夾竹桃內(nèi)生真菌J14次生代謝產(chǎn)物的分離和抑菌活性

苗 智， 馬養(yǎng)民， 孔 陽， 許 倩， 屈子睿

(陜西科技大學(xué) 教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 西安 710021)

夾竹桃內(nèi)生真菌J14次生代謝產(chǎn)物的分離和抑菌活性

苗 智， 馬養(yǎng)民*， 孔 陽， 許 倩， 屈子睿

(陜西科技大學(xué) 教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 西安 710021)

為進(jìn)一步開發(fā)、利用和保護(hù)夾竹桃植物資源，對(duì)從秦嶺山區(qū)夾竹桃莖中分離得到活性較高的內(nèi)生真菌J14進(jìn)行鑒定，并對(duì)其次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)成分進(jìn)行研究。采用形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析對(duì)菌株J14進(jìn)行鑒定，利用硅膠柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜、重結(jié)晶等方法對(duì)該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離、純化，根據(jù)化合物的理化性質(zhì)和1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)鑒定其結(jié)構(gòu)，利用金黃色葡萄球菌、乳酸鏈球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌以及小麥赤霉病菌、番茄灰霉病菌、煙草枯萎病菌、白菜黑斑病菌對(duì)所得化合物進(jìn)行抑菌活性測(cè)試。結(jié)果表明：經(jīng)形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析，鑒定菌株J14為鏈格孢霉(Alternariasp. SPS-04)。從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到8個(gè)化合物，分別鑒定為交鏈孢甲醚(1)、交鏈孢酚(2)、malformin A1(3)、胸腺嘧啶(4)、尿嘧啶(5)、黃嘌呤(6)、赤蘚醇(7)和甘露醇(8)?；衔?、4、5、6、7首次從鏈格孢屬真菌發(fā)酵產(chǎn)物中得到。化合物1對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為1.95 μg/mL，對(duì)番茄灰霉病菌的最小抑菌濃度為3.91 μg/mL。

內(nèi)生真菌； 夾竹桃； 鏈格孢屬； 次生代謝產(chǎn)物； 抑菌活性

內(nèi)生真菌是指生活史的全部階段或者某一階段生活在植物組織內(nèi)，對(duì)植物組織沒有造成明顯病害的真菌[1]。研究表明，植物內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物，具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)[2]、抗菌[3-4]、抗氧化[5]、抗腫瘤[6-8]等作用。利用植物內(nèi)生真菌代替宿主植物生產(chǎn)活性成分，可以增加藥物來源、緩解植物資源短缺的壓力等。因此，研究植物內(nèi)生真菌中的活性成分具有十分重要的意義。

夾竹桃(Neriumindicum)屬于夾竹桃科夾竹桃屬植物[9]。原產(chǎn)印度、伊朗等東南亞地區(qū)，在我國(guó)栽培歷史悠久，遍及南北城鄉(xiāng)各地。主要功能為祛痰定喘、強(qiáng)心利尿、祛瘀、鎮(zhèn)痛?，F(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)運(yùn)用該藥治療跌打損傷、心力衰竭、癲癇、喘息咳嗽、斑禿、經(jīng)閉[10]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)夾竹桃的研究報(bào)道多集中于其植物化學(xué)成分上的研究，對(duì)其內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的研究報(bào)道甚少。為了節(jié)約和保護(hù)夾竹桃植物資源，增加和發(fā)現(xiàn)藥物來源，筆者對(duì)夾竹桃內(nèi)生真菌展開研究，以?shī)A竹桃莖中分離得到的真菌鏈格孢霉(編號(hào)為J14)為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到8個(gè)化合物，并對(duì)所得化合物進(jìn)行抑菌活性測(cè)試，以期為進(jìn)一步開發(fā)和利用夾竹桃內(nèi)生真菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 夾竹桃內(nèi)生真菌 從秦嶺地區(qū)的夾竹桃莖中分離得到菌株J14，在4 ℃下用PDA斜面培養(yǎng)基保存于實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 測(cè)試菌 革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，乳酸鏈球菌(Streptococcuslactis)；革蘭氏陰性菌：大腸桿菌(Enterococcuscoli)，綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)。植物病原菌真菌：小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)，番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)，煙草枯萎病菌(Tobaccowiltpathogens)，白菜黑斑病菌(Cabbageshadinggerms)。以上測(cè)試菌均保存于實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基：20%馬鈴薯浸汁 1000 mL，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，自然pH；察氏液體培養(yǎng)基：蔗糖 30 g，NaNO33 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，H2O 1000 mL，自然pH；牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，H2O 1000 mL，pH 7.2。以上所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.4 儀器 YX280B 手提式壓力蒸汽滅菌鍋(上海三申醫(yī)療器械有限公司)，SW-CJ-1FD 超凈工作臺(tái)(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，HZQ-Q 全溫?cái)?shù)顯振蕩器(金壇市瑞華儀器廠)，DH5000B 電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司)，柱色譜硅膠200 ～ 300 目(青島海洋化工廠分廠)，薄層色譜硅膠G(青島海浪硅膠干燥劑廠)，柱色譜凝膠Sephadex LH-20(上海浩然生物技術(shù)有限公司)，RE52CS-1 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，BS224S 電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器系統(tǒng)有限公司)，XT-5 顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀(未校準(zhǔn)，北京市科儀電光儀器廠)，Bruker avance Ⅲ-400 Hz 超導(dǎo)核磁共振儀(瑞士布魯克公司)，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 菌種鑒定

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將菌株J14接種于PDA培養(yǎng)基上，在28℃下培養(yǎng)5 d，觀察記錄菌落生長(zhǎng)狀態(tài)，并用顯微鏡觀察孢子及分生孢子梗的形態(tài)等特征，以此作為依據(jù)進(jìn)行鑒定[11]。

1.2.2 分子生物學(xué)鑒定 將菌株J14接種于PDA斜面培養(yǎng)基，在28℃下培養(yǎng)3 d至孢子成熟，利用CTAB法提取菌絲體基因組DNA。以提取到的基因組DNA為模板，通過引物ITS1和ITS4擴(kuò)增目標(biāo)菌株的18S rDNA的ITS區(qū)[12]。將測(cè)序獲得的ITS序列通過BLAST比對(duì)，根據(jù)同源性相似度差異，利用Clustal X軟件進(jìn)行多序列匹配排列，采用軟件MEGA 5.0(鄰接法NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，對(duì)菌株J14與數(shù)據(jù)庫(kù)中登陸的近源菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹關(guān)系進(jìn)行分析。

1.3 固態(tài)發(fā)酵和代謝產(chǎn)物的分離

1.3.1 固態(tài)發(fā)酵 菌株J14經(jīng)過活化后，從PDA培養(yǎng)基上用打孔器制成直徑為6 mm的菌餅，按照1個(gè)菌餅接種于100 mL察氏液體培養(yǎng)基的比例，在28℃，120 r/min 振蕩培養(yǎng)5 d制備成種子培養(yǎng)液。在發(fā)酵瓶(480 mL)中加入大米50 g，無糖察氏培養(yǎng)基60 mL，在121℃下滅菌25 min，然后按照10%的接種量將種子液接種于上述培養(yǎng)基中，在28℃下靜置培養(yǎng)25 d[13]。

1.3.2 代謝產(chǎn)物的分離 將粉碎、陰干的發(fā)酵產(chǎn)物用乙酸乙酯提取，提取液經(jīng)減壓蒸餾得到浸膏460 g。采用硅膠柱色譜對(duì)浸膏進(jìn)行分離，以石油醚、乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇、甲醇為溶劑進(jìn)行梯度洗脫，得到4個(gè)部分(Fr.1 ～ 4)。對(duì)Fr.2(96.93 g)以石油醚、石油醚-乙酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇、甲醇為溶劑進(jìn)行洗脫，經(jīng)過硅膠柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜分離，再經(jīng)過重結(jié)晶純化，分別得到化合物1(75 mg)、化合物2(108 mg)、化合物3(30 mg)、化合物4(145 mg)、化合物5(90 mg)、化合物6(30 mg)、化合物7(88 mg)。對(duì)Fr.3(133.83 g)的洗脫液進(jìn)一步分離得到化合物8(1.81 g)。所有化合物經(jīng)過1H-NMR和13C-NMR分析確定其結(jié)構(gòu)。

1.4 抑菌活性測(cè)試

根據(jù)最小抑菌濃度法，將待測(cè)化合物溶解于DMSO溶劑中，配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液。將牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基或PDA培養(yǎng)基(不加瓊脂)，按每孔100 μL加入到96孔板中，再向第1個(gè)孔中加入上述樣品溶液100 μL混合均勻，再?gòu)牡?孔中吸取100 μL于第2孔中混合均勻，再?gòu)牡?孔中吸取100 μL于第3孔中混合均勻，連續(xù)稀釋至第10孔，從第10孔中取出100 μL棄去，第11孔和第12孔分別留作牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基和DMSO溶劑陰性對(duì)照。第1 ～ 10孔中化合物的質(zhì)量濃度依次為500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL、62.5 μg/mL、31.3 μg/mL、15.6 μg/mL、7.81 μg/mL、3.91 μg/mL、1.95 μg/mL和0.98 μg/mL。用無菌水將斜面培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的指示菌沖洗下來，用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基或PDA培養(yǎng)基(不加瓊脂)配制成濃度為106CFU/mL的菌懸液，向每孔中加入100 μL指示菌菌懸液。選用青霉素鈉作為革蘭氏陽性菌的陽性對(duì)照，硫酸鏈霉素作為革蘭氏陰性菌的陽性對(duì)照，酮康唑作為植物病原菌真菌的陽性對(duì)照。上述每組進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。將細(xì)菌試驗(yàn)組的96孔板置于37 ℃培養(yǎng)24 h、植物病原菌真菌試驗(yàn)組的96孔板置于28℃培養(yǎng)48 h后觀察并記錄結(jié)果[14]。

該序列與鏈格孢霉(Alternariasp. SPS-04)的ITS序列(序列號(hào)為KM250374.1)同源性為99%，綜合形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析基礎(chǔ)上的菌株J14系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析(圖2)將菌株J14鑒定為鏈格孢霉。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株J14的鑒定

菌株J14形態(tài)初期為白色，隨后變墨綠色，后期為黑色，菌落呈絨毛狀，培養(yǎng)基背面無染色；顯微鏡下能夠明顯觀察到菌絲呈暗至黑色，有隔膜，分生孢子梗較短，分生孢子呈紡錘狀或倒棒狀，頂端延長(zhǎng)成喙?fàn)?，一般為褐色，且孢子密集易散落，因此初步確定菌株J14為鏈格孢屬真菌(圖1)。經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得的菌株J14的ITS序列長(zhǎng)1315 bp(GenBank中的序列號(hào)為KP003986.1，基因序列為：

該序列與鏈格孢霉(Alternariasp. SPS-04)的ITS序列(序列號(hào)為KM250374.1)同源性為99%，綜合形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析基礎(chǔ)上的菌株J14系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析(圖2)將菌株J14鑒定為鏈格孢霉。

圖1 夾竹桃內(nèi)生真菌J14的形態(tài)學(xué)特征

Fig.1 Morphological features of the fungus strain J14 ofN.indicum

圖2 基于ITS序列基礎(chǔ)上的夾竹桃內(nèi)生真菌J14 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

Fig.2 Phylogenetic tree of the fungus strain J14 ofN.indicumbased on ITS sequence

圖3 8種夾竹桃內(nèi)生真菌J14次生代謝化合物的化 學(xué)結(jié)構(gòu)

Fig.3 Chemical structures of the eight compounds isolated from the fungus strain J14 ofN.indicum

2.2 代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定

從菌株J14固體發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到8個(gè)化合物，分別為交鏈孢甲醚(1)、交鏈孢酚(2)、malformin A1(3)、胸腺嘧啶(4)、尿嘧啶(5)、黃嘌呤(6)、赤蘚醇(7)、甘露醇(8)。其結(jié)構(gòu)式見圖3。

化合物1：淡紫色粉末(甲醇)，mp 277 ～ 278℃。

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ：11.84 (s, 1H, 7-OH), 10.40 (s, 1H, 3-OH), 7.24 (d, J= 1.7 Hz, 1H, 10-H), 6.74 (d, J= 2.2 Hz, 1H, 2-H), 6.66 (d, J= 2.4 Hz, 1H, 4-H), 6.63 (d, J=1.9 Hz, 1H, 8-H), 3.92 (s, 3H, 9-OCH3), 2.74 (s, 3H, 1-CH3)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ：166.13 (6-C), 164.66 (9-C), 164.10 (7-C), 158.54 (3-C), 152.60 (4a-C), 138.44 (1-C), 137.75 (10a-C), 117.57 (2-C), 108.77 (10b-C), 103.39 (10-C), 101.59 (4-C), 99.15 (8-C), 98.44 (6a-C), 55.81 (9-OCH3), 25.00 (1-CH3)。經(jīng)與文獻(xiàn)[15]對(duì)照核磁數(shù)據(jù)，確定化合物1為交鏈孢甲醚(alternariol methyl ether)。

化合物2：白色粉末(甲醇)，mp 320 ～ 321℃。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ：11.78 (s, 1H, 7-OH), 10.91 (s, 1H, 9-OH), 10.34 (s, 1H, 3-OH), 7.25 (d,J= 1.2 Hz, 1H, 10-H), 6.72 (d,J= 2.1 Hz, 1H, 2-H), 6.64 (d,J= 2.3 Hz, 1H, 4-H), 6.37 (d, J= 1.5 Hz, 1H, 8-H), 2.71 (s, 3H, 1-CH3)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ：165.36 (6-C), 164.65 (9-C), 164.01 (7-C), 158.37 (3-C), 152.57 (4a-C), 138.29 (1-C), 138.07 (10a-C), 117.47 (2-C), 108.90 (10b-C), 104.25 (10-C),101.55 (4-C), 100.81 (8-C), 97.35 (6a-C), 25.22 (1-CH3)。經(jīng)與文獻(xiàn)[16]對(duì)照核磁數(shù)據(jù)，確定化合物2為交鏈孢酚(alternariol)。

化合物3：白色晶體(甲醇)，mp > 350℃。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ：8.88 (d,J= 3.9 Hz, 1H, 18-NH), 8.63 (d,J= 6.7 Hz, 1H, 12-NH), 8.00 (d,J= 8.8 Hz, 1H, 1-NH), 7.40 (d, J= 9.2 Hz, 1H, 6-NH), 7.12 (d,J= 11.0 Hz, 1H, 21-NH), 4.73 (td,J= 10.9, 4.4 Hz, 1H, 21-H), 4.48 (td,J= 9.2, 6.3 Hz, 1H, 6-H), 4.00 (d,J= 3.5 Hz, 1H, 1-H), 3.97 - 3.91 (m, 1H, 18-H), 3.88 (dd, J= 10.4, 6.8 Hz, 1H, 12-H), 3.52 (dd, J= 14.9, 3.1 Hz, 1H, 19-Hb), 3.27 - 3.22 (m, 1H, 22-Hb), 3.18 (m, 2H, 19,22-Ha), 2.05 (m, 1H, 2-H), 1.71 (m, 1H, 13-H), 1.62 - 1.49 (m, 2H, 8-H, 14-Hb), 1.42 (m, 1H, 7-Hb), 1.38 - 1.29 (m, 1H, 7-Ha), 1.19 -1.10 (m, 1H, 14-Ha), 0.90 (d,J= 6.6 Hz, 3H, 9-H), 0.87 (d,J= 6.6 Hz, 3H, 10-H), 0.83 (d,J= 6.9 Hz, 9H, 3,4,15-H), 0.79 (d,J= 6.8 Hz, 3H, 16-H)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ：173.96 (20-C), 172.98 (11-C), 172.74 (17-C), 170.53 (5-C), 169.71 (23-C), 58.77 (1-C), 57.97 (12-C), 52.87 (21-C), 52.35 (18-C), 50.31 (6-C), 46.18 (19-C), 45.16 (22-C), 40.82 (7-C), 33.97 (13-C), 26.81 (2-C), 24.70 (14-C), 24.44 (8-C), 22.67 (9-C), 21.73 (10-C), 19.64 (3-C), 18.65 (4-C), 14.88 (16-C), 9.94 (15-C)。經(jīng)與文獻(xiàn)[17]對(duì)照核磁數(shù)據(jù)，確定化合物3為malformin A1。

化合物4：白色粉末(甲醇)，mp 310 ～ 312℃。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ：11.04 (s, 1H, 3-H), 10.62 (s, 1H, 1-H), 7.26 (d,J= 5.3 Hz, 1H, 6-H), 1.72 (s, 3H, 5-CH3)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ：164.90 (4-C), 151.46 (2-C), 137.70 (6-C), 107.62 (5-C), 11.79 (7-C)。經(jīng)與文獻(xiàn)[18]對(duì)照核磁數(shù)據(jù)，確定化合物4為胸腺嘧啶(thymine)。

化合物5：白色粉末(甲醇)，mp 335 ～ 337℃。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ：11.04 (s, 1H, 3-H), 10.84 (s, 1H, 1-H), 7.40 (dd, J= 7.5, 5.9 Hz, 1H, 6-H), 5.45 (d,J= 7.6 Hz, 1H, 5-H)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ：164.31 (4-C), 151.49 (2-C), 142.18 (6-C), 100.18 (5-C)。經(jīng)與文獻(xiàn)[19]對(duì)照核磁數(shù)據(jù)，確定化合物5為尿嘧啶(uracil)。

化合物6：白色粉末(甲醇)，mp > 350℃。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ：13.34 (s, 1H, 7-H), 11.54 (s, 1H, 1-H), 10.86 (s, 1H, 3-H), 7.94 (s, 1H, 8-H)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ：155.43 (6-C), 151.35 (2-C), 148.94 (4-C), 140.62 (8-C), 106.50 (5-C)。經(jīng)與文獻(xiàn)[20]對(duì)照核磁數(shù)據(jù)，確定化合物6為黃嘌呤(xanthine)。

化合物7：白色晶體(甲醇)，mp 125 ～ 126℃。1H-NMR (400 MHz, D2O) δ：3.63 (dd,J= 11.1, 1.5 Hz, 2H, 2,3-H), 3.50 (m, 4H, 1,4-H)。13C-NMR (100 MHz, D2O) δ：71.30 (2,3-C), 62.01 (1,4-C)。經(jīng)與文獻(xiàn)[21]對(duì)照核磁數(shù)據(jù)，確定化合物7為赤蘚醇(erythritol)。

化合物8：白色晶體(甲醇)，mp 167 ～ 169℃。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ：4.44 (d,J= 5.1 Hz, 2H, 3,4-OH), 4.36 (t,J= 4.9 Hz, 2H, 1,6-OH), 4.16 (d,J= 7.0 Hz, 2H, 2,5-OH), 3.61 (m, 2H), 3.54 (t,J= 7.6 Hz, 2H), 3.45 (m,2H), 3.37 (m,2H)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ：71.24 (2,5-C), 69.58 (3,4-C), 63.82 (1,6-C)。經(jīng)與文獻(xiàn)[22]對(duì)照核磁數(shù)據(jù)，確定化合物8為甘露醇(mannitol)。

2.3 化合物的抑菌活性

利用金黃色葡萄球菌、乳酸鏈球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌以及小麥赤霉病菌、番茄灰霉病菌、煙草枯萎病菌、白菜黑斑病菌對(duì)所得8個(gè)化合物進(jìn)行抑菌活性測(cè)試可知(表)，設(shè)置的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基或PDA培養(yǎng)基(不加瓊脂)和DMSO溶劑陰性對(duì)照組中測(cè)試菌株均正常生長(zhǎng)。

表 8種夾竹桃內(nèi)生真菌J14次生代謝化合物的最小抑菌濃度

注：青霉素鈉作為陽性菌的陽性對(duì)照，硫酸鏈霉素作為陰性菌的陽性對(duì)照，酮康唑作為植物病原菌真菌的陽性對(duì)照，-為未設(shè)置試驗(yàn)。

Note: Penicillin sodium, streptomycin sulfate and ketoconazole are used as positive CK, negative CK and plant pathogens fungus respectively. - means that the experiments are not set.

從表可知，化合物 1(交鏈孢甲醚)和化合物 2(交鏈孢酚)對(duì)金黃色葡萄球菌、乳酸鏈球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌以及小麥赤霉病菌、番茄灰霉病菌均有良好的抑菌活性，其活性和陽性對(duì)照結(jié)果相當(dāng)。其中，化合物1對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為1.95 μg/mL，對(duì)番茄灰霉病菌的最小抑菌濃度為3.91 μg/mL，皆優(yōu)于陽性對(duì)照。

3 結(jié)論與展望

從夾竹桃莖中分離得到的內(nèi)生真菌J14，經(jīng)形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析，鑒定其為鏈格孢霉(Alternariasp. SPS-04)，從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到8個(gè)化合物，分別為交鏈孢甲醚(1)、交鏈孢酚(2)、malformin A1(3)、胸腺嘧啶(4)、尿嘧啶(5)、黃嘌呤(6)、赤蘚醇(7)和甘露醇(8)。由此說明，夾竹桃內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物繁多?；衔?1(交鏈孢甲醚)和化合物 2(交鏈孢酚)對(duì)金黃色葡萄球菌、乳酸鏈球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌以及小麥赤霉病菌、番茄灰霉病菌的抑菌活性良好。因此，化合物 1(交鏈孢甲醚)和化合物 2(交鏈孢酚)可成為良好的抗菌藥物。

基于此研究，鏈格孢霉菌為抗菌藥物提供了新的來源。筆者將繼續(xù)對(duì)夾竹桃內(nèi)生真菌J14(鏈格孢霉)的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，以期得到抑菌效果更好或者結(jié)構(gòu)新穎的化合物。此外，還將對(duì)夾竹桃其他部位的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，并篩選活性較強(qiáng)的一系列內(nèi)生真菌，對(duì)其次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)的研究，從而進(jìn)一步開發(fā)和利用夾竹桃內(nèi)生真菌。

[1] 華永麗,歐陽少,林陳美,等.藥用植物內(nèi)生真菌研究進(jìn)展[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2008,10(4):105-111.

[2] 袁志林,戴傳超,史 央,等.內(nèi)生真菌B3促進(jìn)水稻生長(zhǎng)的機(jī)理研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2004(2):10-13.

[3] 倪志偉,李國(guó)紅,趙沛基,等.云南美登木內(nèi)生真菌Chaetom iumglobosum LY50'菌株的抗菌活性成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2008,20(1):33-36.

[4] Gu W, Ge H M, Song Y C, et al. Cytotoxic benzo[j]fluoranthene metabolites from Hypoxylon truncatum IFB-18, an endophyte of Artemisia annua[J]. Journal of Natural Products, 2007, 70(1):114-117.

[5] Strobel G, Ford E, Worapong J, et al. Isopestacin, an isobenzofuranone from Pestalotiopsis microspora, possessing antifungal and antioxidant activities[J]. Phytochemistry, 2002, 60(2):179-183.

[6] 楊顯志,張玲琪,郭 波,等.一株產(chǎn)長(zhǎng)春新堿內(nèi)生真菌的初步研究[J].中草藥, 2004, 35(1):79-81.

[7] Eyberger A L, Dondapati R, Porter J R. Endophyte fungal isolates from Podophyllum peltatum produce podophyllotoxin[J]. Journal of Natural Products, 2006, 69(8):1121-1124.

[8] Li X, Tian Y, Yang S X, et al. Cytotoxic azaphilone alkaloids from Chaetomium globosum TY1[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2013, 23(10):2945-2947.

[9] 石華建. 夾竹桃[J]. 生物學(xué)通報(bào), 2007, 42(7):18.

[10] 邢曉娟.夾竹桃的藥理作用與臨床應(yīng)用[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生, 2007, 23(16):2466.

[11] 魏景超.真菌鑒定手冊(cè)[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社, 1979.

[12] 曹永軍,程 萍,喻國(guó)輝,等.利用ITS1和ITS4通用引物擴(kuò)增香蕉枯萎病菌核酸片段鑒定其生理小種[J].熱帶作物學(xué)報(bào), 2010, 31(7):1098-1102.

[13] Roopesh K, Ramachandran S, Nampoothiri K, et al. Comparison of Phytase production on wheat bran and oilcakes in solid-state fermentation by Mucor racemosus[J]. Bioresource Technology, 2006, 97(3):506-511.

[14] 劉 果.三尖杉內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物及抑菌活性的研究[D].西安：陜西科技大學(xué)，2013.

[15] Tan N, Tao Y, Pan J, et al. Isolation, structure elucidation, and mutagenicity of four alternariol derivatives produced by the Mangrove endophytic fungus No. 2240[J]. Chemistry of Natural Compounds, 2008, 44(3):296-300.

[16] 吳少華,陳有為,李治瀅,等.滇牡丹內(nèi)生真菌Alternaria sp. PR-14的代謝產(chǎn)物研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2011, 23(5):850-852.

[17] 王發(fā)左,朱天驕,張 敏,等. 海洋真菌Rhizopus sp. 2-PDA-61化學(xué)成分的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2011, 23(2):199-201.

[18] 胡曉蘭,徐文峰,盧 軒,等.植物內(nèi)生真菌Fusariums sp.LC-1次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志, 2013,48(1):17-21.

[19] 徐俞悅,程 琳,楊天楓,等.雷斯青霉菌次生代謝產(chǎn)物研究[J].中藥材, 2014, 37(12):2204-2206.

[20] 苗翠蘋,胡 娟,翟英哲,等.滇牡丹內(nèi)生真菌PR20的鑒定及次生代謝產(chǎn)物的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2012, 24(10):1339-1342.

[21] 李 帆,周本宏,閆興國(guó).狹葉蕁麻地上部分化學(xué)成分的研究[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2008, 28(11):873-874.

[22] 楊秀芳,徐小娜,張弘弛,等.無花果植物內(nèi)生真菌FS11次生代謝產(chǎn)物化學(xué)成分的分離與鑒定[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2012, 23(6):1369-1371.

(責(zé)任編輯： 孫小嵐)

Isolation and Secondary metobalities Antibucterial activity of J14,An Endophytic Fungus inNeriumindicum

MIAO Zhi， MA Yangmin*， KONG Yang， XU Qian， QU Zirui

(KeyLaboratoryofAuxiliaryChemistry&TechnologyforChemicalIndustry,MinistryofEducation,ShaanxiUniversityofScienceandTechnology,Xi’an，Shaanxi710021,China)

To exploit and protect resources ofN.indicum, the fungus strain J14 which was isolated fromN.indicumin Qinling Mountain with higher antimicrobial activities was identified and secondary metobalities of J14 was studued. The strain J14 was identified according to its morphological characteristics and ITS sequence. The secondary metabolities from J14 were isolated by silica gel column, Sephadex LH-20 column chromatography, recrystallization, and so on. Their structures were determined by their physicochemical properties, 1H-NMR and 13C-NMR data. Antimicrobial activities of all compounds were tested againstStaphylococcusaureus,Streptococcuslactis,Enterococcuscoli,Pseudomonasaeruginosa,Fusariumgraminearum,Botrytiscinerea,Tobaccowiltpathogens,Cabbageshadinggerms. Results: The strain J14 was defined asAlternariasp. SPS-04. Eight compounds from fermentation of J14 were identified as alternariol methyl ether(1), alternariol(2), malformin A1(3), thymine(4), uracil(5), xanthine(6), erythritol(7) and mannitol(8). Compounds 3,4,5,6,7 were firstly obtained from fermentation of the genusAlternaria. Compounds 1 showed a MIC value of 1.95 μg/mL againstS.aureusand showed a MIC value of 3.91 μg/mL againstB.cinerea.

endophytic fungus;Neriumindicum;Alternariasp.; secondary metabolites; antimicrobial activities

2015-05-21； 2015-12-03修回

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目“藥用植物內(nèi)生真菌中抗菌活性代謝產(chǎn)物研究”(20116125110001)；陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目“植物內(nèi)生真菌溜曲霉中吲哚二酮哌嗪類代謝產(chǎn)物的研究”(2014JZ003)；陜西省教育廳自然科學(xué)專項(xiàng)項(xiàng)目“蝙蝠葛莖葉抗植物病原菌活性物質(zhì)基礎(chǔ)的研究”(2013JK0726)

苗 智(1991-)，男，在讀碩士，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail：pokemon001@126.com

*通訊作者:馬養(yǎng)民(1963-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。E-mail：mym63@sina.com

1001-3601(2016)01-0024-0088-05

R932； O629

A