再次離心，并再懸浮于1 ml PBS中。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，確保在隨后的每一步中細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml。以0.1% 的Triton X-100 PBS在4℃條件下將細(xì)胞通透3 min。再次離心后，將細(xì)胞重新懸浮在DNA 染色溶液(50 mg/ml，碘化丙啶，PI)中30 min。應(yīng)用FACScan系統(tǒng)完成細(xì)胞周期分析。

利用DAPI對(duì)DNA染色。用PBS沖洗細(xì)胞并用胰蛋白酶-EDTA消化。將約5萬個(gè)細(xì)胞重懸浮在50 μl PBS中，然后將100 μl的22%牛血清白蛋白(BSA)溶液加入到樣品中。將這種懸浮液放入CYTO離心機(jī)中以500 r/min離心5 min。室溫下載玻片風(fēng)干30 min后用PBS洗滌。在室溫條件下用DAPI(200 μl 2.5 μg/ml PBS)處理30 min，然后用PBS洗滌，將樣品存儲(chǔ)在4℃避光環(huán)境中，利用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.3內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色及共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞在100 nmol/L Dioc6染料內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光探針(Invitrogen，Carlsbad，CA)中孵育30 min，然后將載有細(xì)胞的共聚焦顯微鏡專用蓋玻片轉(zhuǎn)移到BioRad MRC-1024共聚焦顯微鏡(Hercules，CA)，使用63×1.4數(shù)值孔徑(N.A.)的物鏡觀察。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光探針在波長790 nm處由雙光子激發(fā)，然后用特定的外部探測(cè)器在500~540 nm波長處進(jìn)行熒光觀察。

1.4蛋白免疫印跡分析用蛋白免疫印跡技術(shù)分析蛋白c-jun、caspase-12及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)分子伴侶Grp78、 Gadd153和α-tubulin的表達(dá)。多克隆抗c-jun抗體及單克隆抗caspase-12抗體購自Cell Signaling公司(Beverly，MA)，多克隆抗Grp78抗體及多克隆抗Gadd153 抗體和多克隆抗α-tubulin抗體購自Santa Cruz Biotechnology 公司(CA)。將小鼠成纖維細(xì)胞在冷PBS中洗滌2次后再在1 ml裂解緩沖液〔1%Triton X-100，20 mmol/L HEPES(pH7.4)，50 mmol/L β-甘油磷酸鹽，2 mmol/L EGTA，1 mmol/L DTT，10 mmol/L氟化鈉，1 mmol/L原釩酸鈉，10%甘油和蛋白酶抑制劑混合物〕中溶解。 將細(xì)胞裂解物在14 000 r/min離心10 min后澄清。用布拉德福德蛋白測(cè)定法定量蛋白濃度。通過電泳將蛋白標(biāo)本在直或梯度的NuPAGE Bis-Tris凝膠(10或4%~12%)(Invitrogen，Carlsbad，CA)進(jìn)行解析，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore，Bedford，MA)上。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)免疫反應(yīng)帶(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。用含50 mmol/L Tris-HCl(pH6.8)，2%十二烷基硫酸鈉(SDS)和0.1 mol/L β-巰基乙醇對(duì)印跡進(jìn)行清除，然后重新標(biāo)記，免疫反應(yīng)帶的濃度用掃描密度儀和酶標(biāo)儀聯(lián)合測(cè)量。

2結(jié)果

2.1不同濃度TG處理后細(xì)胞生存率及TG處理細(xì)胞后c-jun蛋白的表達(dá)應(yīng)用不同濃度TG(0、10、50、100 nmol/L)處理c-jun+/+組、c-jun-/-組和c-jun Re組細(xì)胞4 h，發(fā)現(xiàn)TG在50及100 nmol/L濃度時(shí)3組細(xì)胞生存率出現(xiàn)差異，c-jun+/+與c-jun-/-組較 c-jun Re組生存率減低(圖1A)。c-jun+/+、c-jun-/-和c-jun Re 3組細(xì)胞用TG(100 nmol/L)未處理與處理4 h后c-jun-/-細(xì)胞無c-jun蛋白表達(dá)，c-jun Re細(xì)胞高表達(dá)c-jun蛋白(圖1B)。

圖1　不同濃度TG處理后細(xì)胞生存率(A)及TG處理與未處理3組小鼠成纖維細(xì)胞c-jun表達(dá)(B)

2.2TG處理細(xì)胞后檢測(cè)細(xì)胞凋亡將c-jun-/-和c-jun Re兩組細(xì)胞用TG(100 nmol/L)處理與未處理4 h，c-jun-/-組較c-jun Re組DNA含量增高(28.9%±3.6% vs.2.6%±0.3%，P<0.05)，并在c-jun-/-組出現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞亞二倍體DNA(圖2A)。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞DAPI染色，與c-jun Re組比較c-jun-/-組DNA染色弱且模糊紊亂(圖2B)。

圖2　TG處理c-jun-/-和c-jun Re細(xì)胞4 h后凋亡結(jié)果

2.3TG誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡蛋白caspase-12的表達(dá)經(jīng)TG(100 nmol/L)處理4 h后，c-jun+/+與 c-jun-/-組12 h比24 h caspase-12蛋白表達(dá)低(1.4±0.1 vs.2.2±0.3；2.8±0.3 vs.10.1±2.7；P<0.05)，與c-jun+/+比較，c-jun-/-組caspase-12蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.05)，而在c-jun Re組幾乎無caspase-12蛋白表達(dá)。見圖3。

圖3　TG(100 nmol/L)誘導(dǎo)3組小鼠成纖維細(xì)胞caspase-12的表達(dá)

2.4TG處理細(xì)胞后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白的表達(dá)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)改變經(jīng)TG(100 nmol/L)處理后，c-jun Re細(xì)胞的Grp78和Gadd153表達(dá)明顯低于c-jun-/-細(xì)胞(圖4A)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光探針檢查發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)構(gòu)造在兩種細(xì)胞中不同，c-jun Re細(xì)胞相比c-jun-/-細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)更加完整豐富寬廣(圖4B)。

(A)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記蛋白Grp78和Gadd153及c-jun的表達(dá)；(B)激光共聚焦顯微鏡觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)圖4　TG處理c-jun-/-和c-jun Re細(xì)胞4 h后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記蛋白、c-jun及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)觀察

3討論

UPR增加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)固有的分子伴侶的表達(dá)，以適應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中因蛋白折疊的需求。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在細(xì)胞功能和存活方面起著重要的作用。細(xì)胞應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的基礎(chǔ)反應(yīng)便是包括JNK信號(hào)通路在內(nèi)的多種應(yīng)激活化的激酶途徑。c-jun作為一種JNK的下游靶分子，在許多刺激下如生長因子、紫外照射和細(xì)胞因子的刺激下c-jun的表達(dá)都會(huì)增強(qiáng)〔4〕。c-jun在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中具有保護(hù)作用，c-jun-/-小鼠胚胎成纖維細(xì)胞在TG刺激后有部分發(fā)生了細(xì)胞凋亡，然而轉(zhuǎn)染重組c-jun基因的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞卻對(duì)TG有一定的抵抗作用。本文結(jié)果說明了c-jun的重組再表達(dá)明顯地增加了細(xì)胞對(duì)于TG所致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的耐受性，而且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的caspase-12參與了細(xì)胞凋亡的局部調(diào)節(jié)。在c-jun-/-細(xì)胞中TG刺激引起了caspase-12的活化，正如caspase-12前體裂解一樣，并具有一定的時(shí)間依賴性。與此相反，在野生型和轉(zhuǎn)染重組c-jun基因的小鼠細(xì)胞，對(duì)于TG引起的caspase-12激活具有一定抵抗性。我們應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光探針測(cè)試兩種細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)構(gòu)造，發(fā)現(xiàn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)構(gòu)造在兩種細(xì)胞中的不同樣式，表明c-jun的結(jié)構(gòu)性再表達(dá)能增加細(xì)胞對(duì)于TG誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的耐受性。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是多數(shù)細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞表面和細(xì)胞外蛋白質(zhì)合成、加工和轉(zhuǎn)運(yùn)的主要場所。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)非常敏感，Ca2+耗竭、葡萄糖或營養(yǎng)缺乏、蛋白質(zhì)糖基化抑制、二硫鍵形成障礙、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)異常等刺激均可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能失調(diào)，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后，腔內(nèi)大量蛋白質(zhì)堆積引發(fā)了真核生物進(jìn)化中高度保守的UPR。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)蓄積在網(wǎng)腔內(nèi)的錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白的處理，而有利于維持細(xì)胞的正常功能并使之存活，但是時(shí)間過長的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可引起細(xì)胞的凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)的UPR信號(hào)通路通過三個(gè)分子介導(dǎo)：肌醇內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜激酶IRElα、蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)和活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)。生理?xiàng)l件下，它們與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的Grp78牢牢結(jié)合；當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，大量未折疊蛋白質(zhì)被釋放活化并發(fā)揮作用。UPR引起IRE1α、PERK和ATF6 活化，分別產(chǎn)生了b-ZIP 轉(zhuǎn)錄因子XBP-1、ATF4 和p50ATF6，調(diào)控促凋亡基因CHOP的轉(zhuǎn)錄〔5〕，介導(dǎo)調(diào)整轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。未折疊蛋白在細(xì)胞內(nèi)的聚集對(duì)細(xì)胞是一種損害，如果上述的PERK，ATF6和IRE1α三種調(diào)節(jié)途徑不能抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡途徑將被激活。Gadd153，即C/EBP同源蛋白(CHOP)，是一種轉(zhuǎn)錄因，通過ERS的ATF6和PERK途徑誘導(dǎo)表達(dá)的。Gadd153可以激活Gadd34，DR5等基因的表達(dá)。DR5是一種細(xì)胞表面的死亡受體,可以激活caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。caspases-12參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，caspase-12位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)可被激活〔6〕。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)IRE1α能活化c-jun-N-末端抑制性激酶,進(jìn)而激活JNK。JNK可使TNAF-2磷酸化，磷酸化TNAF-2與IRE1α形成復(fù)合物使TNAF-2與caspase-12前體解離，導(dǎo)致caspase-12活化，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡〔7〕。齊曉丹等〔8〕的研究發(fā)現(xiàn)抗氧化劑肌肽拮抗高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡與抑制p-JNK/p-c-jun 表達(dá)有關(guān)系。

綜上所述，本研究表明TG可以引起小鼠成纖維細(xì)胞凋亡，c-jun基因表達(dá)的不同改變了細(xì)胞凋亡的程度，這種改變是通過細(xì)胞對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的介導(dǎo)，c-jun基因的表達(dá)在TG誘導(dǎo)的小鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中起保護(hù)作用。

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〔2016-05-11修回〕

(編輯李相軍)

The role of c-jun in thapsigargin-induced mouse fibroblast cell apoptosis

ZHANG Jie,ZHOU Fang-Zhou,CAO Xin-Ran,etal.

Department of Cardiology,Provincial Hospital Affiliated to Shandong University,Jinan 250021,Shandong,China

【Abstract】ObjectiveTo examine the impact of c-jun on thapsigargin-induced fibroblast cell apoptosis and address the mechanisms.MethodsThe thapsigargin was used to treat c-jun-/- mouse fibroblast cells,wild-type mouse fibroblasts and reconstitution of c-jun expression in c-jun-/- cells(c-jun Re).Cell viability was evaluated by trypan blue dye exclusion.Apoptosis was detected by fluorescence activated cell sorting(FACS)and DNA staining.c-jun,caspase-12,Grp78,Gadd153 and α-tubulin were analyzed by immunoblotting.Confocal images of cells loaded with the ER-Tracker and visualized by two-photon microscopy.ResultsWild type(c-jun+/+),c-jun-/- and c-jun Re cells exhibited dramatic differences in sensitivity to TG.The c-jun-/- cells were the most sensitive,while c-jun Re cells were relatively resistant,to TG-induced cell death(P<0.05).TG treatment led to the activation of caspase-12,as indicated by the cleavage of procaspase-12,in c-jun-/- cells in a time-dependent manner.In contrast,caspase-12 activation was significantly attenuated in wild type fibroblast cells and abrogated in c-jun Re cells in response to TG treatment(P<0.05).c-jun-/- cells exhibited a large degree of apoptosis after treatment with TG,while c-jun Re cells demonstrated relative resistance to TG-induced apoptosis.c-jun-/- mouse fibroblast cells were more sensitive to TG-induced cell death compared to wild-type mouse fibroblasts,while reconstitution of c-jun expression in c-jun-/- cells(c-Jun Re)enhanced resistance to TG-induced cell death(P<0.05).The expression levels of ER chaperones Grp78 and Gadd153 induced by TG were lower in c-jun Re than those in c-jun-/- cells.ER-tracker found different patterns in the ER structure between c-jun-/- and c-jun Re cells.ConclusionsThapsigargin could cause mouse fibroblast cells apoptosis.c-jun gene expression changes of apoptosis degree,this change is mediated by endoplasmic reticulum stress.c-jun gene expression plays a protective role in thapsigargin-induced fibroblast cell apoptosis.

【Key words】c-jun;Thapsigargin;Endoplasmic reticulum stress;Apoptosis

通訊作者：趙鵬(1979-)，男，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事心臟病的臨床與基礎(chǔ)研究。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81200176，81200238)；山東省科技發(fā)展計(jì)劃重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2015GSF118180)；山東省自然科學(xué)基金(ZR2013HM062)

〔中圖分類號(hào)〕R73

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)04-0772-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.04.002