應(yīng)用RNA-Seq技術(shù)篩選不同濃度葉酸培養(yǎng)的QSG-7701細(xì)胞中的差異表達(dá)基因

張銀玲，薛　賡，孫樹漢,張　毅

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·論著·

應(yīng)用RNA-Seq技術(shù)篩選不同濃度葉酸培養(yǎng)的QSG-7701細(xì)胞中的差異表達(dá)基因

張銀玲，薛賡，孫樹漢,張毅

[摘要]目的在驗(yàn)證不同濃度葉酸培養(yǎng)影響人正常肝細(xì)胞系增殖、周期和遷移能力的基礎(chǔ)上，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)技術(shù)篩選差異表達(dá)基因，為進(jìn)一步探討葉酸缺乏與基因差異表達(dá)以及正常肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化之間的相關(guān)性打下基礎(chǔ)。方法不同濃度葉酸培養(yǎng)(無(wú)葉酸組0 mg/L，正常葉酸組40 mg/L)的人正常肝細(xì)胞系QSG-7701 6個(gè)月，應(yīng)用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移；利用RNA-Seq技術(shù)對(duì)兩組細(xì)胞中的mRNA進(jìn)行檢測(cè)，篩選差異mRNA；通過(guò)用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)RNA-Seq的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，并結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物信息學(xué)方法分析差異mRNA。結(jié)果無(wú)葉酸培養(yǎng)顯著提高QSG-7701細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞由靜止期進(jìn)入分裂期，促進(jìn)細(xì)胞的遷移能力；RNA-Seq檢測(cè)得到含有16 774條差異mRNA的數(shù)據(jù)集，初步分析顯示其中391條差異mRNA可能與不同濃度葉酸培養(yǎng)相關(guān)，其中上調(diào)的115條，下調(diào)的276條；隨機(jī)對(duì)其中11條進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證，72.73%的結(jié)果與RNA-Seq一致；分析顯示，差異mRNA相對(duì)應(yīng)的基因與細(xì)胞周期等生理過(guò)程以及多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。結(jié)論最終篩選出參與葉酸調(diào)控正常肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因，RNA-Seq技術(shù)能有效地用于差異基因地篩選。

[關(guān)鍵詞]葉酸；QSG-7701細(xì)胞；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)；基因表達(dá)

作者單位：200433上海，第二軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室(張銀玲和薛賡為共同第一作者)

引用格式：張銀玲，薛賡，孫樹漢,等.應(yīng)用RNA-Seq技術(shù)篩選不同濃度葉酸培養(yǎng)的QSG-7701細(xì)胞中的差異表達(dá)基因[J].東南國(guó)防醫(yī)藥，2016,18(1):1-5，16.

葉酸(Folate，F(xiàn)A)是水溶性B族維生素，因在綠葉蔬菜中含量豐富而得名。葉酸參與了人體眾多重要物質(zhì)的合成和代謝，尤其是DNA的合成和甲基化修飾，然而人體自身只能合成少量葉酸，各種生理過(guò)程中所需要的葉酸主要由食物中攝取。近年來(lái)大量的流行病學(xué)調(diào)查資料及動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)皆表明，葉酸缺乏可與包括胰腺癌、食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌[1-4]等多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),研究顯示，在腫瘤發(fā)生的早期，葉酸通過(guò)調(diào)控DNA甲基化等表觀遺傳修飾進(jìn)而影響腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，但是究竟哪些基因能夠受葉酸調(diào)控，參與腫瘤的早期發(fā)生目前尚有待于研究。

為此我們選擇利用目前較為流行且比較成熟的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)技術(shù)對(duì)不同濃度葉酸培養(yǎng)的人正常肝細(xì)胞系QSG-7701中的差異表達(dá)基因進(jìn)行高通量檢測(cè)。RNA-Seq技術(shù)，是近年發(fā)展起來(lái)的利用深度測(cè)序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的技術(shù)[5]?；趇llumina HIS 2500高通量測(cè)序平臺(tái)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)能夠在單核苷酸水平上對(duì)任一物種特定器官或組織在任一狀態(tài)下的整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)，在分析轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)水平的同時(shí)，還能發(fā)現(xiàn)未知的低峰度的新轉(zhuǎn)錄本，精確識(shí)別可變剪切位點(diǎn)，非編碼區(qū)域功能研究等，提供全面的轉(zhuǎn)錄組信息。與傳統(tǒng)的表達(dá)譜芯片技術(shù)相比，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以對(duì)任意物種的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)，不需要預(yù)先針對(duì)已知序列設(shè)計(jì)探針，并且提供精確的數(shù)字化信號(hào)，更高的檢測(cè)通量以及更廣泛的檢測(cè)范圍，優(yōu)勢(shì)明顯。通過(guò)RNA-Seq檢測(cè)，我們對(duì)比、分析了不同濃度葉酸培養(yǎng)的QSG-7701細(xì)胞中的mRNA，發(fā)現(xiàn)了一系列的差異信號(hào)。在此基礎(chǔ)上結(jié)合常規(guī)檢測(cè)方法以及統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物信息學(xué)分析，為篩選參與葉酸調(diào)控正常肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程的相關(guān)基因打下了良好的基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料人正常肝細(xì)胞株QSG-7701購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2芯片來(lái)源及主要實(shí)驗(yàn)儀器RNA-Seq委托上海伯豪生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。測(cè)序所用Flow cell 為Illumina PE Flow Cell v3-HS。按照HiSeq 2500 User Guide準(zhǔn)備測(cè)序試劑，將攜有cluster 的flow cell 上機(jī)(儀器型號(hào)：HiSeq 2500，Illumina)。選用paired-end 程序，進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序過(guò)程由Illumina 提供的數(shù)據(jù)采集軟件進(jìn)行控制，進(jìn)行實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)分析。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)中設(shè)定的細(xì)胞葉酸培養(yǎng)濃度：無(wú)葉酸組為0 mg/L，正常葉酸組為40 mg/L；細(xì)胞開展RNA-Seq以及其他后續(xù)試驗(yàn)前須經(jīng)過(guò)6個(gè)月不同濃度葉酸培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。細(xì)胞培養(yǎng)使用不含葉酸的特殊DMEM培養(yǎng)基(D2429，Sigma-Aldrich)，使用前添加10%胎牛血清、584 μg/mL谷氨酸鈉，3.7 mg/mL的NaHCO3。

1.3.2細(xì)胞增殖能力檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種1×103個(gè)細(xì)胞，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后加入CCK-8試劑(CCK-8, Dojindo Molecular Technologies,Inc,Shanghai,China)，2 h后在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔的吸光度(吸收波長(zhǎng)為450 nm)。

1.3.3細(xì)胞凋亡水平檢測(cè)通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)合膜聯(lián)蛋白A5法檢測(cè)不同組細(xì)胞的凋亡水平。收取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，1000 rpm離心10 min，棄上清，加入預(yù)先配制好的膜聯(lián)蛋白A5結(jié)合緩沖液，制成終濃度為1×106cell/mL的細(xì)胞懸液，取100 μL的細(xì)胞懸液，向其中加入5 μL膜聯(lián)蛋白A5-FITC 結(jié)合物，再加入5 μL的PI溶液；室溫下避光15 min后再加入400 μL 膜聯(lián)蛋白A5結(jié)合緩沖液，在流式細(xì)胞儀上采集并分析。

1.3.4細(xì)胞遷移能力檢測(cè)收取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整終濃度為2×105cell/mL，將200 μL細(xì)胞懸液移入小室內(nèi)，小室放入24孔板，在小室外加入500 μL 含有10% 胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中孵育24 h，取出小室擦拭掉上室面細(xì)胞，甲醛固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜的細(xì)胞數(shù)，每組細(xì)胞重復(fù)3次，每次計(jì)數(shù)5個(gè)視野。

1.3.5細(xì)胞總RNA的抽提使用Trizol試劑(Invitrogen)抽提QSG-7701細(xì)胞的總RNA，所得總RNA經(jīng)NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)及Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, US)電泳質(zhì)檢合格后用于后續(xù)研究。

1.3.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR本研究使用SYBR Green 檢測(cè)法，以GAPDH為內(nèi)參照進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量 PCR。實(shí)驗(yàn)所用的實(shí)時(shí)定量 PCR 引物序列如表1所示。實(shí)時(shí)定量PCR 結(jié)果以Ct值的形式直觀的展現(xiàn)，所有樣本對(duì)目的基因和內(nèi)參照同時(shí)擴(kuò)增，每個(gè)樣本重復(fù)3次。

表1　本研究中所驗(yàn)證的mRNA實(shí)時(shí)定量引物序列

基因名引物序列退火溫度(℃)RTEL1上游:5'CAGGACTACAAGGGTTCCGATGA3'62下游:5'CAGACCTCCTCAAACTGCTTAT3'GAPDH上游:5'GGTCTCCTCTGACTTCAACA3'60下游:5'GTGAGGGTCTCTCTCTTCCT3'CCNG1上游:5'TAGTCTAACTCAGTTCTTTGGCTTTG3'58下游:5'ATGGGACATTCCTTTCCTCTTC3'SESN1上游:5'TCCACCATTTCGTGTCCAGG3'58下游:5'TAGTTCCAAATTGCCCGTCT3'GAMT上游:5'CCCACCCTGCCTGACGGTCACTTT3'62下游:5'GGGCACCTGCGTCTCCTCAAACAT3'TP53INP1上游:5'CACGGGCACAGAAGTGGAAG3'58下游:5'GGTGGCAATCCCTGGTAAGA3'CDC20上游:5'CGCCAGAGGGTTATCAGAACAGA3'60下游:5'TTCCCACTCCAATCCACAAGG3'CDC45上游:5'AGAAAGGAAGGCTGGGAACTAAG3'60下游:5'CACGTCCGAGGCCACGAAGA3'CDKN1A上游:5'TCCTGTGGGCGGATTAG3'58下游:5'CACTGTCTTGTACCCTTGTGC3'BTG2上游:5'GGCACTCACAGAGCACTACAAAC3'56下游:5'CCTCCTCGTACAAGACGCAGAT3'DHFR上游:5'AGACCTGGTTCTCCATTCCT3'56下游:5'GAACTGCCACCAACTATCCA3'

SYBR Green試劑購(gòu)自Takara公司(中國(guó)大連)，PCR條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)比較各組mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化。本研究采用2-ΔΔCt的相對(duì)定量法對(duì)實(shí)時(shí)定量 PCR 的結(jié)果進(jìn)行比較和分析。

1.3.7RNA-Seq檢測(cè)數(shù)據(jù)的處理①基因差異表達(dá)分析： 采用Fold-change(表達(dá)差異倍數(shù))以及Fisher精確檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)基因差異程度進(jìn)行篩選。數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)總體歸一化和對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后，篩選差異表達(dá)基因。篩選條件規(guī)定為 FDR控制在5%以內(nèi)，差異倍數(shù)不低于2.0。篩選出受葉酸調(diào)控明顯的差異表達(dá)基因。②GO 分析：首先把所有差異表達(dá)基因向Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)的各個(gè)term映射，計(jì)算每個(gè)term的基因數(shù)目，然后應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比，在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO條目，其計(jì)算公式為

其中，N為所有基因中具有GO注釋的基因數(shù)目；n為N中差異表達(dá)基因的數(shù)目；M為所有基因中注釋為某特定GO term的基因數(shù)目；m為注釋為某特定GO term的差異表達(dá)基因數(shù)目。計(jì)算得到的P值經(jīng)過(guò)Bonferroni校正之后，以校正的P值(FDR)≤0.05為閾值，滿足此條件的GO term定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO term。GO分析對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有提示作用，通過(guò)差異基因的GO分析可找到受不同濃度葉酸調(diào)控的基因可能與哪些基因的功能的改變有關(guān)。③ KEGG 分析：應(yīng)用GO富集原理同樣可以得出具有富集功能的KEGG途徑。通過(guò)KEGG分析可能會(huì)找到受不同濃度葉酸調(diào)控的差異基因與哪些細(xì)胞通路的改變有關(guān)。與GO分析不同，KEGG是蛋白質(zhì)之間的相互作用，KEGG的變化可能是由參與這條通路的蛋白的表達(dá)量或者是蛋白的活性的改變引起。

2結(jié)果

2.1葉酸缺乏影響人正常肝細(xì)胞的生理特征無(wú)葉酸培養(yǎng)的細(xì)胞CCK-8的吸收值(1.65±0.40)顯著高于正常葉酸培養(yǎng)的細(xì)胞(0.89±0.11，P<0.01,圖1A)。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)顯示，葉酸培養(yǎng)的細(xì)胞中處于靜止期的比例(G0/G1，0.80±0.01)顯著高于無(wú)葉酸培養(yǎng)的細(xì)胞(0.60±0.03，P<0.01，圖1B)。無(wú)葉酸培養(yǎng)的細(xì)胞的凋亡比例(5.23%±0.26%)顯著低于正常葉酸培養(yǎng)的細(xì)胞(11.32%±1.47%，P<0.01，圖1C)。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，24 h后，無(wú)葉酸培養(yǎng)的細(xì)胞穿過(guò)基底膜的數(shù)目(19.80±7.48)顯著多于正常葉酸培養(yǎng)的細(xì)胞(3.50±2.92，P<0.01，圖1D、E)。

與無(wú)葉酸組比較,*P<0.01圖1　葉酸缺乏對(duì)人正常肝細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期以及遷移能力的影響

2.1.1葉酸缺乏促進(jìn)細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞的凋亡無(wú)葉酸條件下培養(yǎng)的細(xì)胞的增殖能力顯著高于正常葉酸條件下培養(yǎng)的細(xì)胞(圖1A，P<0.01)；流式細(xì)胞檢測(cè)顯示，無(wú)葉酸條件下的細(xì)胞的凋亡水平顯著低于正常葉酸條件下培養(yǎng)的細(xì)胞(圖1C，P<0.01)。

2.1.2葉酸缺乏促進(jìn)細(xì)胞由靜止期向分裂期的轉(zhuǎn)化葉酸條件下的細(xì)胞中處于細(xì)胞周期靜止期的比例(G0/G1)顯著高于無(wú)葉酸條件下培養(yǎng)的細(xì)胞(圖1B，P<0.01)，處于分裂期的比例(G2/M)顯著低于無(wú)葉酸條件下培養(yǎng)的細(xì)胞(圖1B，P<0.01)。

2.1.3葉酸缺乏促進(jìn)細(xì)胞的遷移能力Transwell小室實(shí)驗(yàn)顯示，無(wú)葉酸條件下的細(xì)胞的遷移能力顯著高于正常葉酸條件下培養(yǎng)的細(xì)胞(圖1D、E，P<0.01)。

2.2RNA-Seq與實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的結(jié)果的一致性我們隨機(jī)選擇了11條RNA-Seq顯示在無(wú)葉酸條件下培養(yǎng)的細(xì)胞和正常葉酸條件下培養(yǎng)的細(xì)胞中存在顯著性差異的mRNA(圖2)，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)其檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。檢測(cè)顯示，11條差異mRNA中，8條存在差異且差異趨勢(shì)與RNA-Seq檢測(cè)結(jié)果一致，其余3條無(wú)差異，不存在差異趨勢(shì)與RNA-Seq相反的mRNA，一致率達(dá)到72.73%(圖3)。

圖2　11條差異mRNA的RNA-Seq檢測(cè)結(jié)果

圖3　11條差異mRNA的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果

2.3RNA-Seq篩選得到的差異mRNA的生物信息學(xué)分析RNA-Seq檢測(cè)總共得到含有16 774條差異mRNA的數(shù)據(jù)集，根據(jù)方法中所列的一系列判斷標(biāo)準(zhǔn)，最終篩選到與葉酸缺乏相關(guān)的差異mRNA共計(jì)391條，其中上調(diào)的基因共有115條，下調(diào)的共有276條。

根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)判斷，葉酸培養(yǎng)的人正常肝細(xì)胞QSG-7701中共有391個(gè)差異表達(dá)的mRNA，其中上調(diào)表達(dá)的基因共有115個(gè)，下調(diào)表達(dá)的共有276個(gè)基因。

圖4　差異mRNA的生物信息學(xué)分析

GO分析顯示差異mRNA所對(duì)應(yīng)的基因主要包括細(xì)胞周期蛋白類、細(xì)胞信號(hào)和傳遞蛋白、細(xì)胞受體、葉酸代謝相關(guān)的基因與酶類、原癌基因和抑癌基因、核苷酸代謝、RNA剪接及轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)、蛋白翻譯合成基因等等(圖4A)。KEGG分析差異mRNA所對(duì)應(yīng)的基因中受葉酸調(diào)控比較明顯的細(xì)胞信號(hào)通路主要是P53信號(hào)通路、細(xì)胞周期相關(guān)信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等等(圖4B)。以上的生物信息學(xué)分析為篩選下一步研究的代謝通路和相關(guān)基因奠定了基礎(chǔ)。通過(guò)GO分析展示結(jié)果，可看出受葉酸影響比較顯著的是細(xì)胞周期阻滯，其中上調(diào)表達(dá)基因?yàn)閙yc，下調(diào)表達(dá)的基因主要為CDKN1A、INHA、TP53INP1等；其次為磷酸化的負(fù)調(diào)控，相關(guān)下調(diào)表達(dá)基因主要為CDKN1A、INHA等；還有誘導(dǎo)凋亡相關(guān)下調(diào)基因INHA、ZMAT3、TP53INP1等。

3討論

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，我們進(jìn)一步明確了葉酸缺乏對(duì)人正常肝細(xì)胞系生理特征的影響，結(jié)果顯示葉酸缺乏顯著刺激了細(xì)胞的增殖、細(xì)胞由靜止期向分裂期的轉(zhuǎn)化以及細(xì)胞的遷移，抑制了細(xì)胞的凋亡，再一次證實(shí)了葉酸缺乏能夠?qū)е抡＜?xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。但是在這些增殖、凋亡和遷移能力改變的背后，葉酸究竟通過(guò)哪些基因影響了發(fā)揮作用，目前尚不明確。為此我們選用了目前較為流行的RNA-Seq技術(shù)來(lái)篩選可能的相關(guān)差異mRNA 。對(duì)于高通量的篩選處理相關(guān)的差異基因，傳統(tǒng)上多采用基因芯片技術(shù)，但是基因芯片技術(shù)只能檢測(cè)已知序列的信息，而本研究選擇的RNA-Seq技術(shù)可進(jìn)行全基因組水平的基因表達(dá)差異的研究，具有檢測(cè)范圍廣、可重復(fù)性高、分析更可靠等特點(diǎn)。除此之外，RNA-Seq技術(shù)還能發(fā)現(xiàn)新的未知轉(zhuǎn)錄本、剪接體、SNP等。其動(dòng)態(tài)范圍廣，與實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證結(jié)果符合率高，是目前深入研究轉(zhuǎn)錄組的強(qiáng)大工具。本研究通過(guò)傳統(tǒng)技術(shù)實(shí)時(shí)定量PCR隨機(jī)對(duì)部分RNA-Seq的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果證明RNA-Seq的可信度較高，重復(fù)性較好，適于高通量的篩選處理相關(guān)的差異基因。

本研究通過(guò)RNA-Seq技術(shù)篩選得到了391條差異表達(dá)的mRNA，并對(duì)其中11條進(jìn)行了驗(yàn)證，得到驗(yàn)證的8條mRNA所對(duì)應(yīng)的基因包括與腫瘤發(fā)生相關(guān)的原癌基因、抑癌基因、與細(xì)胞周期蛋白相關(guān)基因、腫瘤壞死因子受體超家族成員、生長(zhǎng)分化因子類、脂代謝相關(guān)基因相關(guān)(圖3)，提示葉酸缺乏與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。進(jìn)一步通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物信息學(xué)手段分析391條差異表達(dá)的mRNA，結(jié)果顯示部分差異mRNA與腫瘤的發(fā)生相關(guān)，如c-Myc、Ras等；部分差異mRNA與細(xì)胞周期相關(guān)，如Cdc20、Cdc45、RRM2等；部分差異mRNA與葉酸代謝通路相關(guān)，如FOLR1、GAMT、FPGS等。

生學(xué)信息學(xué)分析的結(jié)果提示我們，可以從葉酸代謝通路的相關(guān)基因出發(fā)，如葉酸受體FOLR1或葉酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶——葉酰多聚谷氨酸合成酶(FPGS)，探討葉酸缺乏如何通過(guò)影響葉酸代謝通路，進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)的一系列下游基因的變化，參與腫瘤的發(fā)生[6]。最新研究也發(fā)現(xiàn)，葉酸缺乏可以引起上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)的發(fā)生，EMT 不僅促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，也可以在腫瘤發(fā)生化療耐藥中發(fā)揮重要作用[7]，也可以從EMT的角度對(duì)葉酸參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制進(jìn)行研究。

葉酸的適時(shí)適量補(bǔ)充可能會(huì)抑制癌基因的激活，降低癌前病變的發(fā)生，對(duì)機(jī)體的健康發(fā)展起著重要作用。人體自身僅能合成少量的葉酸，其攝入不足或者代謝障礙均可引起機(jī)體多系統(tǒng)受損。機(jī)體正常組織葉酸的補(bǔ)充可以提供DNA合成和復(fù)制的原料，因此可以確保DNA合成的保真性，維持DNA的完整性和DNA的損傷修復(fù)，均可以減少機(jī)體正常組織的惡性轉(zhuǎn)變[8]。此外,葉酸提供S-腺苷甲硫氨酸甲基供體參與DNA中胞嘧啶的甲基化修飾[9]，葉酸攝入不足能夠?qū)е氯蚪M水平的DNA低甲基化和特定位點(diǎn)CPG島啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化[10-12]。因此，生物信息學(xué)的分析也提示可以通過(guò)探討葉酸缺乏對(duì)DNA甲基化的影響，揭示葉酸缺乏導(dǎo)致正常細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)制。

綜上所述，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)篩選目的基因提供了比傳統(tǒng)的芯片技術(shù)更為廣泛、更為可靠的信息。本研究結(jié)合RNA-Seq技術(shù)以及生物信息學(xué)分析所得到的一系列結(jié)果將有助于深入探討葉酸缺乏導(dǎo)致正常細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)制。

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(本文編輯：齊名；英文編輯：王建東)

Primry study of differential mRNA expression patterns of QSG-7701 cells treated with different doses of folic acid by RNA-Seq

ZHANGYin-ling,XUEGeng,SUNShu-han

,ZHANGYi.BasicMedicalDepartmentoftheSecondMilitaryMedicalUniversityMedicalGeneticsandResearchSection,Shanghai200433,China

[Abstract]ObjectiveTo study the differential mRNA expression patterns of QSG-7701 cells that treated with folic acid which affects cell proliferation, cell cycle, cell apoptosis and transwell in order to investigate the relationship of folic acid deficiency, differential gene expression and malignant transformation of human normal hepatocytes by RNA-Seq. MethodsHuman normal hepatocytes QSG-7701 were treated with folic acid (No folic acid group:0 mg/L, Normal folic acid group:40 mg/L) for 6 months. CCK-8, Flow cytometric and transwell were used to examine cell proliferation, cell cycle, cell apoptosis and cell migration. Real-time PCR was used to analyze and confirm RNA-Seq datas. The differential mRNA expression patterns was analyzed using bioinformatics and statistics. ResultsFolic acid deficiency promoted cell proliferation and cell migration. RNA-Seq results included 16 774 differential gene expression patterns and a total of 391 differential genes expressed in QSG-7701 cells were screened out, of which 115 were up regulated and 276 were down regulated and 11 genes were random selected to confirm by Real-time PCR. As a result, a percent of 72.73% genes were consisted with Real-time PCR. Analysis demonstrated that the abmormal gene had a close relationship with cell cycle, tumor inition and development. ConclusionGenes involved in normal cell malignant transformation can be effectively selected by RNA-Seq.

[Key words]folic acid; QSG 7701 cells; RNA-Seq; gene expression

(收稿日期：2015-09-12；修回日期：2015-10-21)

通訊作者：張毅，E-mail: yizhang@smmu.edu.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81272331)

[中圖分類號(hào)]R735.7

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi：10.3969/j.issn.1672-271X.2016.01.001