馬齒莧多糖對(duì)宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究

丁　虹，唐雯靜，龐燕芬，呂　雯

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·論著·

馬齒莧多糖對(duì)宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究

丁虹1，唐雯靜1，龐燕芬1，呂雯2

[摘要]目的研究馬齒莧多糖對(duì)宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制作用。方法選擇c57小鼠并建立宮頸癌荷瘤鼠模型，隨機(jī)分為對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組4組，分別接受等滲鹽水、100、200、400 mg/kg馬齒莧多糖腹腔注射。治療后檢測(cè)移植瘤的體積、重量以及移植瘤中細(xì)胞凋亡數(shù)目、ATP含量、新生血管分子的表達(dá)量。結(jié)果低劑量組、中劑量組和高劑量組的瘤體體積和重量、移植瘤組織中的ATP含量以及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、CD13、CD34的表達(dá)量均低于對(duì)照組，凋亡細(xì)胞數(shù)目多于對(duì)照組。馬齒莧多糖能夠以劑量依賴性的方式降低移植瘤的體積、重量以及移植瘤中細(xì)胞凋亡數(shù)目、ATP含量、新生血管血管分子的表達(dá)量，增加凋亡細(xì)胞的數(shù)目。結(jié)論馬齒莧多糖能夠抑制宮頸癌移植瘤的生長、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、干擾氧化供能、減少新生血管數(shù)目，對(duì)宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為具有抑制作用。

[關(guān)鍵詞]宮頸癌；馬齒莧多糖；凋亡；血管新生；三磷酸腺苷

作者單位：1. 310002浙江杭州，南京軍區(qū)杭州療養(yǎng)院海勤療養(yǎng)區(qū)婦科；2. 310013浙江杭州，浙江省立同德醫(yī)院婦產(chǎn)科

引用格式：丁虹，唐雯靜，龐燕芬,等.馬齒莧多糖對(duì)宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].東南國防醫(yī)藥，2016,18(1):38-40，58.

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，HPV感染是宮頸癌及癌前病變的重要危險(xiǎn)因素[1-2]。近年來， HPV感染率和宮頸癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[3]。手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后放化療的綜合治療方式是臨床治療宮頸癌的主要方式，能夠有效清除病灶并殺滅殘留癌細(xì)胞，進(jìn)而最大限度地預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)?；熓切g(shù)后綜合治療的重要組成部分，能夠殺滅癌細(xì)胞，同時(shí)也會(huì)損傷正常組織，增加化療藥物劑量雖然能夠增強(qiáng)對(duì)癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)、但也會(huì)引起機(jī)體無法耐受的化療損傷并影響化療效果。近年來，天然植物中多糖成分的抗腫瘤活性受到了越來越多的重視，馬齒莧多糖作為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑亦具有殺滅癌細(xì)胞的作用[4]。在本研究中，我們探討了馬齒莧多糖對(duì)宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料c57小鼠32只由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滬)2015-0107]，均為雌性、周齡4～6周、體重18～25 g。馬齒莧多糖由浙江省立同德醫(yī)院藥劑科提取和分離，TUNEL試劑盒購自Roche公司，ATP檢測(cè)試劑盒和蛋白濃度BCA測(cè)定試劑盒購自碧云天公司，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、CD13、CD34以及β-actin單克隆抗體購自Abcam公司；熒光顯微鏡為Nikon公司產(chǎn)品，電化學(xué)顯影儀為天能公司產(chǎn)品。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1宮頸癌荷瘤鼠模型的制作方法取SiHa細(xì)胞株(購自中科院上海分院)，常規(guī)復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代后得到對(duì)數(shù)期生長細(xì)胞，用培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度稀釋至1×107/ml，取細(xì)胞懸液100 μL注射入小鼠背部的皮下組織。待腫瘤生長、瘤體形成后，用影像學(xué)檢查測(cè)定瘤體體積，篩選瘤體直徑1.2～1.6 cm的小鼠作為宮頸癌荷瘤鼠模型。

1.2.2動(dòng)物分組及藥物治療方法宮頸癌荷瘤鼠模型制作成功后，將模型小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組4組，每組8只,分別接受等滲鹽水、100、200、400 mg/kg馬齒莧多糖腹腔注射，每日給藥1次，連續(xù)治療12 d。

1.2.3瘤體體積及重量處死小鼠后，分離皮下腫瘤組織，測(cè)定瘤體的體積和重量。

1.2.4瘤體內(nèi)細(xì)胞凋亡情況取移植瘤組織充分研磨，用TUNEL試劑盒檢測(cè)瘤體內(nèi)細(xì)胞凋亡情況，分別用TUNEL試劑和DAPI試劑對(duì)凋亡細(xì)胞以及細(xì)胞核染色，然后在熒光顯微鏡下觀察4～6個(gè)隨機(jī)視野內(nèi)的200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算凋亡細(xì)胞的數(shù)目。

1.2.5腫瘤組織ATP生成能量取移植瘤組織充分研磨，參照試劑盒說明書檢測(cè)ATP含量。同時(shí)，用BCA試劑盒計(jì)算待測(cè)樣本中的蛋白總含量，以總蛋白含量為內(nèi)參照計(jì)算每mg蛋白內(nèi)ATP的含量。

1.2.6免疫印跡檢測(cè)取移植瘤標(biāo)本，加入RIPA蛋白裂解液后勻漿、離心后取上層蛋白樣本，加入上樣緩沖液后于100 ℃高溫變性10 min。取變性后的蛋白標(biāo)本適量，加入預(yù)先配置好的SDS-PAGE凝膠中，依次進(jìn)行垂直電泳、電轉(zhuǎn)膜、抗原位點(diǎn)封閉、第一抗體孵育、第二抗體孵育以及電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence, ECL)顯影。孵育的抗體包括VEGF、CD13、CD34以及β-actin。得到蛋白條帶后計(jì)算灰度值，以β-actin為內(nèi)參照對(duì)蛋白含量進(jìn)行半定量分析。

2結(jié)果

2.1瘤體體積及重量低劑量組、中劑量組和高劑量組的瘤體體積及重量均低于對(duì)照組。馬齒莧多糖能夠以劑量依賴性方式降低瘤體體積及重量，高劑量組的瘤體體積及重量均低于低劑量組、中劑量組，中劑量組的瘤體體積及重量均于低劑量組。見表1(P均<0.05)。

±s)

2.2瘤體內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)目低、中和高劑量組腫瘤組織中的瘤體內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)目均高于對(duì)照組。馬齒莧多糖能夠以劑量依賴性的方式增加瘤體內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)目，高劑量組腫瘤組織中的瘤體內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)目均高于低劑量組、中劑量組，中劑量組腫瘤組織中的瘤體內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)目均高于低劑量組。見表2。

±s)

2.3血管新生分子的蛋白含量低劑量組、中劑量組和高劑量組腫瘤組織中的VEGF、CD13、CD34的蛋白含量低于對(duì)照組，馬齒莧多糖能夠以劑量依賴性的方式降低腫瘤組織中的VEGF、CD13、CD34蛋白含量，高劑量組腫瘤組織中的VEGF、CD13、CD34的蛋白含量低于低劑量組、中劑量組，中劑量組腫瘤組織中的VEGF、CD13、CD34的蛋白含量均于低劑量組。見表3。

2.4ATP含量低劑量組、中劑量組和高劑量組腫瘤組織中的ATP含量均低于對(duì)照組,馬齒莧多糖能夠以劑量依賴性的方式降低腫瘤組織中的ATP含量，高劑量組腫瘤組織中的ATP含量均低于低劑量組、中劑量組，中劑量組腫瘤組織中的ATP含量均低于低劑量組。見表4。

表3　四組小鼠腫瘤組織中血管新生分子的

±s)

3討論

化療是宮頸癌綜合治療方案的重要組成部分，化療藥物的毒副作用較強(qiáng)，雖然能夠有效殺傷腫瘤細(xì)胞，但也會(huì)對(duì)正常組織造成較為嚴(yán)重的損傷。在臨床實(shí)踐中，使用化療藥物治療宮頸癌時(shí)，提高化療藥物劑量、增加不同作用機(jī)制的化療藥物種類能夠增強(qiáng)化療藥物對(duì)癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，但同時(shí)也加重正常組織的損傷，若患者無法耐受，會(huì)影響化療效果[5]。近年來，許多研究報(bào)道從多種植物中提取的多糖類物質(zhì)具有抗腫瘤活性。植物多糖一般不通過直接殺傷腫瘤細(xì)胞來發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，而是作為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑來增強(qiáng)體內(nèi)的免疫應(yīng)答和凋亡途徑、氧化呼吸功能途徑等來殺傷癌細(xì)胞[6]。因此，植物多糖對(duì)正常組織的損傷較小，篩選具有宮頸癌細(xì)胞殺傷效應(yīng)的植物多糖并與常規(guī)化療藥物聯(lián)合應(yīng)用能夠改善宮頸癌的治療效果。

馬齒莧是我國資源儲(chǔ)備極為豐富的一類藥食兩用植物，其主要功效為清熱解毒、涼血消腫，對(duì)于腹瀉、痢疾、感染等疾病具有治療作用[7]。馬齒莧所包含的有效化學(xué)成分包括多糖、黃酮類、萜類、生物堿以及香豆素類等。該植物的粗提物具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多種活性，進(jìn)一步的分離純化發(fā)現(xiàn)，馬齒莧中的多糖成分具有抗腫瘤效應(yīng)。趙蕊等[8-9]的研究顯示，馬齒莧多糖能夠增強(qiáng)宮頸癌荷瘤鼠的免疫功能、降低腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而使荷瘤鼠的腫瘤體積明顯縮小。該研究提示馬齒莧多糖具有抗腫瘤活性，能夠有效抑制宮頸癌移植瘤的生長。

目前關(guān)于馬齒莧多糖抗腫瘤效應(yīng)的研究報(bào)道較少，為了進(jìn)一步明確馬齒莧多糖對(duì)宮頸癌的殺傷和抑制效應(yīng)及生物學(xué)機(jī)制，我們建立了宮頸癌荷瘤鼠模型，通過腹腔注射不同濃度馬齒莧多糖進(jìn)行治療。我們對(duì)移植瘤的生長情況進(jìn)行了初步分析，對(duì)腫瘤體積的測(cè)量結(jié)果可知，馬齒莧多糖能夠以劑量依賴性的方式降低瘤體體積及重量，馬齒莧多糖的濃度越高，瘤體的體積和重量越低。這部分結(jié)果與趙蕊等[8-9]的研究結(jié)果相吻合，說明馬齒莧多糖能夠抑制宮頸癌移植瘤的生長。

在得到馬齒莧多糖抑制腫瘤生長的結(jié)果后，我們進(jìn)一步分析了腫瘤組織中癌細(xì)胞相關(guān)的惡性生物學(xué)行為。在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)生過程中，宮頸上皮的表型發(fā)生變化，多種抑癌基因失活、原癌基因激活、細(xì)胞周期蛋白和抗凋亡分子表達(dá)增加會(huì)使得宮頸上皮由正常表型向惡性增殖表型轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為極強(qiáng)的增殖能力和抗凋亡能力[10]?；熕幬锖椭参锒嗵前l(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的根本途徑就是通過不同機(jī)制來誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，馬齒莧多糖能夠以劑量依賴性的方式增加瘤體內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)目。說明馬齒莧多糖能夠誘導(dǎo)宮頸癌移植瘤組織中的癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

無限增殖是癌細(xì)胞基本的惡性生物學(xué)特征，細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變是癌細(xì)胞增殖的首要步驟，而后需要局部新生血管提供的營養(yǎng)物質(zhì)來進(jìn)行氧化供能[12]。細(xì)胞增殖是耗能的主動(dòng)過程，線粒體氧化呼吸過程能夠?yàn)樵撨^程提供所需的ATP，而局部新生血管形成則能為氧化呼吸過程提供必須的氧氣等原材料[13]。VEGF是促血管新生效應(yīng)最強(qiáng)的細(xì)胞因子、能夠反映腫瘤組織血管生成的能力。CD13和CD34是內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志分子，能夠反映腫瘤組織中血管生成的數(shù)目[14]。結(jié)果顯示，馬齒莧多糖能夠以劑量依賴性的方式降低腫瘤組織中VEGF、CD13和CD34表達(dá)量以及ATP含量。

綜上所述，馬齒莧多糖能夠抑制宮頸癌移植瘤的生長、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、干擾氧化供能、減少新生血管數(shù)目，對(duì)宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為具有一定的抑制作用。

【參考文獻(xiàn)】

[1]朱皓皞，于曉紅，杜麗英，等. 宮頸癌中激活蛋白1通路的活化及臨床意義[J]. 東南國防醫(yī)藥，2014,16(3):128-131.

[2]潘登華，何融泉，韋康來，等. 人乳頭狀病毒E6蛋白與宮頸癌關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2014,27(11):1229-1232.

[3]Ribeiro AA, Costa MC, Alves RR, et al. HPV infection and cervical neoplasia: associated risk factors[J].Infect Agent Cancer, 2015, 10:16.

[4]Tian JL, Liang X, Gao PY, et al. Two new alkaloids from portulaca oleracea and their cytotoxic activities[J].J Asian Nat Prod Res, 2014, 16(3):259-264.

[5]Takekuma M, Kuji S, Tanaka A, et al. Platinum sensitivity and non-cross-resistance of cisplatin analogue with cisplatin in recurrent cervical cancer[J].J Gynecol Oncol, 2015, 26(3):185-192.

[6]Chang WT, Lai TH, Chyan YJ, et al. Specific medicinal plant polysaccharides effectively enhance the potency of a DC-based vaccine against mouse mammary tumor metastasis[J].PLoS One, 2015, 10(3):e0122374.

[7]Zhao R, Gao X, Cai Y, et al. Antitumor activity of portulaca oleracea polysaccharides against cervical carcinoma in vitro and in vivo[J].Carbohydr Polym, 2013, 96(2):376-383.

[8]趙蕊，高旭，邵興月. 馬齒莧多糖對(duì)荷宮頸癌小鼠免疫刺激活性的研究[J]. 中國免疫學(xué)雜志，2014，30(10)：1344-1348.

[9]趙蕊，蔡亞平，陳志寶，等. 馬齒莧多糖對(duì)老齡荷瘤小鼠抗宮頸癌的作用[J]. 中國老年學(xué)雜志，2013，33(18)：4480-4482.

[10]Yang B, Lu Y, Zhang A, et al. Doxycycline induces apoptosis and inhibits proliferation and invasion of human cervical carcinoma stem cells[J].PLoS One, 2015, 10(6):e0129138.

[11]Jayaram S, Kapoor S, Dharmesh SM. Pectic polysaccharide from corn (Zea mays L.) effectively inhibited multi-step mediated cancer cell growth and metastasis[J].Chem Biol Interact, 2015, 25(235):63-75.

[12]Mello Pde A, Filippi-Chiela EC, Nascimento J, et al. Adenosine uptake is the major effector of extracellular ATP toxicity in human cervical cancer cells[J].Mol Biol Cell, 2014,25(19):2905-2918.

[13]Liu FW, Cripe J, Tewari KS.Anti-angiogenesis therapy in gynecologic malignancies[J].Oncology (Williston Park), 2015, 29(5):350-360.

[14]郭哲，史惠蓉. 宮頸癌組織中CD13與CD34的表達(dá)[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2012，47(4)：525-527.

(本文編輯：齊名；英文編輯：王建東)

Animal study on the inhibition effect of Portulaca oleracea polysaccharide on malignant behavior of cervical cancer cells

DINGHong1,TANGWen-jing1,PANGYan-fen1,LUWen2

.1.DepartmentofGynecology,NavalLogisticsBranchofHangzhouSanatorium,NanjingMilitrayCommand,Hangzhou,Zhejiang310002,China; 2.DepartmentofGynaecologyandObstetrics，TongdeHospitalofZhejiangProvince,Hangzhou,Zhejiang310013,China

[Abstract]ObjectiveTo study the inhibition effect of portulacaoleracea polysaccharide on malignant behavior of cervical cancer cells. Methodsc57 mice were selected and cervical cancer bearing mice model were established and randomly divided into control group, low dose group, middle dose group and high dose group, which received saline, 100 mg/kg polysaccharide, 200 mg/kg polysaccharide, 400 mg/kg polysaccharide injection respectively. After treatment, tumor volume, weight and apoptosis cell number, ATP content, neovascularization vascular molecules in tumor were detected. ResultsTumor volume, weight, ATP content and VEGF, CD13, CD34 expression level in tumor of low dose group, middle dose group and high dose group were lower than control group; portulacaoleracea polysaccharide reduced tumor volume, weight, ATP content and VEGF, CD13, CD34 expression level in tumor by a dose-dependent manner. ConclusionPortulacaoleracea polysaccharide can inhibit cancer tumor growth, increase cell apoptosis number, induce apoptosis, interfere oxidation energy, reduce new blood vessels number and inhibit malignant behavior of cervical cancer cells.

[Key words]cervical cancer; portulacaoleracea polysaccharide; apoptosis; angiogenesis; ATP

(收稿日期：2015-08-20；修回日期：2015-11-02)

[中圖分類號(hào)]R737.33;R285.5

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi：10.3969/j.issn.1672-271X.2016.01.011