大蒜精油對桃蚜生物活性及生理生化的影響

張 強， 梁煒博， 杜雪勇， 法艷海， 王學貴*

(1.四川省資陽市雁江區(qū)農(nóng)業(yè)技術推廣中心， 四川 資陽 641300； 2.四川農(nóng)業(yè)大學無公害農(nóng)藥研究室， 四川 成都 611130)

大蒜精油對桃蚜生物活性及生理生化的影響

張 強1， 梁煒博2， 杜雪勇2， 法艷海2， 王學貴2*

(1.四川省資陽市雁江區(qū)農(nóng)業(yè)技術推廣中心， 四川 資陽 641300； 2.四川農(nóng)業(yè)大學無公害農(nóng)藥研究室， 四川 成都 611130)

為獲得在環(huán)境中易降解無公害的植物源農(nóng)藥，研究大蒜精油對桃蚜的殺蟲活性及生理生化的影響，測定大蒜精油對桃蚜的觸殺毒力及其對試蟲蛋白質(zhì)含量、乙酰膽堿酯酶、中腸酯酶及海藻糖酶活性。結果表明：大蒜精油對桃蚜表現(xiàn)出很強的毒殺作用，其72 h觸殺毒力LC50值為77.03 μg/mL；大蒜精油可誘導桃蚜中腸酯酶活性增加，海藻糖不斷被分解，蛋白質(zhì)的合成逐漸被遏制，對能量代謝系統(tǒng)破壞較大，導致能量供求失衡而死亡。大蒜精油可作為生物殺蟲劑有效控制桃蚜。

大蒜精油； 桃蚜； 觸殺毒力； 生理生化； 酶活性

桃蚜[Myzwspersicae(Sulzer)]是蔬菜種植中的重要害蟲之一，其在蔬菜葉背或留種株的嫩梢嫩葉上危害，造成節(jié)間變短、彎曲，影響包心或結球，造成減產(chǎn)，同時傳播病毒病[1]。近年來，隨著城市化發(fā)展的加快，市場對蔬菜的需求量越來越大，大棚蔬菜栽培面積不斷擴大，蚜蟲在蔬菜上危害也日趨嚴重。運用化學藥劑對蔬菜蚜蟲進行防治是目前的主要措施，但是長期廣泛、單一使用已導致抗性、殘留等系列反應，尤其海南毒豇豆等蔬菜中毒事件屢有發(fā)生[2]。植物源農(nóng)藥因取材廣泛，在環(huán)境中降解容易，不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點成為新農(nóng)藥創(chuàng)制研究的熱點[3]。

植物精油是一類易揮發(fā)，結構簡單、常具有植物特征性氣味的分子構成，通常是由萜烯及生物酚類物質(zhì)組成，一般由幾十至幾百種化合物組成[4]，是一類植物源次生代謝物質(zhì)，對蔬菜品質(zhì)無負面影響，既可直接用于害蟲防治，又便于從中尋找天然模板進行人工合成[5]，是蔬菜害蟲防治的發(fā)展方向之一。植物精油對昆蟲具有驅(qū)避、熏蒸和觸殺活性，是一類對環(huán)境友好的廣譜性植物保護劑[6]。大蒜精油因具良好的殺蟲活性而被廣泛研究，如有研究表明大蒜(Alliumsativum)精油對致倦庫蚊(Culexpipiensquinquefasciatus)和埃及伊蚊(Aedesaegypti)幼蟲具有較強的毒殺作用等[7]。

目前，隨著城市化進程的加快，城市周邊大棚蔬菜的種植規(guī)模越來越大，種植周期越來越短，用藥頻率越來越高，不僅使農(nóng)藥殘留問題日漸凸顯，并且害蟲抗藥性日趨嚴重，尤其蔬菜蚜蟲由于繁殖能力強，時代重疊嚴重，同時也是傳播病毒病的一個蟲媒介體，嚴重影響了蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。為降低化學農(nóng)藥對環(huán)境的污染，開發(fā)植物源農(nóng)藥勢在必行。筆者對植物次生代謝物質(zhì)大蒜精油對桃蚜的生物活性進行測定，并深入研究其對蛋白質(zhì)含量以及中腸酯酶、海藻糖酶、乙酰膽堿酯酶活性的影響，以期為植物源農(nóng)藥有效控制桃蚜對十字花科蔬菜的危害和病毒病的傳播提供理論。

1 材料與方法

1.1 試驗蟲源、試劑及儀器

供試蟲源：桃蚜[Myzwspersicae(Sulzer)]，將采集的蚜蟲，在24～26℃條件下連續(xù)飼養(yǎng)多代，挑選大小一致的無翅成蚜作為供試蟲源。

藥品及試劑：大蒜精油(購自廣州市綠香島天然用品有限公司)。試驗中所用的溶劑及化學試劑如磷酸二氫鈉、α-萘酚、α-醋酸萘酯、氯化乙酰膽堿等均為AR級(購自銳勁特生化試劑有限公司)。

儀器：CP224S型電子天平(德國賽多利斯)、HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市易晨儀器制造有限公司)、Cryofuge 6000i GMP高速臺式冷凍離心機(德國賀力氏)、UV2000分光光度計尤尼柯(上海儀器有限公司)等。

1.2 毒力測定

采用點滴法[8]。用丙酮將大蒜精油配制成1 000 mg/L、500 mg/L、250 mg/L、125 mg/L和62.5 mg/L的不同濃度梯度溶液，每種溶液用微量點滴器點滴0.4 μL藥液于蚜蟲腹部，以30頭為1組，設置3次重復，以丙酮作為空白對照。于藥后24 h、48 h、72 h統(tǒng)計各處理的死亡情況，計算各處理的死亡率和校正死亡率以及回歸方程、r值、LC50及LC50值95%的置信區(qū)間。

1.3 蚜蟲生理生化指標測定及處理

用24 h的LC50濃度處理蚜蟲，然后在4 h、8 h、12 h和24 h后分別測定蚜蟲的蛋白質(zhì)含量以及中腸酯酶、海藻糖酶、乙酰膽堿酯酶活性。并計算其增強率或抑制率[9]。

1.4 酶液的制備

中腸酯酶液的制備：挑取各處理的成蚜15頭，加0.04 mol/L PBS(pH7. 0) 5 mL，冰浴下勻漿，在高速冷凍離心機上以3 500 r/ min 離心10 min，取上清液，用0. 04 mol/ L PBS 定容至10 mL作酶源，于-4℃冰箱冷藏備用。海藻糖酶液的制備：參照中腸酯酶液制備，用1.5%生理鹽水代替0.04 mol/L PBS(pH7. 0)；乙酰膽堿酯酶液的制備：參照中腸酯酶液制備，用0.04 mol/ L PBS(pH7. 2) 5 mL，余同[10]。

1.5 桃蚜蛋白質(zhì)含量的測定

采用紫外吸收法[11]。以0.04 mol/ L PBS(pH7. 0)為空白管調(diào)節(jié)零點，分別在紫外分光光度計280 nm和260 nm波長下測定酶提取液光密度，利用Lowry-Kalokar公式進行計算蛋白質(zhì)含量：

蛋白質(zhì)濃度 (mg/mL)=1.45OD280-0.74OD260。

1.6 桃蚜生物酶活力的測定

1.6.1 腸酯酶活力 在具塞刻度試管內(nèi)加入5 mL底物溶液(3×10-4mol/Lα-醋酸萘脂溶液)，再加入酶液1 mL搖勻后置于25 ℃下溫育30 min，加入顯色液1 mL搖勻，終止反應并顯色，待出現(xiàn)穩(wěn)定的藍綠色，在分光光度計上測定OD600值。對照以1 mL緩沖液代替酶液，其余處理相同。酶比活力以1 min內(nèi)OD值增加0.01為1個酶活力單位，并以單位/15頭蚜蟲表示[12]。

1.6.2 桃蚜海藻糖酶活力 取2%海藻糖溶液24 mL于小三角瓶中，加入酶液6 mL，搖勻置于37℃下溫育30 min后，置于沸水中煮2～3 min終止反應，將反應液用濾紙過濾后測定其中的還原性葡萄糖。測定方法采用陳長坤的測定方法[13]。酶比活力以1 min內(nèi)水解出還原性糖量增加1 mg為1個酶活力單位，并以單位/頭蚜蟲表示。

1.6.3 桃蚜乙酰膽堿酯酶 在具塞試管內(nèi)加入氯化乙酰膽堿1 mL，再加入酶液1 mL，迅速搖勻計時，并置于37 ℃下溫水浴40 min，而后立即依次加入2 mol/L鹽酸羥胺和3.5 mol/L氫氧化鈉混合液(按1∶1比例臨時混合)2 mL、1∶2鹽酸溶液(鹽酸與水體積比)1 mL、0.37 mol/L三氯化鐵溶液1mL，用分光光度計測定540 nm處的OD540值。對照以0.5 mL緩沖液代替酶液，且在加入鹽酸羥胺和氫氧化鈉混合液之前加1∶2鹽酸溶液，其余處理相同。酶比活力以1 min內(nèi)OD值增加0.01為1個酶活力單位，并以單位/15頭蚜蟲表示[8]。

2 結果與分析

2.1 大蒜精油對桃蚜的觸殺毒力

由表1可知，大蒜精油對桃蚜成蟲表現(xiàn)出較強的觸殺活性，其24 h、48 h及72 h的觸殺活性LC50值分別為270.99 μg/mL、112.97 μg/mL和77.03 μg/mL。

表1 大蒜精油對桃蚜的觸殺毒力

Table 1 Contact toxicity of garlic essential oil toM.persicae

處理時間/hTreatmenttime回歸方程(y=a+bx)Regressionequationab相關系數(shù)rCorrelationcoefficientLC50值/(μg/mL)LC50valueLC50值95%置信區(qū)間95%confidenceintervalsofLC50value242．79330．90700．9907270．99149．27～491．97481．87281．52330．9805112．9775．85～168．23721．66551．76730．995477．0350．29～118．01

2.2 大蒜精油對桃蚜生理生化的影響

2.2.1 大蒜精油處理桃蚜的蛋白質(zhì)含量及海藻糖酶活力 由表2可知，當蟲體接觸大蒜精油后其蛋白質(zhì)含量先增加后降低，在處理后8 h，供試桃蚜蛋白含量增加2.270 3 mg/15頭；處理12 h后蛋白質(zhì)

表2 大蒜精油處理桃蚜后蛋白質(zhì)含量及海藻糖的酶活力

注：①蛋白質(zhì)含量為3次重復的平均值±標準誤，②1min內(nèi)水解出還原性糖的量增加1mg為1個酶活力單位。

Note: ①, Mean ± SE; ②, increased 1 mg reducing sugar by hydrolyzing in a minute is used as one enzyme active unit.

含量受到抑制，抑制率達16.96%；在處理24 h，其蛋白質(zhì)含量達1.791 2 mg/15頭，抑制率為10.05%，后逐漸趨于正常水平。海藻糖酶活性先增高，其4 h時的酶比活力增強率達81.75%，8 h降低到對照水平(-1.12%)，后又逐漸上升到24 h的76.87%。

2.2.2 大蒜精油處理桃蚜的中腸酯酶和乙酰膽堿酯酶活力 由表3可知，大蒜精油作用蟲體后，迅速抑制中腸酯酶活性，藥后4 h的抑制率達41.97%，但在藥后8 h、12 h及24 h的酶活力分別較對照增強26.18%、27.27%和95.97%，說明大蒜精油作用蟲體后，先迅速抑制中腸酯酶活性，但蟲體在精油作用下酶活迅速增強適應逆境，加快對大蒜精油的解毒代謝；而大蒜精油作用桃蚜后4 h，乙酰膽堿酯酶活性略高于對照，說明桃蚜受到大蒜精油的刺激表現(xiàn)出興奮狀，但其活性逐漸降低，在8 h、12 h及24 h酶活力抑制率分別為1.4%、2.58%和3.1%。

表3 大蒜精油處理桃蚜后的中腸酯酶和乙酰膽堿酯酶活力

注：①和②均表示 1 min內(nèi)OD值增加0.01為1個酶活力單位。

Note: ①and ② both indicate that the increased 0.01 OD value in a minute is used as one enzyme active unit.

3 結論與討論

1) 測定大蒜精油對桃蚜的毒力及其生理生化的影響結果表明，大蒜精油對桃蚜具有較強的毒力，且經(jīng)大蒜精油LC50濃度處理的試蟲表現(xiàn)出短期內(nèi)酶活性被抑制，隨作用時間延長而被迅速誘導激活，海藻糖不斷被分解，蛋白質(zhì)的合成被遏制，破壞能量代謝供求失衡，最終導致死亡。

2) 昆蟲的生命活動和行為受內(nèi)部各系統(tǒng)的相互聯(lián)系和協(xié)調(diào)機制所控制。蛋白質(zhì)是生物體最重要的特征，它存在于所有生活的細胞中，如酶在細胞代謝過程中控制著很多化學反應。因此，蛋白質(zhì)及中腸酯酶、海藻糖酶等都是昆蟲能量代謝中的重要因子，它們之間一定存在著某些協(xié)調(diào)關系[12]。試驗表明，大蒜精油對桃蚜蛋白質(zhì)的合成有遏制作用，干擾其蛋白質(zhì)的正常代謝，12 h抑制率達16.96%；海藻糖酶活性則先增強，4 h時其酶比活力增強率達81.75%，說明桃蚜最初受大蒜精油刺激而興奮，能量消耗大，以滿足能量需求蟲體體內(nèi)儲藏的海藻糖被加速分解；而在處理8 h后降低到對照水平，之后逐漸上升，可能為桃蚜消化系統(tǒng)受到破壞，能量供應不足，只能利用蟲體自身儲存的海藻糖等能源，海藻糖不斷被分解，所以海藻糖酶比活力在8 h后又逐漸升高，直到桃蚜死亡。

3) 大蒜精油處理桃蚜后，其乙酰膽堿酯酶活性受刺激后略微升高后逐漸降低，但相對于空白對照變化較小，可能大蒜精油對桃蚜乙酰膽堿酯酶活性的影響較小。而昆蟲中腸酯酶是消化酶中很重要的一類酶，幾乎在所有的生物中都存在，其在生物不同組織、不同發(fā)育時期的表達量也有差異，當有外源有毒物質(zhì)進入生物體后，可被誘導增強活性，從而增強對外源有毒物質(zhì)的代謝能力而保護自身體機[14]。在該試驗中，中腸酯酶在4 h時活性受到抑制，抑制率為41.97%，蟲體靠蛋白質(zhì)、海藻糖等提供能量，與蛋白質(zhì)、海藻糖酶的變化一致。本試驗中，桃蚜中腸酯酶活性在經(jīng)大蒜精油LC50濃度處理8 h后，其酶活性不斷升高，在24 h酶比活力增強率達95.97%，說明大蒜精油對桃蚜有較強的生物活性，已誘導激發(fā)供試昆蟲的解毒酶活性。

目前，關于昆蟲酯酶與昆蟲抗藥性的研究越來越多，并已深入到分子水平。一般認為是編碼酯酶基因的過量表達使酯酶解毒酶量增加或活性提高，從而使對殺蟲藥劑產(chǎn)生抗藥性，在棉鈴蟲細胞色素P450方面已經(jīng)有相關研究報道[15]。當然，大蒜精油誘導編碼桃蚜中腸酯酶基因的表達增加導致解毒能力增強等，從分子水平明確其機理仍需深入研究。

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(責任編輯： 孫小嵐)

Effects of Garlic Essential Oil on Biological Activity, Physiology and Biochemistry ofMyzwspersicae

ZHANG Qiang1, LIANG Weibo2, DU Xueyong2, FA Yanhai2, WANG Xuegui2*

(1.YanjiangAgricultureTechnologyandPopularizingCenter,Ziyang,Sichuan641300; 2.LaboroatoryofPollution-freePesticide,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu,Sichuan611130,China)

The effects of garlic essential oil on contact toxicity, protein content, acetylcholinesterase activity, midgut esterase activity and trehalase activity ofM.persicaewere determined to study the effects of garlic essential oil on insecticidal activity, physiology and biochemistry ofM.persicaand to obtain botanical pesticides with easily degradable and pollution-free in environment. Results; Garlic essential oil has the strong toxic effect onM.persicae. LC50value of the contact toxicity after 72 h is 77.03 mg/mL. Garlic essential oil can increase midgut esterase activity, decompose mycose continuously, inhibit protein synthesis gradually and destroy the energy metabolism system greatly inM.persicae, which results in death ofM.persicaebecause of the imbalance between energy supply and demand inM.persicae. In conclusion, garlic essential oil can be used as the biological insecticide to controlM.persicaeeffectively.

garlic essential oil;Myzwspersicae; contact toxicity; physiology and biochemistry, enzyme activity

2015-07-20； 2016-01-09修回

中央高校特別資助項目“大蒜精油對大棚蔬菜蚜蟲防控效果及機理研究”(2011JS080)

張 強(1984-)，男，助理農(nóng)藝師，從事農(nóng)技推廣工作。E-mail: 306233332@qq.com

*通訊作者:王學貴(1976-)，男，副教授，從事農(nóng)藥學的教學與科研工作。E-mail:25202310@qq.com

1001-3601(2016)01-0019-0068-04

S433.3

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