超聲輔助響應(yīng)面法優(yōu)化巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷共同提取工藝研究

張建?！●T彬彬　牛小花

摘要：目的 應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷的超聲輔助提取工藝。方法 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取時(shí)間、液固比對巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷含量的影響。結(jié)果 最佳超聲輔助提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)73%、超聲提取時(shí)間22 min、料液比為1∶32，巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷得率分別為（15.90±0.12）%和（0.75±0.05）%。結(jié)論 本研究所建立的提取工藝能夠提高巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷的提取率，與模型預(yù)測值相符。

關(guān)鍵詞：巫山淫羊藿；朝藿定C；淫羊藿苷；超聲輔助提??；響應(yīng)面法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.023

中圖分類號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）03-0085-04

Abstract： Objective To optimize ultrasonic-assisted extraction Epimedin C and Icariin from Epimedii Wushanensis Herba by response surface methodology. Methods On the basis of single factor tests， Box-Behnken experimental design and response surface methodology were adopted to optimize extraction conditions with the concentration of ethanol， ultrasonic time and solid-liquid ratio as factors. HPLC was used to determine the content of Epimedin C and Icariin from Epimedii Wushanensis Herba. Results Optimal ultrasound-assisted extraction technology was as following： the concentration of ethanol was 73%； the ultrasonic time was 22 min； the ratio of liquid to material was 1：32. The contents of Epimedin C and Icariin from Epimedii Wushanensis Herba were 15.90% and 0.75%， respectively. Conclusion This extraction technology can improve the extraction efficiency of Epimedin C and Icariin from Epimedii Wushanensis Herba， which is in accordance with predicted value.

Key words： Epimedii Wushanensis Herba； Epimedin C； Icariin； ultrasound-assisted extraction； response surface method

巫山淫羊藿為小檗科淫羊藿屬植物巫山淫羊藿Epimedium wushanense T.S.Ying的干燥葉，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨等功效。巫山淫羊藿中的主要活性成分是淫羊藿苷、朝藿定C，其中朝藿定C的含量較高，因此巫山淫羊藿有區(qū)別于其他淫羊藿的藥效特性[1-4]。2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）將其單列，表明巫山淫羊藿有其獨(dú)特之處。近年來，我國學(xué)者就淫羊藿的主要成分提取工藝開展了很多研究工作[1-2，4]，但迄今對巫山淫羊藿的研究較少。超聲波輔助提取法是利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、高加速度、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、攪拌作用等，加速有效成分進(jìn)入溶劑，從而提高浸出率，縮短提取時(shí)間，具有操作方便、品質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[5-8]。為了進(jìn)一步優(yōu)化巫山淫羊藿提取工藝，根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果[2，9-12]，本研究采用乙醇作為溶劑，結(jié)合超聲波輔助提取巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷，并通過Box-Behnken試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法優(yōu)選提取工藝，為巫山淫羊藿的開發(fā)利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

美國Agilent1260智能柱溫箱及VWD紫外檢測器；KQ5200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；BSA224S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；DGX-9143B-1型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HH.SYZ1-NI型電熱恒溫水浴鍋，北京市長風(fēng)儀器儀表公司；SHB-IV雙A循環(huán)式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；Millipore純水系統(tǒng)。

朝藿定C、淫羊藿苷對照品，中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為111780-200801、110737-200415）；乙醇、甲醇等均為分析純，乙腈、甲醇為色譜純；水為去離子水，其他試劑均為分析純。巫山淫羊藿，采集野生植物，經(jīng)西南大學(xué)王海洋教授鑒定為小檗科淫羊藿屬植物巫山淫羊藿Epimedium wushanense T.S. Ying的干燥葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 朝藿定C和淫羊藿苷含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈和水，采用梯度洗脫（乙腈：0～10 min，20%；10～20 min，45%；20～25 min，55%；25～30 min，20%），流速為1.0 mL/min，溫度25 ℃，檢測波長270 nm，進(jìn)樣量20 μL[10-12]。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取朝藿定C和淫羊藿苷對照品10 mg，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，加乙醇溶解，得朝藿定C和淫羊藿苷儲(chǔ)備液，將朝藿定C和淫羊藿苷儲(chǔ)備液配制成質(zhì)量濃度均為6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分析，以峰面積對質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得朝藿定C回歸方程Y=52.90X+82.25（r2=0.999 1），淫羊藿苷回歸方程Y=22.37X+28.37（r2=0.999 6），朝藿定C和淫羊藿苷線性范圍均為6.25～200.00 mg/L。

2.1.3 樣品測定 將巫山淫羊藿葉片清洗、陰干、粉碎、過篩（孔徑0.355 mm），在60 ℃干燥4 h。稱取各試驗(yàn)設(shè)計(jì)的恒重后的巫山淫羊藿粉末0.2 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，按照設(shè)計(jì)的試驗(yàn)條件進(jìn)行提取，過濾，濾液過微孔濾膜，即得樣品溶液，進(jìn)樣。

2.2 單因素試驗(yàn)考察

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 取巫山淫羊藿粉末1.0 g，精密稱定，固定超聲時(shí)間20 min，提取溫度50 ℃，料液比1∶30，分別用體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液提取，測定朝藿定C和淫羊藿苷得率。結(jié)果朝藿定C含量分別為（1.25±0.24）%、（1.34±0.45）%、（1.42±1.03）%、（1.46±0.67）%、（1.50±0.56）%、（1.49±0.94）%、（1.37±1.34）%，淫羊藿苷含量分別為（0.42±0.23）%、（0.48±1.07）%、（0.54±0.37）%、（0.68±0.62）%、（0.71±0.71）%、（0.67±0.92）%、（0.65±1.18）%，故綜合考慮選擇70%乙醇。

2.2.2 超聲時(shí)間 取巫山淫羊藿粉末1.0 g，精密稱定，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度50 ℃，料液比1∶30，分別超聲提取10、15、20、25、30、35、40 min，測定朝藿定C和淫羊藿苷得率。結(jié)果朝藿定C的含量分別為（1.32±0.57）%、（1.43±1.95）%、（1.52±0.75）%、（1.50±0.08）%、（1.48±0.24）%、（1.47±0.14）%、（1.45±0.46）%，淫羊藿苷含量分別為（0.57±1.04）%、（0.63±0.73）%、（0.70±0.26）%、（0.68±0.73）%、（0.66±0.26）%、（0.65±0.87）%、（0.67±0.21）%，故綜合考慮選擇超聲提取20 min。

2.2.3 提取溫度 取巫山淫羊藿粉末1.0 g，精密稱定，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，超聲提取時(shí)間20 min，料液比1∶30，分別于30、40、50、60、70、80 ℃進(jìn)行提取，測定朝藿定C和淫羊藿苷得率。結(jié)果朝藿定C含量分別為（1.42±0.25）%、（1.44±0.31）%、（1.49±0.58）%、（1.47±0.29）%、（1.48±0.27）%、（1.51±0.81）%，淫羊藿苷的含量分別為（0.62±1.01）%、（0.65±0.82）%、（0.68±0.54）%、（0.68±0.37）%、（0.65±0.64）%、（0.63±0.71）%，說明提取溫度對朝藿定C的提取率影響不大，故綜合考慮選擇提取溫度為50 ℃。

2.2.4 料液比 取巫山淫羊藿粉末1.0 g，精密稱定，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，超聲提取時(shí)間20 min，超聲溫度為50 ℃，料液比（g/mL）分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40進(jìn)行提取，測定朝藿定C和淫羊藿苷得率。結(jié)果朝藿定C含量分別為（1.38±0.25）%、（1.41±0.78）%、（1.45±0.92）%、（1.48±0.17）%、（1.51±0.11）%、（1.50±0.28）%、（1.41±0.15）%，淫羊藿苷的含量分別為（0.48±0.28）%、（0.52±0.09）%、（0.58±0.17）%、（0.64±0.47）%、（0.69±0.28）%、（0.67±0.17）%、（0.65±0.58）%，故綜合考慮選擇料液比為1∶30。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)考察的結(jié)果，采用三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以乙醇濃度、超聲時(shí)間、料液比為自變量，以朝藿定C和淫羊藿苷的得率為因變量，研究響應(yīng)值及最佳變量的組合。試驗(yàn)因素水平見表1。共設(shè)計(jì)17個(gè)試驗(yàn)，重復(fù)3次。根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)，按照“2.1”項(xiàng)下方法測定朝藿定C和淫羊藿苷含量，試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2，響應(yīng)面分析見圖1，方差分析結(jié)果見表3。

從表3方差分析可知，對朝藿定C來說，B、C、A2、B2、C2為顯著影響因素；在各影響因素中，超聲時(shí)間（B）的影響最大，其次是料液比（C）、乙醇濃度（A）；在總的作用因素中，1次項(xiàng)和平方項(xiàng)的影響較大，而交互項(xiàng)影響相對較小。對淫羊藿苷來說，C、AB、AC、BC、A2、B2、C2為顯著影響因素；在各影響因素中，料液比（C）的影響最大，其次是乙醇濃度（A）、超聲時(shí)間（B）；在總的作用因素中，交互項(xiàng)和平方項(xiàng)的影響較大，而1次項(xiàng)影響相對較小，乙醇濃度和超聲時(shí)間、乙醇濃度和料液比、超聲時(shí)間和料液比均具有交互作用。

以朝藿定C和淫羊藿苷提取量為響應(yīng)值，采用Design-Expert軟件對表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行三元二次多項(xiàng)式逐步回歸擬合，得回歸方程Y=1.608+0.0025A+0.08125B+0.06125C-0.0175AB-0.0425AC+0.0150BC-0.0965A2-0.1390B2-0.0990C2、Y=0.7460+0.0200A+0.0175B+0.0275C-0.0500AB-0.0350AC-0.0300BC-0.0855A2-0.0705B2-0.0805C2。由表3可知，該模型高度顯著，失擬項(xiàng)相對于絕對誤差不顯著。模型確定系數(shù)（R2）為0.993 7，說明此模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好，能很好地描述試驗(yàn)結(jié)果。圖1響應(yīng)面分析更為直觀地表現(xiàn)了各因素與朝藿定C和淫羊藿苷提取量的相互關(guān)系，表明各因素對朝藿定C交互作用不顯著，而對淫羊藿苷含量交互作用顯著。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過Design Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化，確定朝藿定C的最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)76.24%、提取時(shí)間22.64 min、料液比1∶31.95 g/mL，朝藿定C理論提取量為1.58%；淫羊藿苷的最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取時(shí)間21.14 min、料液比1∶31.51 g/mL，淫羊藿苷理論提取量為0.75%。結(jié)合實(shí)際操作考慮，將工藝條件修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)73%、提取時(shí)間22 min、料液比1∶32 g/mL。按該工藝進(jìn)行5次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷提取量分別為（15.90±0.12）%和（0.75±0.05）%，與預(yù)測值基本一致，表明該三元二次方程與實(shí)際情況擬合較好，充分驗(yàn)證了所建模型的正確性。

3 討論

超聲波提取方法可較好地用于巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷有效成分的提取，其主要藥效成分可較好保留。在整個(gè)提取過程中溫度較低，有利于巫山淫羊藿中的有效成分不被破壞。

本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、液固比對巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷提取率影響顯著，采用響應(yīng)面法對超聲輔助提取的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果預(yù)測值與實(shí)測值基本一致，說明建立的工藝條件可靠，能有效提高巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷的提取率，對巫山淫羊藿資源的綜合利用及工業(yè)化生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化了提取巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷的4個(gè)關(guān)鍵因子，得到二次項(xiàng)回歸模型，并對交互項(xiàng)作用進(jìn)行分析。確定最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)73%，提取時(shí)間22 min，料液比1∶32 g/mL。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王輝，劉長路，杜惠蓉.超聲波法提取淫羊藿中淫羊藿苷工藝研究[J].廣州化工，2013，4l（13）：89-90.

[2] 姜寧，劉曉鵬.淫羊藿中淫羊藿苷的快速提取及測定研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2008，23（1）：64-66.

[3] 張華峰，高翔，盧大炎，等.HPLC法同時(shí)測定淫羊藿中朝藿定A、B、C與淫羊藿苷的含量[J].分析測試學(xué)報(bào)，2007，26（2）：198-201.

[4] 賈恒明，邢俊波.正交設(shè)計(jì)優(yōu)選淫羊藿中淫羊藿苷提取工藝[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26（3）：223-224.

[5] 潘國波，楊小明，丁艷，等.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取宣木瓜總皂苷提取工藝研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012，24（9）：1292-1296.

[6] 盧時(shí)勇，錢俊青，鄒小明.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取白術(shù)有效成分的研究[J].中國中藥雜志，2006，31（7）：549-552.

[7] 劉瑞林，詹漢英，陳鈿，等.響應(yīng)曲面優(yōu)化超聲輔助提取山茱萸籽油工藝及其成分分析[J].食品科學(xué)，2012，33（12）：1-7.

[8] 陳雅維，張延萍，周冬菊，等.響應(yīng)面法優(yōu)化葛根總黃酮的超聲輔助提取工藝[J].食品科學(xué)，2012，33（14）：41-44.

[9] 楊柳，鐘靜嫻，林巧玲，等.淫羊藿中淫羊藿苷的提取工藝研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2005，16（4）：286-293.

[10] 謝娟平，孫文基.梯度洗脫法同時(shí)快速分離測定不同品種不同部位淫羊藿中7種異戊烯基黃酮類成分的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 2010，22（5）：820-825.

[11] 謝娟平，王忠東，孫文基.淫羊藿屬9種淫羊藿葉中朝藿定C和淫羊藿苷量的考查[J].中草藥，2007，38（4）：613-614.

[12] 裴利寬，郭寶林，黃文華.淫羊藿屬主要資源種類的HPLC指紋圖譜特征和種類鑒定[J].中國中藥雜志，2008，33（14）：1662-1668.

（收稿日期：2015-05-07）

（修回日期：2015-06-01；編輯：陳靜）