甜茶總多酚的純化及其抗氧化活性

滕昭玉， 崔紫姣 ， 杜 瑩， 鮑晨陽(yáng) ， 廖莉玲

(貴州師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550001)

甜茶總多酚的純化及其抗氧化活性

滕昭玉， 崔紫姣 ， 杜 瑩， 鮑晨陽(yáng) ， 廖莉玲*

(貴州師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550001)

為提高甜茶的綜合利用價(jià)值，從提取甜茶甙廢液中回收甜茶多酚并采用大孔樹脂純化的方法研究甜茶總多酚的純化工藝條件；采用紫外分光光度法對(duì)甜茶多酚含量及其抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明:所篩選的HPD826樹脂為甜茶總多酚純化的最佳樹脂;當(dāng)上樣液的濃度為3.65 mg/mL、上柱液體積為50 mL、流速為1BV/h時(shí)，吸附率為94.25%，用30%的乙醇解吸后其甜茶總多酚的純度可達(dá)56.68%；純化過的甜茶總多酚對(duì)·OH和DPPH·自由基均有較好的清除作用，其IC50值分別為517.9 μg/mL和45.9 μg/mL。

甜茶； 總多酚； 純化工藝； 大孔吸附樹脂； 自由基清除活性

薔薇科甜茶(RubusSuavissmusS.Lee)又名甜葉懸鉤子，生長(zhǎng)于貴州、廣西等地[1]。甜茶作為民間傳統(tǒng)的茶飲料，具有無糖自然甜的作用，經(jīng)常飲用不僅可以起到滋肝補(bǔ)腎、生津潤(rùn)肺、止咳化痰和利咽的功效，還有提高人體免疫力、防治冠心病以及抗衰老等功效[1]。甜茶作為天然的藥食兼用植物，甜茶甙、甜茶多酚、甜茶黃酮是甜茶的主要活性成分，多酚類物質(zhì)主要包括黃烷醇類(兒茶素類)、花黃素類、花色素類和酚酸類[2]。目前，對(duì)甜茶活性成分的提取及其產(chǎn)品的開發(fā)主要集中在甜茶甙，而對(duì)于含量較多的甜茶多酚和總黃酮的研究相對(duì)較少，尤其是提取甜茶甙廢液中含有的較多的甜茶多酚未得到有效利用，造成了資源浪費(fèi)。眾多研究表明[2-6]，甜茶的藥用價(jià)值與其高含量的多酚類物質(zhì)密切相關(guān)，甜茶多酚具有抗炎、抗過敏的能力等，因此對(duì)甜茶多酚的深入研究具有重要意義。目前對(duì)于甜茶多酚的提取、純化大多以甜茶葉為原料[7-8]，而從提取甜茶甙的廢液中回收甜茶多酚以及純化前后甜茶多酚的抗氧化活性對(duì)比研究卻鮮見報(bào)道。因此，筆者從現(xiàn)有生產(chǎn)甜茶甙工藝的廢液中回收甜茶多酚并利用大孔樹脂對(duì)其純化，測(cè)定其自由基清除能力，以期為甜茶多酚進(jìn)一步研究開發(fā)以及提高甜茶的綜合利用價(jià)值提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料與試劑：甜茶葉(購(gòu)于貴州省健康茶科技有限公司)，二苯基苦味?；诫?DPPH，東京化成株式會(huì)社)，其余試劑均為分析純。大孔吸附樹脂SA-2(購(gòu)于天津歐瑞生物科技有限公司)，吸附樹脂HPD600、HPD826、聚酰胺、D-101、AB-8(購(gòu)于滄州寶恩吸附材料科技有限公司)。

儀器：FZ102型微型植物粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)，SHA-B水浴恒溫振蕩器(金壇市富華儀器有限公司)，UV2300紫外可見分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 甜茶總多酚的提取及其含量測(cè)定

1.2.1 甜茶總多酚的提取 參照文獻(xiàn)[9]報(bào)道的方法進(jìn)行甜茶總多酚的提取和含量測(cè)定。

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的甜茶葉粉末(過40目篩)于圓底燒瓶中，按料液比為1∶10加入水，加熱回流提取2次，每次1 h，合并提取液，過D101大孔樹脂，大孔樹脂用75%乙醇洗脫用于甜茶甙的提取，過柱液經(jīng)適當(dāng)濃縮得到甜茶多酚樣液。

1.2.2 多酚含量的測(cè)定 采用Folin-Ciocalteu法，以沒食子酸為基準(zhǔn)物質(zhì)，在770 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，得到?jīng)]食子酸吸光度與質(zhì)量濃度之間的回歸方程為A=0.125 6 C-0.056 5(R2=0.998 1)。

通過在770 nm處測(cè)定供試溶液的吸光度(A)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中算出供試溶液中總多酚的濃度，即可計(jì)算供試溶液中總多酚的含量。

1.3 大孔樹脂純化甜茶總多酚的性能

1.3.1 樹脂的預(yù)處理 稱取一定量的大孔樹脂，用水沖洗至洗滌水澄清透明、無懸浮雜質(zhì)，將樹脂用無水乙醇浸泡24 h，水洗后分別用4%的酸堿溶液浸泡2 h，水洗至中性，用水浸泡備用。

1.3.2 靜態(tài)吸附和解吸 準(zhǔn)確稱取預(yù)處理過的樹脂2.00 g(記為W)于250 mL的錐形瓶中，加入100 mL液(記為V1)濃度為3.18 mg/mL(記為C0)的甜茶多酚樣液，密封后置于恒溫振蕩器中，24 h后取上清液，測(cè)量甜茶多酚濃度(記為C1)。

分離并用水洗滌上述吸附飽和的樹脂后置于250 mL的錐形瓶中，加入無水乙醇100 mL(記為V2)，密封后置于振蕩器中，24 h后取上清液，測(cè)量甜茶多酚濃度(記為C2)。

根據(jù)下式計(jì)算吸附率(%)、吸附量(mg/g)、解吸率(%)：

吸附率=[(C0-C1)/C0]×100%

吸附量=[(C0-C1)×V1] /W

解吸率={C2V2/[(C0-C1)×V1]}×100%

1.3.3 HPD826樹脂的動(dòng)態(tài)吸附和解吸 將預(yù)處理過的樹脂通過濕法裝柱的方式裝入1.5 cm×40 cm的層析柱中，樹脂體積為30 cm3。

1) 上樣液濃度對(duì)HPD826樹脂吸附的影響。分別取3份質(zhì)量濃度為2.80 mg/mL、3.65 mg/mL、4.24 mg/mL的甜茶多酚樣液150 mL，以1 BV/h流速上柱，每10 mL收集一次流出液，分別測(cè)定流出液總多酚含量，以流出液甜茶多酚的質(zhì)量濃度對(duì)流出液管數(shù)作圖，繪制穿透曲線；合并流出液測(cè)定總多酚的含量并計(jì)算吸附的甜茶總多酚質(zhì)量及吸附率。

2) 洗脫劑對(duì)HPD826樹脂解吸的影響。分別取5份質(zhì)量濃度分別為3.65 mg/mL的甜茶多酚樣液150 mL，以1 BV/h流速上柱，將吸附飽和的樹脂用水沖洗至流出液無色，分別用10%、30%、50%、70%和90%乙醇150 mL洗脫，流速為1 BV/h，測(cè)定洗脫液中總多酚的含量計(jì)算解吸率。

將流出液旋干，準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量(W1)的旋干后的固體粉末溶于一定量(V3)的水中，測(cè)其濃度(C3)，根據(jù)下式計(jì)算經(jīng)樹脂純化后的甜茶總多酚的純度(%)：

純度=(C3V3/W1)×100%

1.4 抗氧化活性試驗(yàn)

以維生素C為參照，以甜茶多酚樣液濃縮干燥所得樣品為甜茶粗多酚(純度為23.17%)，經(jīng)大孔樹脂純化后所得樣品為甜茶精多酚(純度為56.68%)，分別測(cè)定各樣品對(duì)·OH和DPPH·自由基的清除能力。以樣品濃度為橫坐標(biāo)，以清除率為縱坐標(biāo)，計(jì)算清除率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的樣品濃度(IC50)，樣品的自由基清除活性以半數(shù)清除濃度(IC50)表示。

1.4.1 清除·OH能力 利用H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生·OH，在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉·OH并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm下有最大吸收[10]。

參照文獻(xiàn)[11]的方法并略作修改。在10 mL的具塞比色管中依次加入1 mL不同濃度的樣品(甜茶粗多酚、甜茶精多酚和維生素C)、7.5 mmol/L硫酸亞鐵銨 0.85 mL、7.5 mmol/L水楊酸-乙醇0.85 mL和0.3%的H2O20.85 mL，用蒸餾水定容至10 mL。將比色管置于37℃的恒溫水浴中反應(yīng)30 min，以蒸餾水為參比，在510 nm處測(cè)量不同濃度樣品各反應(yīng)體系溶液的吸光度(Ai)。未加樣品的空白管所測(cè)的吸光度為A0。未加0.3%的H2O2溶液的參比管所測(cè)的吸光度為Aj，·OH清除率的計(jì)算公式為：

·OH清除率=[(A0-Ai+Aj)/ A0]×100%

1.4.2 清除DPPH·自由基能力 參照文獻(xiàn)[12]的方法并略作改動(dòng)。準(zhǔn)確移取0.2 mg/mL DPPH·無水乙醇溶液1.6 mL和1 mL不同濃度的樣品液(甜茶粗多酚、甜茶精多酚和維生素C)于10 mL具塞比色管中，用無水乙醇定容至10 mL并搖勻，避光放置30 min，用無水乙醇做參比在517 nm處測(cè)定吸光度(Ai)。將1.6 mL的0.2 mg/mL DPPH·無水乙醇溶液于10 mL具塞比色管中，并用無水乙醇定容至10 mL，置于暗處30 min，測(cè)其在517 nm處的吸光度(A0)。取1 mL不同濃度的樣品液，用無水乙醇定容至10 mL，搖勻后暗處?kù)o置30 min，以無水乙醇為參比，測(cè)其在517 nm處的吸光度為(Aj)。DPPH·清除率的計(jì)算公式為：

DPPH·清除率=[(A0-Ai+ Aj)/ A0]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同大孔樹脂的靜態(tài)吸附和解吸效果

從表1看出，由于樹脂的類型不同，樹脂對(duì)甜茶總多酚的吸附程度亦不同。從吸附率看，聚酰胺最大，但是其解吸較困難，綜合考慮吸附率和解吸率等指標(biāo)，優(yōu)選HPD826樹脂作為甜茶總多酚純化的樹脂，進(jìn)一步做動(dòng)態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)。

表1 6種大孔樹脂的靜態(tài)吸附-解吸效果

Table 1 Static adsorption and desorption ratesof total polyphenols on macroporous resin

編號(hào)No．樹脂類型 Resin type 吸附量/(mg/g)Adsorptioncapacity吸附率/%Adsorptionrate解吸率/%Desorptionrate1SA?218．011．499．62HPD60020．512．999．33HPD82631．519．874．74聚酰胺60．037．629．75D10115．09．499．46AB?814．08．899．7

2.2 HPD 826樹脂動(dòng)態(tài)吸附和解吸

2.2.1 上樣濃度的考察 由圖1可知，在一定的流速條件下，用不同濃度的甜茶總多酚過柱，當(dāng)流出液的體積相同時(shí)，上樣液的濃度越大，流出液中多酚的濃度增加越明顯，即隨著樣品液濃度的增加，流出液中多酚的含量增加，樣品液的利用率降低。流出液中甜茶總多酚的質(zhì)量濃度達(dá)到上樣液的10%時(shí)，即認(rèn)為樹脂已飽和，發(fā)生穿透，當(dāng)用2.80 mg/mL、3.65 mg/mL和4.24 mg/mL的甜茶總多酚樣液過柱時(shí)，達(dá)到飽和所對(duì)應(yīng)的上柱液體積分別為60 mL、50 mL和40 mL；在此條件下，樹脂所吸附的甜茶總多酚的質(zhì)量分別為159.51 mg、172.01 mg和159.60 mg，所對(duì)應(yīng)的吸附率分別為94.95%、94.25%和94.10%。因此，試驗(yàn)選擇上樣液濃度為3.65 mg/mL。

圖1 不同濃度甜茶總多酚的穿透曲線

2.2.2 洗脫劑濃度的考察 由圖2可知，10%的乙醇解吸率最小，當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)大于30%，解吸率無顯著差異，因此選擇30%乙醇作為解吸劑。將30%乙醇解吸液濃縮干燥后，測(cè)定其純度約為56.68%，較純化前的純度(23.17%)提高33.51%。

圖2 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)的解吸率

2.3 甜茶多酚的抗氧化活性

2.3.1 對(duì)·OH的清除效果 由圖3A可見，隨著不同樣品濃度的增加，其對(duì)·OH自由基清除能力均增加，在相同濃度下，甜茶精多酚對(duì)·OH自由基的清除能力最強(qiáng)。甜茶粗多酚、甜茶精多酚以及維生素C對(duì)·OH自由基的IC50分別為1 234.7 μg/mL、517.9 μg/mL和694.7 μg/mL。表明，甜茶精多酚對(duì)·OH自由基具有較強(qiáng)的清除能力。

圖3 不同樣品對(duì)·OH和DPPH·自由基的清除率

Fig.3 ·OH and DPPH· scavenging rate of different samples

2.3.2 對(duì)DPPH·的清除效果 由圖3B可知，在一定范圍內(nèi)甜茶多酚對(duì)DPPH·自由基的清除率隨濃度的增加而增加，甜茶粗多酚、甜茶精多酚以及維生素C對(duì)DPPH·自由基清除能力的順序?yàn)樘鸩杈喾?甜茶粗多酚>維生素C，其IC50值分別為45.9 μg/mL、68.9 μg/mL和89.5 μg/mL，表明純化后的甜茶精多酚具有較強(qiáng)的清除DPPH·自由基的能力。

3 結(jié)論與討論

1) 在相同條件下以吸附率和解吸率為指標(biāo)，研究大孔吸附樹脂對(duì)甜茶總多酚的靜態(tài)吸附、解吸性能，其中HPD826樹脂的吸附率(19.8%)和解吸率(74.7%)較好。因此，選擇HPD826作為甜茶總多酚純化的最佳樹脂。

2) 用HPD826樹脂對(duì)甜茶總多酚樣液進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附、解吸并探究洗脫劑的濃度對(duì)解析性能的影響，結(jié)果表明，當(dāng)上樣液濃度為3.65 mg/mL、上柱體積為50 mL、流速為1 BV/h時(shí)，其吸附率為94.25%；用30%的乙醇洗脫后，其純度可達(dá)56.68%。

3) 利用甜茶粗多酚、甜茶精多酚和維生素C進(jìn)行體外自由基清除活性的對(duì)比，結(jié)果表明，甜茶精多酚對(duì)·OH和DPPH·自由基具有更好的清除效果，其IC50值分別為517.9 μg/mL和45.9 μg/mL。

通過HPD826大孔樹脂可以有效的回收甜茶甙廢液中的甜茶多酚，所得到的甜茶多酚具有較好的體外抗氧化作用，對(duì)于甜茶多酚的進(jìn)一步純化分離以及體內(nèi)的抗氧化活性有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯： 孫小嵐)

Purification and Antioxidant Activity of Total Polyphenols from Sweet Tea

TENG Zhaoyu， CUI Zijiao， DU Ying， BAO Chenyang， LIAO Liling*

(SchoolofChemistryandMaterialScience，GuizhouNormalUniversity，Guiyang，Guizhou550001，China)

In order to improve the comprehensive utilization of sweet tea, total polyphenol of sweet tea from which rubusoside liquid was extracted and the purification process conditions of total polyphenol from sweet tea were studied by macroporous resins purification method. The concentration of total polyphenol and its antioxidant activity was evaluated by ultraviolet spectrophotometry. The results showed that the resin of HPD826 was optimum for purification of total polyphenols from sweet tea, and when sample concentration was 3.65 mg/mL, volume was 50 mL, sample flow rate was 1BV/h, adsorption rate was up to 94.25%, and the purity of total polyphenols was up to 56.68% by using 30% ethanol as eluent, purified the total polyphenol of sweet tea had better scavenging effect on ·OH and DPPH·, the determined IC50values were 517.9 μg/mL and 45.9 μg/mL respectively.

sweet tea; total polyphenols; purification process; macroporous adsorption resin; radical scavenging activity

2015-07-16； 2015-12-26修回

貴州省科學(xué)技術(shù)廳中藥現(xiàn)代化攻關(guān)項(xiàng)目“甜茶多酚、黃酮的提取工藝研究”[黔科合ZY字(2012)3012]；貴陽(yáng)市科技局現(xiàn)代藥業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目“甜茶、明日葉多酚、黃酮的提取及應(yīng)用研究”[筑科合同(2012204)]

滕昭玉(1988-)，男，在讀碩士，研究方向：分析化學(xué)。E-mail：tengzhaoyu0922@126.com

*通訊作者:廖莉玲(1963-)，女，教授，從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。E-mail：lll6383@163.com

1001-3601(2016)01-0011-0036-04

TS201.2

A