乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍的毒性測定

夏曉華， 董 慧， 李會娜， 夏曉培， 常重杰*

(1.河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 河南 新鄉(xiāng) 453007； 2.河南省汝州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗測試中心， 河南 汝州 467500)

乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍的毒性測定

夏曉華1， 董 慧1， 李會娜2， 夏曉培1， 常重杰1*

(1.河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 河南 新鄉(xiāng) 453007； 2.河南省汝州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗測試中心， 河南 汝州 467500)

為探明除草劑乙氧氟草醚(Oxyfluorfen)對水生生物的毒性，以大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)為受試對象，進行乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍的急性毒性、生理毒性和DNA損傷試驗。結(jié)果表明：隨著染毒濃度增加和時間的延長，大鱗副泥鰍的死亡率升高，安全濃度為8.40 mg/L，根據(jù)中國《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》，乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍為低毒。乙氧氟草醚低濃度(8.00 mg/L，10.50 mg/L，13.00 mg/L)作用下，大鱗副泥鰍肝臟谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活性明顯升高；高濃度(15.50 mg/L)作用下酶活性在染毒2 d、4 d時呈上升趨勢，但在6 d時急速下降。15.50 mg/L組與空白對照組相比，大鱗副泥鰍肝細胞的彗尾DNA百分含量、彗星尾長和Olive尾矩明顯增加，肝細胞受到明顯損傷。

乙氧氟草醚； 大鱗副泥鰍； 谷丙轉(zhuǎn)氨酶； 谷草轉(zhuǎn)氨酶； 單細胞凝膠電泳

乙氧氟草醚(Oxyfluorfen)為美國羅門哈斯公司(現(xiàn)陶氏公司)1975年開發(fā)成功的二苯醚類除草劑，其制劑為24%乙氧氟草醚EC，商品名稱果爾。先后在美國、巴西、墨西哥等國取得登記，并于20世紀80年代在中國登記，登記作物為水稻[1]。乙氧氟草醚是一種觸殺型除草劑，在有光的情況下發(fā)揮除草作用[2]。隨著化學(xué)除草劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用，其對環(huán)境造成的污染也越來越嚴重。長期大量化學(xué)除草劑的應(yīng)用帶來的殘毒和環(huán)境污染，直接危害到人畜健康，影響農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的不合理使用，雨水沖刷、地表徑流及農(nóng)藥廠污水的肆意排放等使乙氧氟草醚進入河流、湖泊、海洋等水生生態(tài)系統(tǒng)，從而對水生生物的生存以及水生生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定與平衡造成威脅。鄒積鑫等[4]研究了乙氧氟草醚的同類藥劑乙羧氟草醚對斑馬魚的急性毒性和生物富集性，結(jié)果表明，乙羧氟草醚對斑馬魚8 d的生物富集系數(shù)很低，在魚體內(nèi)的富集量較少，而且其在水中的溶解性較差(溶解度僅0.6 mg/L)，降解較快，因此一般不會對水生生物產(chǎn)生長期的毒害和富集作用；但對魚類的急性毒性較高，因此在施用時應(yīng)合理控制劑量，盡量減少對水生生物的影響。但到目前為止，國內(nèi)外關(guān)于乙氧氟草醚對水生生物的遺傳毒性研究鮮見報道。為此，筆者以大鱗副泥鰍為材料，通過單細胞凝膠電泳等技術(shù)研究乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍的急性毒性、生理毒性和DNA損傷，以期為安全使用除草劑，保護漁業(yè)資源，維護生態(tài)平衡，保障人體健康提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

大鱗副泥鰍350尾，采自新鄉(xiāng)市海鴻農(nóng)貿(mào)市場，發(fā)育狀況良好，體長12～15 cm。用曝氣3 d的自來水在室內(nèi)暫養(yǎng)1周，水溫(20±2)℃，溶解氧5～6 mg/L，pH 6.9～7.2。隔天換水1次，染毒時挑選健康無病、規(guī)格一致的個體進行試驗。試驗前1 d停止喂食，進行饑餓處理，試驗期間不投喂飼料。乙氧氟草醚制劑購自新鄉(xiāng)市東海農(nóng)資市場(上?；莨饣瘜W(xué)有限公司，有效成分含量23.5%)。

1.2 急性毒性試驗

通過預(yù)試驗，找出乙氧氟草醚使大鱗副泥鰍在96 h內(nèi)全部存活的最高染毒濃度、全部死亡的最低染毒濃度，確定試驗濃度區(qū)間。正式試驗按等比濃度將乙氧氟草醚配制為18.75 mg/L、23.44 mg/L、29.30 mg/L、36.62 mg/L和45.78 mg/L 5個試驗組和1個空白對照組，每組均投放10尾健康大鱗副泥鰍，重復(fù)3次。每24 h更換1次等體積等濃度的乙氧氟草醚稀釋液，前12 h連續(xù)觀察，并及時清除死亡個體，以免影響其他個體的生存。觀察記錄大鱗副泥鰍在24 h、48 h、72 h及96 h的死亡數(shù)量，并記錄中毒癥狀。

采用改進寇氏法(Karber)[5-6]計算乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍的半數(shù)致死質(zhì)量濃度(LC50)和安全濃度(SC)。

LgLC50=Xm-i(∑p-0.5)

SC=LC50(24h)×0.3/[(LC50(24h)/LC50(48h))3

式中，Xm為死亡組最大劑量的對數(shù)，i為相鄰組濃度對數(shù)之差，∑p為各組死亡率的總和。

1.3 生理毒性試驗

在急性毒性試驗基礎(chǔ)上，在安全濃度和最大零致死濃度之間等差設(shè)置8.00 mg/L、10.50 mg/L、13.00 mg/L和15.50 mg/L 4個處理組和1個空白對照組，每組均隨機投放20尾健康大鱗副泥鰍，重復(fù)3次。每隔24 h各組分別更換1次等體積(2 L)等濃度的乙氧氟草醚稀釋液。分別于2 d、4 d和6 d每組隨機取3尾大鱗副泥鰍取出肝臟。肝臟勻漿的制備和谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活力的測定均按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書進行。

1.4 肝細胞的DNA損傷試驗

單細胞凝膠電泳(SCGE)檢測大鱗副泥鰍肝細胞DNA損傷。試驗設(shè)置同生理毒性試驗，分別2 d、4 d和6 d每個濃度取3尾大鱗副泥鰍制備肝細胞懸液，試驗步驟參照陳忻等[7-8]的方法進行。大鱗副泥鰍肝細胞的單細胞凝膠電泳運用CASP彗星圖像分析軟件進行分析，得出彗尾DNA百分含量(Tail DNA%)、彗尾長度(Tail length，TL)、Olive尾矩(Olive tail moment，OTM) 3項指標數(shù)據(jù)，導(dǎo)入統(tǒng)計分析軟件Spss16.0進行統(tǒng)計分析。

1.5 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用軟件Excel 2003進行整理，用軟件Spss 16.0軟件進行單因素方差分析，結(jié)果用平均數(shù)±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性

大鱗副泥鰍剛?cè)径緯r表現(xiàn)為急劇游動，四處亂竄，尤其在高濃度組中表現(xiàn)更為明顯，上躥下跳、打轉(zhuǎn)、翻白，片刻后趨于平靜，伏于水底，胸鰭張開。然后反應(yīng)遲鈍，身體彎曲，游動緩慢，逐漸喪失平衡能力，翻白肚等現(xiàn)象，死亡時身體僵直，脊椎略彎曲成弓形。從表1看出，隨乙氧氟草醚濃度的增加死亡率不斷升高。經(jīng)計算，乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍24 h、48 h、72 h和96 h的半數(shù)致死質(zhì)量濃度分別為41.87 mg/L、36.62 mg/L、29.96 mg/L和25.62 mg/L，安全濃度為8.40 mg/L。

表1 乙氧氟草醚各濃度組大鱗副泥鰍不同 染毒時間的死亡率

Table 1 MortalityofP.dabryanusexposed to different oxyfluorfen groups at different times

乙氧氟草醚濃度/(mg/L)Oxyfluorfenconcentration死亡率/%Mortality24h48h72h96h0．00000018．750003．3323．4403．3320．0026．6729．306．676．6736．6780．0036．6213．3363．3386．67100．0045．7870．0076．6796．67100．00

2.2 GPT和GOT活性

從表2看出，從相同時間不同質(zhì)量濃度來看，染毒2 d、4 d的肝細胞GPT、GOT活力均隨乙氧氟草醚濃度的增加而升高，且4 d時13.00 mg/L、15.50 mg/L濃度組與對照組比，GPT活力顯著升高，10.50 mg/L、13.00 mg/L和15.50 mg/L濃度組GOT活力極顯著升高。6 d時除乙氧氟草醚15.50 mg/L濃度組外，其余組隨乙氧氟草醚濃度增加GPT和GOT活力上升，在8.00 mg/L和10.50 mg/L時GPT活力顯著升高，13.00 mg/L時GPT活力極顯著升高；GOT活力在8.00 mg/L時顯著升高，10.50 mg/L和13.00 mg/L時極顯著升高。

2.3 肝細胞DNA損傷

熒光顯微鏡400倍鏡檢可見對照組大鱗副泥鰍肝細胞的細胞核均呈圓球形，彗星頭部DNA致密且集中；隨乙氧氟草醚濃度增加細胞核均有拖尾呈彗星樣，細胞核頭部逐漸縮小，拖尾程度逐漸增加，散發(fā)(圖示)。

從表3看出，在相同染毒時間，除乙氧氟草醚濃度15.50 mg/L染毒6 d外，其余隨乙氧氟草醚濃度增加彗尾DNA百分含量、Olive尾距和尾長逐漸增加。在同一濃度組，隨處理時間的延長，肝細胞凝膠電泳彗尾DNA百分含量、Olive尾距和尾長增加。

表2 乙氧氟草醚各濃度組大鱗副泥鰍不同染毒時間肝細胞的GPT及GOT活性

Table 2 GPT and GOT activity ofP.dabryanusliver cells treated with different concentrations of oxyfluorfen and different explose time

乙氧氟草醚濃度/(mg/L)Oxyfluorfenconcentration2dGPT活力(U/gprot)GOT活力(U/gprot)4dGPT活力(U/gprot)GOT活力(U/gprot)6dGPT活力(U/gprot)GOT活力(U/gprot)0．003．37±0．242．16±2．003．21±0．992．30±1．573．46±0．792．24±1．678．005．13±4．433．04±2．7919．30±10．118．03±0．4322．24±4．19?12．77±3．41?10．506．97±2．063．44±3．6921．39±7．7212．01±3．42??28．39±11．65?17．11±1．83??13．009．66±0．174．36±1．8130．76±11．85?12．89±0．41??32．59±9．80??16．45±5．21??15．5011．04±6．425．12±2．9930．98±7．62?14．55±3．50??15．00±1．547．95±3．89

注：*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)(下同)。

Note：Values followed by * and ** mean significant difference at 0.05 and 0.01 level， respectively. The same below.

注：CK為空白對照組，A、B、C和D分別表示乙氧氟草醚濃度為8.00 mg/L、10.50 mg/L、13.00 mg/L和15.50 mg/L。

Table 3 DNA damage ofP.dabryanusliver cells treated with different concentrations of oxyfluorfen and different expose time

時間Time濃度/(mg/L)Concentration彗尾DNA/%TailDNA尾長TaillengthOlive尾矩Olivetailmoment對照(CK)0．000．16±0．0917．50±9．190．17±0．072d8．000．71±0．6414．67±5．030．71±0．0510．501．06±0．2117．67±5．511．19±0．2413．002．74±0．22?43．67±11．592．95±0．3815．504．11±0．24??63．67±9．074．95±0．54??4d8．001．52±0．3622．00±7．071．66±0．5610．502．20±0．0125．67±7．772．12±0．2613．003．13±0．10?51．67±15．373．42±0．59?15．505．41±0．18??66．67±18．775．98±0．71??6d8．006．93±0．44??76．00±23．30?8．76±1．78??10．5011．55±0．62??116．67±34．02??15．79±3．00??13．0036．10±6．74??229．67±64．84??72．69±6．17??15．5015．13±1．08??154．67±45．71??29．34±1．54??

3 結(jié)論與討論

3.1 乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍的安全性

根據(jù)中國《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》[9]，農(nóng)藥對魚類96 h的LC50≤0.1 mg/L時該農(nóng)藥對魚類屬于劇毒，當0.1 mg/L<96 hLC50≤1.0 mg/L時屬于高毒，當1.0 mg/L<96 hLC50≤10 mg/L時屬于中毒，當96 hLC50>10 mg/L時屬于低毒。試驗結(jié)果表明，乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍的96 hLC50為25.62 mg/L，安全濃度為8.40 mg/L，說明乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍為低毒。但隨著染毒時間的延長大鱗副泥鰍死亡率升高，說明乙氧氟草醚對水生生物有毒害作用。因此，在使用該除草劑時一定要適量施用，注意安全，避免污染水源、破壞環(huán)境，以免對水生生物造成危害。

3.2 乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍GPT和GOT活性的影響

肝臟是營養(yǎng)物質(zhì)消化的主要腺體，也是尿素合成的主要場所，具有解毒功能。谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)是肝臟內(nèi)活性最高的2種轉(zhuǎn)氨酶，其活性變化與肝細胞的炎癥、變性和壞死等密切相關(guān)，即使非常小的劑量也會對肝功能造成損傷[10]。其中，GPT被推薦為肝功能損害最敏感的檢測指標，其活性變化亦是反映肝細胞受損的主要指標。GPT和GOT的活性提高能加快尿素生成，減少氨基酸代謝產(chǎn)物對機體的毒害[11]。試驗結(jié)果表明，乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍GPT和GOT的活性在染毒2 d、4 d時明顯高于對照組，說明短時間乙氧氟草醚處理可誘導(dǎo)2種酶活性的提高，加強毒物的排出；而染毒6 d時這2種酶的活力雖呈上升趨勢，但15.50 mg/L組的酶活力明顯低于13.00 mg/L組。說明，大鱗副泥鰍肝細胞長期處于不良狀態(tài)下，功能開始下降[12]。

3.3 乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍肝細胞的DNA損傷

單細胞凝膠電泳實驗是檢查細胞遺傳物質(zhì)損傷的一種方法。彗尾DNA百分含量、尾長和Olive尾距是彗星實驗中反映細胞DNA所受損傷的1個重要指標。彗尾DNA百分含量和Olive尾距越大，尾長越長說明細胞受到的DNA損傷越嚴重。試驗結(jié)果表明，乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍肝細胞的DNA損傷，在染毒2 d、4 d時低濃度組(8.00 mg/L,10.50 mg/L)大鱗副泥鰍肝細胞凝膠電泳的彗尾DNA百分含量、尾長和Olive尾距與對照組相比無顯著差異，而15.50 mg/L處理組的明顯升高，表明較高劑量的乙氧氟草醚對大鱗副泥鰍肝細胞DNA造成了損傷。在染毒6 d時，15.50 mg/L組的彗尾DNA百分含量、尾長和Olive尾距較13.00 mg/L組有所下降，可能是由于DNA的損傷過于嚴重，以至于電泳時造成DNA片段丟失，因此導(dǎo)致測量值下降[13-14]。

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(責任編輯： 馮 衛(wèi))

Toxic Determination of Oxyfluorfen onParamisgurnusdabryanus

XIA Xiaohua1， DONG Hui1， LI Huina2， XIA Xiaopei1， CHANG Zhongjie1*

(1.CollegeofLifeSciences，HenanNormalUniversity，Xinxiang,Henan453007; 2.JnspectionandTestingCenters,QualityandtechnicalsupervisionofRuzhou,Ruzhou,Henan467500,China)

In order to assess the toxicity of herbicide oxyfluorfen to aquatic organisms， regardingP.dabryanusas the experimental object， acute toxicity， physiological toxicity and DNA damage experiment were employed to study oxyfluorfen’s effect onP.dabryanus. Results:P.dabryanusmortality increased with the concentration increasing and the extension of time. The activities of GPT and GOT inP.dabryanusliver cells were induced by the lower concentration (8.00 mg/L, 10.50 mg/L, 13.00 mg/L) treatments group. The action of enzyme activity on 2 d,4 d rises，but it fell sharply in the 6 d under the high concentration (15.50 mg/L) of the oxyfluorfen. The liver cells’ DNA damage were checked by single cell gel electrophoresis technique (SCGE). Compared with the control group,treatment group’s (15.50 mg/L) three indexes,tail DNA content,the comet tail length and olive tail moment increased significantly(P<0.05), liver cell was obviously damaged.

oxyfluorfen；Paramisgurnusdabryanus； GPT； GOT； single cell gel electrophoresis(SCGE)

2015-06-30； 2015-12-17修回

國家自然科學(xué)基金項目“兩種泥鰍DMRT1基因不同選擇性剪接體的結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控機制研究”(31200923)；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點項目“大鱗副泥鰍DMRT1基因不同選擇性剪接體的表達模式分析”(12B180011)；河南師范大學(xué)引進人才科研項目“泥鰍DMRT1基因不同剪接體的克隆和時空表達模式分析”(01046500109)

夏曉華(1982-)，女，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事分子細胞遺傳學(xué)研究。E-mail:xxhlpf@163.com

*通迅作者：常重杰(1965-)，男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事分子細胞遺傳學(xué)研究。E-mail:changzhongjie@tom.com

1001-3601(2016)01-0030-0113-04

S948

A