黃智勇 王立雅 謝春雨 陳亞軍 陳艷 高松城 傅學(xué)文 余秋鋒 邱雪芳

[摘要] 目的 探討精子DNA碎片指數(shù)（DFI）對(duì)體外受精-胚胎移植（IVF-ET）妊娠結(jié)局的預(yù)測(cè)價(jià)值。 方法 選取2014年12月～2015年5月在本中心接受IVF-ET治療的208對(duì)不孕夫婦作為研究對(duì)象，按照WHO標(biāo)準(zhǔn)，采用改良精子染色質(zhì)擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)（SCD）對(duì)男方進(jìn)行精子DFI檢測(cè)，并根據(jù)精子DFI值將上述IVF-ET患者分為低DFI（<30%）組和高DFI（≥30%）組，分析各組的受精率、正常受精率、可利用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎形成率、優(yōu)質(zhì)胚胎移植率和妊娠結(jié)局。 結(jié)果 低DFI組與高DFI組的可利用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎形成率和優(yōu)質(zhì)胚胎移植率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。低DFI組的受精率、正常受精率和臨床妊娠率顯著高于高DFI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01或P<0.05）。 結(jié)論 精子DFI與胚胎質(zhì)量無關(guān)，其可影響IVF受精率和臨床妊娠率。精子DFI檢測(cè)可以作為精液質(zhì)量的檢測(cè)指標(biāo)對(duì)體外受精結(jié)局進(jìn)行預(yù)測(cè)。

[關(guān)鍵詞] 精子DNA碎片指數(shù)；體外受精-胚胎移植；妊娠結(jié)局

[中圖分類號(hào)] R711.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）02（a）-0097-03

Study of sperm DNA fragmentation index on predictive value of pregnancy outcome in vitro fertilization-embryo transplantation

HUANG Zhi-yong WANG Li-ya XIE Chun-yu CHEN Ya-jun CHEN Yan GAO Song-cheng FU Xue-wen YU Qiu-feng QIU Xue-fang

Center for Reproductive Medicine，Maternal and Child Health Care Hospital of Shaoguan City in Guangdong Province，Shaoguan 512026，China

[Abstract] Objective To explore the predictive value of pregnancy outcome in vitro fertilization （IVF）-embryo transplantation （ET） by sperm DNA fragmentation index （DFI）. Methods 208 pairs of infertile couples accepted the IVF-ET treatment in our center from May 2015 to December 2014 were selected as the research object，according to World Health Organization （WHO） standard，sperm DFI was tested by modified sperm chromatin dispersion （SCD） test.The above mentioned participants were divided into the low DFI group （<30%） and the high DFI group （≥30%） based on the value of sperm DFI.The rate of fertilization，the rate of normal fertilization，the usable embryo rate，the formation rate of embryo in high quality，the transplantation rate of embryo in high quality and pregnancy outcome in two groups was analyzed. Results There was no significant difference in the usable embryo rate，the formation rate of embryo in high quality，or the transplantation rate of embryo in high quality between the low DFI group and the high DFI group （P>0.05）.The rate of fertilization，the rate of normal fertilization and the clinical pregnancy rate in the low DFI group was higher than that in the high DFI group，with significant difference （P<0.01 or P<0.05）. Conclusion Sperm DFI is not related with embryo quality，which can influence on IVF fertilization rate and clinical pregnancy rate.Sperm DFI detection can be considered as inspection index of semen quality used for prediction of IVF outcome.

[Key words] Sperm DNA fragmentation index；In vitro fertilization-embryo transplantation；Pregnancy outcome

目前，不明原因的受精失敗時(shí)有發(fā)生，除卵子的因素外，精子也起到至關(guān)重要的作用。精液常規(guī)已不能很好地評(píng)估精子的情況，因此，對(duì)于精子DNA碎片的研究也逐漸升溫。20世紀(jì)以來，隨著我國工業(yè)化程度的提高，環(huán)境污染的逐漸加重、人精神壓力的不斷增大以及過多地接觸一些化學(xué)物質(zhì)均可能損傷男性精子。本研究選取在本中心進(jìn)行體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transplantation，IVF-ET）助孕治療的男性精液標(biāo)本作為研究對(duì)象，檢測(cè)其精子DNA碎片指數(shù)（DNA fragmentation index，DFI），并分析DFI與受精率、正常受精率、可利用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎形成率、優(yōu)質(zhì)胚胎移植率和臨床妊娠率之間的關(guān)系，探討DFI對(duì)于預(yù)測(cè)IVF-ET妊娠結(jié)局的指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年12月～2015年5月在本中心采用長方案超排卵治療、IVF助孕的208對(duì)不孕夫婦作為研究對(duì)象。為排除女方因素的影響，有以下情況者不屬于本研究范圍：①女方年齡>40歲；②FSH>15 mIU/ml；③取卵<5個(gè)；④內(nèi)膜厚度<7 mm。對(duì)男方精液進(jìn)行DFI檢測(cè)，按結(jié)果分為低DFI（<30%）組和高DFI（≥30%）組。

1.2 超排方案

采用常規(guī)長方案，于月經(jīng)周期第19天或第20天開始，肌內(nèi)注射促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（注射用醋酸曲普瑞林，天津博福-益普生制藥有限公司）1.00～1.25 mg/次；14 d后檢測(cè)血清檢促卵泡激素（FSH）、黃體生成素（LH），達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)后開始加用人絕經(jīng)期促性腺激素（HMG或麗申寶，珠海麗珠制藥）112.5～225.0 U，肌內(nèi)注射8～12 d，當(dāng)主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)到18 mm時(shí)肌內(nèi)注射人絨毛膜促性腺激素（HCG，珠海麗珠制藥）8000～10000 U，36～38 h取卵。

1.3 精液采集和處理

男方禁欲3～5 d，在取卵當(dāng)日以手淫法收集精液，立即放置于37℃的恒溫平臺(tái)上，待精液完全液化后進(jìn)行分析。采用密度梯度離心法+上游法對(duì)精液進(jìn)行處理，取處理后的精液懸液采用精子染色質(zhì)擴(kuò)散法（SCD）檢測(cè)DFI（精子DNA碎片檢測(cè)試劑盒，深圳華康生物科技有限公司）。密度梯度離心法：將樣品離心沉降，分離。上游法：利用活動(dòng)精子具有游過液體界面進(jìn)入不同培養(yǎng)液的能力，分離活力強(qiáng)的精子與死精子、凝集精子、畸形精子、白細(xì)胞及雜質(zhì)。SCD步驟：①室溫20～28℃，試劑盒室溫下平衡30～60 min；②將低熔點(diǎn)瓊脂糖管（含140 μl低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液）放入90～100℃水浴，至瓊脂糖凝膠完全熔解，放置于37℃水浴箱至溫度恒定；③采用精子稀釋液將精子密度調(diào)至5×106～10×106個(gè)/ml，取60 μl加入低熔點(diǎn)瓊脂糖管中，混勻；④取上述懸浮液30 μl滴入預(yù)處理載玻片，輕蓋蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡，置于2～8℃冰箱4 min，整個(gè)過程要保持載玻片水平位置；⑤取出載玻片，移走蓋玻片，迅速浸入變性液中7 min；取出后放入蒸餾水中浸泡5 s，然后取出載玻片并豎立，濾紙吸干水珠，要注意勿接觸標(biāo)本區(qū)域，載浸入裂解液中反應(yīng)20 min；⑥反應(yīng)畢，浸入洗滌液3 min，洗掉裂解液，再依次浸入70%、90%、無水乙醇溶液中脫水各2 min，自然晾干，瑞氏染色劑染色.染色后，蒸餾水沖洗10～15次，除去多余染色劑，風(fēng)干，常規(guī)顯微鏡下觀察。

1.4 受精、胚胎觀察和移植

取卵當(dāng)日常規(guī)進(jìn)行IVF，受精后16～18 h進(jìn)行觀察，2PN（原核）為正常受精胚胎，0PN、1PN和≥3PN為異常受精胚胎。受精后48 h觀察胚胎情況，卵裂球?yàn)?～8個(gè)，細(xì)胞大小均勻或基本均勻，無空泡，碎片≤20%判定為優(yōu)質(zhì)胚胎。根據(jù)患者的情況選擇1～3枚胚胎進(jìn)行移植，移植后14 d測(cè)定血清β-HCG，以確定生化妊娠；移植后28 d檢查到宮腔內(nèi)妊娠囊確診為臨床妊娠。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

低DIF組有179個(gè)取卵周期，移植周期150個(gè)。高DIF組有29個(gè)取卵周期，移植周期25個(gè)。低DFI組的胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎形成率和優(yōu)質(zhì)胚胎移植率與高DFI組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。低DFI組的受精率、正常受精率和臨床妊娠率顯著高于高DFI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01或<0.05）（表1）。

3 討論

據(jù)調(diào)查，全世界育齡夫婦中，15%存在不育問題，其中8%～22%完全歸因于男性，21%～38%與夫婦雙方有關(guān)[1]。精子DNA完整性不僅會(huì)嚴(yán)重影響到精子的受精能力，導(dǎo)致受精后原核的形成，還可能導(dǎo)致流產(chǎn)、后代先天畸形或者某些遺傳性疾病。對(duì)于輔助生殖技術(shù)助孕患者而言，精子DFI是影響助孕成功的不利因素之一，因此，檢測(cè)精子DNA的完整性對(duì)不育患者精子質(zhì)量的評(píng)估具有重要價(jià)值[2]。已有研究[3]顯示，精子DNA碎片在輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域中仍顯示出巨大的預(yù)測(cè)價(jià)值。精液質(zhì)量決定著受孕的成功率及胎兒質(zhì)量，不育癥患者的精子DNA損傷程度較生育男子顯著增高。

有研究采用末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記（TUNEL）技術(shù)法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，精子DFI與ART受精率之間存在負(fù)相關(guān)，提示精子頂體酶活性以及精子穿透透明帶并與卵黃膜融合的能力可能會(huì)隨著精子DNA碎片的增加而降低，進(jìn)而影響精子的受精能力[4-5]，而使用連續(xù)順序追蹤超聲檢查法檢測(cè)的數(shù)據(jù)則則顯示無顯著相關(guān)性[6]。關(guān)于胚胎質(zhì)量是否受影響的爭論也十分激烈，因?yàn)榫覦NA損傷影響胚胎質(zhì)量的機(jī)制還不甚明了，比較認(rèn)同的觀點(diǎn)是精子染色質(zhì)的異常導(dǎo)致胚胎質(zhì)量下降[6]。但是通常情況下精子DNA是在著床前胚胎發(fā)育的后期才開始表達(dá)，因此有學(xué)者認(rèn)為精子DNA可能對(duì)胚胎質(zhì)量影響不大[7]。

Benchaib等[8]認(rèn)為，精子DNA損傷與體外受精受孕率和胚胎質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)，通過精子DNA碎片可預(yù)測(cè)IVF的成功率。Velez等[9]也發(fā)現(xiàn)精子DNA斷裂率與受精率呈負(fù)相關(guān)，并指出其閾值為18%，胚胎質(zhì)量與精子DNA損傷有關(guān)，但認(rèn)為臨床妊娠及分娩率與DNA損傷之間并無相關(guān)性[10]。本研究結(jié)果顯示，常規(guī)IVF-ET中，DFI≥30%的受精率、正常受精率和臨床妊娠率顯著低于DFI<30%者，而可利用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和優(yōu)質(zhì)胚胎移植率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有研究[11]顯示，染色質(zhì)異常的精子比正常精子更難以結(jié)合并穿過透明帶，進(jìn)入卵子后，染色質(zhì)去致密化過程出現(xiàn)障礙，妨礙雄性原核的形成。黃茜等[12]的研究顯示，精子DFI≥40%組的精子正常形態(tài)率、頂體完整率均顯著降低。鄭九嘉等[13]認(rèn)為，精子遺傳物質(zhì)受到破壞后可能影響相應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)錄或合成，進(jìn)而影響頂體酶原的生成，或者由于無法合成某種酶原激活物質(zhì)，使頂體酶無法被激活，最終表現(xiàn)為頂體酶活性降低，從而影響受精，因此，精子DNA損傷可能是導(dǎo)致受精失敗的重要原因。本研究中，可利用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎形成率和優(yōu)質(zhì)胚胎移植率組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的原因可能在于通過前期的受精過程已經(jīng)將有嚴(yán)重DNA損傷的精子進(jìn)行了自然淘汰，輕微損傷的精子受精后卵母細(xì)胞可以對(duì)其DNA進(jìn)行修復(fù)[14-16]；而兩組臨床妊娠率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義提示精子DFI檢測(cè)可以預(yù)測(cè)IVF-ET的妊娠結(jié)局。

綜上所述，精子DNA損傷影響IVF中的受精率和正常受精率，其與胚胎質(zhì)量無關(guān)，但可以預(yù)測(cè)IVF-ET的妊娠結(jié)局。其作為男性生育力評(píng)價(jià)的補(bǔ)充指標(biāo)，有必要在行IVF-ET治療的患者中常規(guī)開展精子DFI檢查。

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（收稿日期：2015-10-15 本文編輯：祁海文）