m iR-505-3p在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中抑制可變剪接因子以調(diào)控運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因可變剪接

楊侃，李曉寧，馬驍驍，李凱，周宇荀，肖君華，*

（1東華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，2東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620）

m iR-505-3p在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中抑制可變剪接因子以調(diào)控運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因可變剪接

楊侃1，李曉寧2，馬驍驍2，李凱2，周宇荀2，肖君華1，2*

（1東華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，2東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620）

目的探究微小RNA 505-3p（miR-505-3p）對(duì)于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因（survivalmotor neuron gene，SMN）可變剪接的影響。方法利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-505-3p靶基因，構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告載體，在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）中驗(yàn)證靶基因?yàn)榭勺兗艚右蜃樱╝lternative splicing factor，ASF）基因，運(yùn)用免疫印跡和免疫熒光染色驗(yàn)證miR-505-3p對(duì)ASF的抑制效果，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)miR-505-3p對(duì)具有正常功能的全長(zhǎng)SMN（SMN-FL）以及含有毒性的第7號(hào)外顯子缺失的SMN（SMN-D7）表達(dá)量的影響及ASF在其中的作用。結(jié)果miR-505-3p直接結(jié)合ASF3′端調(diào)控區(qū)并抑制ASF mRNA及蛋白表達(dá)量，抑制ASF蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)和分布。過表達(dá)miR-505-3p促進(jìn)SMN-FL向SMND7的轉(zhuǎn)化，而過表達(dá)靶基因ASF或者抑制miR-505-3p促進(jìn)SMN-FL的保留。結(jié)論ASF對(duì)SMN基因正常剪接形成SMNFL是必需的，miR-505-3p通過抑制ASF，從而干擾ASF對(duì)于SMN可變剪接的調(diào)控，導(dǎo)致正常的SMN-FL向毒性的SMN-D7轉(zhuǎn)化。

miR-505-3p；可變剪接因子；運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因；鼠胚胎成纖維細(xì)胞

微小RNA（miRNA）是一類短小而保守的非編碼RNA，通過靶向結(jié)合mRNA的3’非編碼區(qū)（3’UTR區(qū)），對(duì)靶基因?qū)嵭修D(zhuǎn)錄后及翻譯水平的抑制［1］。小鼠miR-505基因位于X染色體上（物理位置：60392403-60392492），其轉(zhuǎn)錄初級(jí)體（pri-505）長(zhǎng)90bp，前體（pre-505）長(zhǎng)56bp。miR-505-3p和miR-505-5p是由pre-505經(jīng)過剪切加工形成的成熟體。以往的報(bào)道表明，miR-505-3p是多種腫瘤形成和發(fā)展的指示基因：miR-505-3p能指示早期宮頸癌的發(fā)生［2］；是肉滑膜瘤局部復(fù)發(fā)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的指示分子［3］，并是乳腺癌的預(yù)后指示分子［4］。此外，miR-505-3p也是一種抑癌基因。miR-505-3p能促進(jìn)耐藥型乳腺癌細(xì)胞凋亡以抑制癌細(xì)胞增殖［5］，調(diào)控原癌基因非ATP酶26S亞基蛋白酶體10基因（PSMD10）的功能性轉(zhuǎn)錄本以降低胃癌發(fā)病率［6］，在白血病淋巴因子（LRF）的調(diào)控下抑制ASF以實(shí)現(xiàn)對(duì)MEF細(xì)胞增殖的抑制［7］。然而，目前對(duì)于miR-505-3p的研究局限于對(duì)其腫瘤相關(guān)功能的探索，miR-505-3p在其他領(lǐng)域的潛在功能需要進(jìn)一步解析。

脊髓性肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）是一類具有高致死率的隱性遺傳病，患者脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)生退行性病變，進(jìn)而引起肌萎縮。根據(jù)發(fā)病時(shí)間的不同分為嬰兒型、中間型和少年型［8］。SMA由運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因（survival motor neuron gene，SMN）突變引發(fā)的功能型運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因蛋白（SMN）缺失所致。SMN含有8個(gè)外顯子，編碼38kD的SMN蛋白。臨床分析表明，嬰兒型SMA與大片段SMN缺失相關(guān)，中間型和少年型SMA與SMN第7號(hào)外顯子缺失相關(guān)［9］。SMN在體內(nèi)有兩個(gè)拷貝，SMN1和SMN2。來源于SMN1的轉(zhuǎn)錄本在可變剪接因子（alternative splicing factor，ASF）和其他剪接因子的調(diào)控下形成包含全部8個(gè)外顯子的全長(zhǎng)蛋白SMN-FL。而來源自SMN2的轉(zhuǎn)錄本第7號(hào)外顯子第6位堿基發(fā)生點(diǎn)突變（C6T），ASF無法識(shí)別并結(jié)合來自SMN2的轉(zhuǎn)錄本，在其他剪接因子的調(diào)控下，SMN2經(jīng)剪接形成第7號(hào)外顯子缺失的毒性截?cái)嗟鞍譙MN-D7［10］。然而，通過microRNA對(duì)單一剪接因子進(jìn)行調(diào)控是否能影響SMN可變剪接尚不清楚。

本研究團(tuán)隊(duì)在前期工作中發(fā)現(xiàn)，miR-505-3p位于影響小鼠性發(fā)育啟動(dòng)的重要數(shù)量性狀座位（quantitative trait loci），對(duì)于小鼠生殖、發(fā)育等重要生理事件具有潛在的調(diào)控作用［11］。為進(jìn)一步解析miR-505-3p的生物學(xué)功能，利用Targetscan等miRNA數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)ASF為miR-505-3p的潛在靶基因之一。比對(duì)小鼠、人、駱駝、褐家鼠、原雞等物種的ASF非編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)，miR-505-3p的靶序列在物種間存在高度保守性。由靶序列的高度保守性可以推測(cè)，miR-505-3p對(duì)于ASF的靶向結(jié)合被進(jìn)化事件所保留下來，這種靶向結(jié)合存在于多個(gè)物種之中，ASF可能是miR-505-3p的天然靶基因。

本研究擬通過在原代培養(yǎng)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）中驗(yàn)證miR-505-3p的靶基因是否為ASF，探討miR-505-3p和潛在靶基因ASF對(duì)于SMN是否存在可變剪接調(diào)控，為進(jìn)一步解析miR-505-3p生物學(xué)功能提出新的觀點(diǎn)，為SMA疾病治療方案提供新的角度。

材料和方法

1 主要材料與試劑

MEF原代培養(yǎng)細(xì)胞系，分離自野生型孕14.5天C57BL6胚胎小鼠。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素鏈霉素混合抗生素、PBS緩沖液、HBSS緩沖液、木瓜蛋白酶（Gibco，美國(guó)）；ASF一抗（山羊源多克隆抗體，Santa Cruz，美國(guó)）；Alaxa488熒光二抗、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNaseI（Thermo，美國(guó)）；Trizol（Takara，日本）；內(nèi)參蛋白GAPDH免疫印跡一抗（小鼠源單克隆抗體，cell signaling technology，美國(guó)）；DAPI染料（碧云天，上海）；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)試劑盒（Promega，北京）；限制性核酸內(nèi)切酶Not1、Xho1、BamH1、EcoR1、T4連接酶（NEB，英國(guó)）；miRNA陰性對(duì)照序列、miR-505-3p小分子模擬物和抑制物及miR-505-5p模擬物（吉瑪生物，上海）；miRNA陰性對(duì)照序列及miR-505-3p過表達(dá)載體由上海英駿生物公司合成并構(gòu)建載體。相關(guān)序列信息見表1。

表1 m iRNA合成序列Tab.1 Synthesized m iRNA sequences

2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

Nanodrop2000型微量紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，美國(guó)）；Real-Time PCR儀（Qiagen，德國(guó)）；倒置相差熒光顯微鏡（OLYMPUS，日本）；電泳儀、AmaxaNucleofector電轉(zhuǎn)儀、凝膠成像儀（Biorad，美國(guó)）。

3 在MEF細(xì)胞中驗(yàn)證m iR-505-3p靶基因是ASF

3.1 MEF細(xì)胞原代培養(yǎng)

取野生型14.5天的C57BL6品系孕鼠一只，斷頸處死。用手術(shù)剪去除胚鼠頭部、四肢、尾部、腹部?jī)?nèi)臟團(tuán)，只留下軀干部分。將胚鼠軀干部分轉(zhuǎn)移到干凈的HBSS緩沖液中，去除軀干部分的脊椎和皮膚，將剩下的肌肉組織用彎頭手術(shù)剪剪碎。用滴管將組織碎片轉(zhuǎn)移至無菌15ml離心管中。向離心管中加入含有0.4%木瓜蛋白酶的PBS，放置在37℃恒溫水浴鍋中消化45min。消化充分后，組織懸液呈云霧狀，加入含有10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素混合抗生素的DMEM高糖培養(yǎng)基終止反應(yīng)。1000r／min離心4min，去除多余木瓜蛋白酶。用4m l高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照需要的細(xì)胞密度接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)板上進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)。

3.2 構(gòu)建含有靶基因ASF 3’UTR靶位點(diǎn)及突變靶位點(diǎn)的雙熒光素酶報(bào)告載體

設(shè)計(jì)特異性PCR引物，引物末端分別引入Not1和Xho1酶切位點(diǎn)，針對(duì)小鼠ASF基因3’UTR處的miR-505-3p靶向結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后割膠回收。用Not1和Xho1雙酶切雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體psi-CHECK-2，并同時(shí)雙酶切PCR膠回收產(chǎn)物。載體和插入片段經(jīng)T4連接酶連接，得到含有miR-505-3p靶基因ASF 3’UTR靶位點(diǎn)的重組載體。包含ASF 3’UTR突變靶位點(diǎn)插入序列經(jīng)合成，采用相同步驟構(gòu)建突變載體［12］。miR-505-3p抑制Srsf1基因的野生型種子序列為GUGUUGAA，miR-505-3p抑制Srsf1基因的突變型種子序列為CACAACUU。

3.3 電穿孔轉(zhuǎn)染過表達(dá)外源基因

MEF細(xì)胞培養(yǎng)兩代以后，用胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以1×106／ml濃度的細(xì)胞懸液加入1.5ml EP管中，每管1ml。1000r／min在4℃下離心4min，用尖頭滴管吸掉上清培養(yǎng)基。每管加入100μl電轉(zhuǎn)液，加入1μg質(zhì)粒，輕柔混勻。將細(xì)胞混合液加入電轉(zhuǎn)杯中，使用“MEF／mouse”程序電轉(zhuǎn)。每電轉(zhuǎn)完一次，用PBS徹底清洗電轉(zhuǎn)杯。電轉(zhuǎn)后將全部混合液加入1m l DMEM高糖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

3.4 雙熒光素酶活性檢測(cè)

MEF細(xì)胞電轉(zhuǎn)后48h，用PBS潤(rùn)洗細(xì)胞。提前將5×裂解液用雙蒸水稀釋至1×工作濃度，加入200μl裂解液，靜置5min。將細(xì)胞充分裂解后，轉(zhuǎn)移至EP管中。12000r／min 4℃離心10min。吸取10μl上清，與試劑盒A液在一新的EP管中混合并推入熒光檢測(cè)儀，讀出實(shí)驗(yàn)值a；待數(shù)值不再變化，加入試劑盒B液，充分混合并推入熒光檢測(cè)儀，讀出內(nèi)參值b。a／b的比值反映熒光素酶表達(dá)是否受到抑制。如果某一組讀數(shù)的比值遠(yuǎn)低于陰性對(duì)照組的比值，這一組對(duì)應(yīng)的序列即為潛在靶序列。

3.5 免疫熒光檢測(cè)ASF表達(dá)

PBS潤(rùn)洗細(xì)胞，靜置5min。吸掉PBS后加入含4%多聚甲醛的PBS固定細(xì)胞，靜置20min。吸掉固定液，用PBS洗3次，每次靜置5min。加入含5%牛血清白蛋白、0.1%TritonX100的PBS封閉液，封閉非特異性抗體結(jié)合位點(diǎn)，室溫靜置1h。加入ASF一抗（1：1000）4℃孵育過夜；PBS洗3次后用Alexa Flour＠488熒光二抗（1：1000）和DAPI（5μg／ml）室溫避光靜置2小時(shí)。PBS洗3次后用防熒光淬滅劑封片，晾干后在顯微鏡下觀察。

4 在MEF細(xì)胞中驗(yàn)證m iR-505-3p對(duì)SMN可變剪接的影響

4.1 構(gòu)建ASF表達(dá)載體

用MEF細(xì)胞樣本抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA文庫。以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增ASF編碼區(qū)。割膠回收目的片段后，插入片段與載體FUGW分別使用BamH1和EcoR1酶切。將切開的載體和插入片段割膠回收，以摩爾濃度比1：4進(jìn)行T4連接反應(yīng)，24小時(shí)后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌。挑取單克隆菌進(jìn)行小搖、菌落PCR鑒定。陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提，并使用FUGW特有的WPRE反向引物測(cè)序，序列正確的為構(gòu)建成功的載體。

4.2 細(xì)胞RNA抽提

用預(yù)冷的PBS洗2遍，每孔加入1ml Trizol充分裂解細(xì)胞。用槍頭將細(xì)胞充分刮散，吸取置于無RNA酶的EP管中，室溫靜置5min。加入200μl氯仿，劇烈搖晃1min，再室溫靜置2min。12000r／min轉(zhuǎn)速在4℃低溫離心15min。混合液分層后，小心將上層水相吸入新的EP管中，避免吸到中間蛋白層。加入500μl異丙醇，室溫靜置10min，12000r／min轉(zhuǎn)速在4℃低溫離心樣品10min。白色RNA將沉淀到管底。再用1ml 75%乙醇洗沉淀，手指輕彈管壁將樣品混勻，7500r／min轉(zhuǎn)速在4℃低溫離心樣品5min。去除上清，在超凈臺(tái)中風(fēng)干，然后用DEPC處理過的雙蒸水溶解。使用Nanodrop2000型微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度。

4.3 SMN不同剪接產(chǎn)物的半定量PCR檢測(cè)

用于PCR反應(yīng)的引物見表2。PCR反應(yīng)的體系為：10μl 2×SYBR Green PCR master mix，1μl cDNA模板，7μl雙蒸水，上下游引物（10μmol／L）各1μl。PCR循環(huán)條件為：95℃預(yù)變性2min，95℃變性10＂，65℃延伸30＂，共35個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)，通過產(chǎn)物溶解曲線判定反應(yīng)特異性。配制1.5%瓊脂糖凝膠，將PCR產(chǎn)物電泳分離1h。經(jīng)凝膠成像儀拍照后進(jìn)行反色處理，對(duì)SMN不同剪接條帶進(jìn)行灰度測(cè)定，根據(jù)對(duì)應(yīng)內(nèi)參基因GAPDH條帶灰度值進(jìn)行均一化，進(jìn)而對(duì)SMN不同剪接產(chǎn)物半定量。

表2 SMN PCR引物Tab.2 Sequences of PCR prim ers for SMN

5 數(shù)據(jù)作圖和分析

所有數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行作圖。數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間差異通過t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

結(jié) 果

1 MEF細(xì)胞中m iR-505-3p有效抑制ASF

利用Targetscan等miRNA數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-505-3p的潛在靶基因。為了確認(rèn)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果，將ASF上的miR-505-3p靶序列克隆至雙熒光素酶報(bào)告載體，并同時(shí)構(gòu)建種子序列突變型報(bào)告載體；在原代培養(yǎng)的MEF細(xì)胞中分別過表達(dá)空載、ASF靶序列載體和ASF種子序列突變型載體（ASF mut）。熒光素酶活性檢測(cè)表明，與空載相比，含有ASF靶序列的雙熒光素酶載體的熒光比值受到共轉(zhuǎn)的miR-505-3p的顯著抑制，而種子序列突變型載體不受抑制（圖1）。由此進(jìn)一步支持ASF是MEF細(xì)胞中miR-505-3p靶基因的推測(cè)。

圖1 雙熒光素酶活性檢測(cè)驗(yàn)證miR-505-3p靶向抑制ASF。Vector，空載，為陰性對(duì)照組；ASF，實(shí)驗(yàn)組；ASFmut，突變實(shí)驗(yàn)組；**，P＜0.01Fig.1 Dual-luciferase assay to verify the targeted inhibition of ASF by miR-505-3p.Vector，negative control group；ASF，experimental group；ASFmut，mutant experimental group.**，P＜0.01

為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-505-3p對(duì)于ASF的抑制是否真實(shí)有效，在MEF細(xì)胞中電轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-505-3p后，通過免疫印跡技術(shù)檢測(cè)ASF蛋白表達(dá)量的變化，并通過實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）檢測(cè)ASF mRNA水平變化。與陰性對(duì)照組相比，過表達(dá)miR-505-3p模擬物（miR-505-3p mimics）顯著抑制ASF的表達(dá)；而同時(shí)共轉(zhuǎn)miR-505-3p小分子反向互補(bǔ)抑制物（miR-505-3p inhibitors）能消除過表達(dá)的miR-505-3p對(duì)ASF的抑制（圖2A和圖2B）。qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示ASF mRNA也受到miR-505-3p的抑制（圖2C）。因此，miR-505-3p在MEF細(xì)胞中能有效抑制ASF的表達(dá)，ASF是miR-505-3p的靶基因。

圖2 miR-505-3p對(duì)MEF細(xì)胞中ASF的影響。A，miR-505-3p對(duì)MEF細(xì)胞中ASF影響的免疫印跡檢測(cè)；B，免疫印跡檢測(cè)miR-505-3p對(duì)MEF細(xì)胞中ASF影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；C，miR-505-3p對(duì)MEF細(xì)胞中ASFmRNA影響的qPCR檢測(cè)統(tǒng)計(jì)分析；Scramble，隨機(jī)序列siRNA（陰性對(duì)照）；Mimics，miR-505-3p實(shí)驗(yàn)組；Mimics+inhibitors，miR-505-3p逆轉(zhuǎn)對(duì)照組；**，P＜0.01；*，0.01＜P＜0.05.Fig.2 The effect ofmiR-505-3p on ASF in MEFs.A，western blot detection of the effectofmiR-505-3p on ASF expression in MEFs.B，statistical analysis of thewestern blot results of the effect ofmiR-505-3p on ASF expression in MEFs.C，statistical analysis of the qPCR results of the effect ofmiR-505-3p on ASFmRNA in MEFs.Scramble，scramble siRNA（negative control）；Mimics，miR-505-3p mimics（experimental group）；Mimics+inhibitors，miR-505-3p mimics+inhibitors（reverse control）；**P＜0.01，*，0.01＜P＜0.05

為了觀察miR-505-3p對(duì)于ASF表達(dá)的影響，采用免疫熒光技術(shù)對(duì)MEF細(xì)胞進(jìn)行ASF蛋白特異性熒光染色。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染隨機(jī)序列的陰性對(duì)照組中，ASF在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中都有較高表達(dá)。在過表達(dá)miR-505-3p模擬物的實(shí)驗(yàn)組中，ASF的表達(dá)量整體下調(diào)，miR-505-3p顯著抑制ASF在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)（圖3）。由此，我們認(rèn)定ASF是MEF細(xì)胞中miR-505-3p的真實(shí)靶基因。

圖3 miR-505-3p對(duì)ASF表達(dá)影響的免疫熒光檢測(cè)。Scramble siRNA，隨機(jī)序列siRNA（陰性對(duì)照）；miR-505-3p mimics，miR-505-3p實(shí)驗(yàn)組；ASF，對(duì)應(yīng)488nm熒光通道；DAPI，對(duì)應(yīng)紫外通道；左列及中間列，40×物鏡視野；右列為放大圖；比例尺，20μmFig.3 Immunofluorescent detection of the effect ofmiR-505-3p on ASF expression.Scramble siRNA，negative control；miR-505-3p mimics，experimental group；ASF，488nm fluorescence channel；DAPI，UV channel；the left and middle columns，40×amplification；the right column，enlarged merged images；scale bar，20μm

2 m iR-505-3p通過抑制ASF促進(jìn)SMN-FL向SMN-D7轉(zhuǎn)變

ASF是一種重要的可變剪接因子，參與調(diào)控SMN基因的可變剪接。ASF蛋白可識(shí)別SMN第7號(hào)外顯子上一個(gè)6堿基長(zhǎng)的模序，此模序促進(jìn)AS F對(duì)外顯子的高效準(zhǔn)確識(shí)別，從而形成包含第7號(hào)外顯子的SMN-FL全長(zhǎng)蛋白。若改變這一模序，ASF不再能準(zhǔn)確識(shí)別SMN的外顯子，導(dǎo)致缺失第7號(hào)外顯子的SMN-D7毒性截短蛋白形成［10］。為了探究miR-505-3p是否能夠通過抑制ASF影響SMN基因的可變剪接，分別對(duì)miR-505-3p和ASF進(jìn)行表達(dá)調(diào)控，通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)結(jié)合DNA凝膠電泳，檢測(cè)SMN的可變剪接是否受到影響。

對(duì)miR-505-3p的調(diào)控實(shí)驗(yàn)顯示，過表達(dá)miR-505-3p顯著抑制SMN-FL產(chǎn)物的形成，并且顯著促進(jìn)SMN-D7的形成（圖4A和圖4B，箭頭指示）。此結(jié)果提示miR-505-3p通過抑制內(nèi)源性ASF，間接干擾內(nèi)源性ASF對(duì)于SMN-FL剪接的調(diào)控。而同時(shí)過表達(dá)miR-505-3p抑制物，能夠逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-505-3p的效果，這表明miR-505-3p調(diào)控SMN可變剪接是特異且可逆的。過表達(dá)另一個(gè)pre-miR-505的無關(guān)成熟體miR-505-5p，發(fā)現(xiàn)其過表達(dá)不影響SMN-FL的正常剪接，這進(jìn)一步證明，miR-505-3p對(duì)于SMN可變剪接的調(diào)控是特異性的（圖4A和圖4B）。

進(jìn)一步對(duì)ASF的調(diào)控實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)ASF蛋白顯著促進(jìn)SMN-FL產(chǎn)物的形成，并且相應(yīng)地顯著抑制SMN-D7的形成（圖4A和圖4B，星號(hào)指示）。這種效果能被共轉(zhuǎn)的miR-505-3p所逆轉(zhuǎn)，而共轉(zhuǎn)miR-505-3p抑制物則能相應(yīng)抵消miR-505-3p的效果，顯著促進(jìn)SMN-FL產(chǎn)物的形成，并顯著抑制SMN-D7的形成（圖4A，井號(hào)指示）；qPCR檢測(cè)顯示完全相同的變化趨勢(shì)（圖4C）。由此表明，ASF能獨(dú)立調(diào)控SMN的可變剪接，miR-505-3p能通過干擾ASF的表達(dá)量間接調(diào)控SMN的可變剪接。

圖4 miR-505-3p和ASF對(duì)SMN可變剪接調(diào)控分析。A，miR-505-3p和ASF對(duì)SMN可變剪接調(diào)控的PCR凝膠電泳檢測(cè)；B，miR-505-3p和ASF對(duì)SMN可變剪接調(diào)控的PCR凝膠電泳半定量統(tǒng)計(jì)分析；C，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-505-3p和ASF對(duì)SMN可變剪接調(diào)控的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；Scrambles，隨機(jī)序列siRNA（陰性對(duì)照）；miR-505-5p，來自pre-miR-505的無關(guān)成熟體（陰性對(duì)照）；Mimics，miR-505-3p實(shí)驗(yàn)組；Mimics+inhibitors，miR-505-3p逆轉(zhuǎn)對(duì)照組；Mock，空白對(duì)照Fig.4 Analysis of the regulation of SMN alternative splicing bymiR-505-3p and ASF.A，PCR and gel electrophoresis detection of the regulation of SMN alternative splicing bymiR-505-3p and ASF；B，semi-quantitative statistical analysis of the results of the tests in A；C，statistical analysis of the RT-qPCR detection results of the regulation of SMN alternative splicing bymiR-505-3p and ASF.Scramble，scramble siRNA（negative control）；miR-505-5p，negative control from pre-miR-505；Mimics，miR-505-3p experimental group；Mimics+inhibitors，miR-505-3p reverse control；Mock，blank control

討 論

SMA是一類常見的常染色體隱性遺傳病，新生兒中發(fā)病率高達(dá)1／6000至1／10000，在所有致死性常染色體隱性遺傳病排第二位。目前公認(rèn)的SMA的主要致病機(jī)理是由功能型SMN-FL蛋白缺失以及SMN-D7蛋白和其他毒性截短蛋白堆積所致。SMN基因存在可變剪接，在可變剪接因子ASF的參與下形成功能型SMN-FL蛋白，ASF無法識(shí)別時(shí)則形成SMN-D7蛋白?；诖藱C(jī)理，Adrain R.Krainer團(tuán)隊(duì)通過向小鼠側(cè)腦室注射反義寡聚核苷酸，以介導(dǎo)SMN-D7向SMN-FL轉(zhuǎn)化，有效地逆轉(zhuǎn)了SMA表型［13］。然而，其他潛在可行的SMA治療方案尚且缺乏報(bào)導(dǎo)。

本研究通過靶基因預(yù)測(cè)和雙熒光素酶鑒定，在原代培養(yǎng)的MEF細(xì)胞中找到了miR-505-3p的靶基因ASF。通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)、免疫印跡和免疫熒光染色證實(shí)了miR-505-3p可以靶向抑制ASF的表達(dá)。qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-505-3p能顯著促進(jìn)SMN-FL向SMN-D7轉(zhuǎn)化，而過表達(dá)ASF蛋白能產(chǎn)生相反效果。本研究認(rèn)為，miR-505-3p通過靶向抑制ASF蛋白表達(dá)量，以干擾ASF參與SMN-FL剪接形成，一部分原本將加工成包含第7號(hào)外顯子的SMNFL的轉(zhuǎn)錄本被剪接形成第7號(hào)外顯子缺失的SMND7（圖5）。本研究首次報(bào)道m(xù)iR-505-3p是SMN基因可變剪接的新的調(diào)控分子。

本研究還顯示，使用合成對(duì)小分子miR-505-3p抑制物能有效阻斷內(nèi)源性miR-505-3p對(duì)于ASF的抑制，以保障充足的ASF蛋白參與功能型SMN-FL的剪接形成，由此為脊髓性肌萎縮癥提供了潛在的治療方案。

圖5 miR-505-3p調(diào)控SMN可變剪接模式圖。I，SMN的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物一部分在ASF的參與下剪接形成包含第7號(hào)外顯子的SMN-FL蛋白；II，SMN的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物一部分經(jīng)可變剪接形成不包含第7號(hào)外顯子的SMN-D7蛋白；III，過表達(dá)外源miR-505-3p靶向抑制ASF，干擾SMN-FL蛋白的形成；IV，在miR-505-3p的干擾下，一部分原本將加工形成SMN-FL蛋白的轉(zhuǎn)錄本被剪接形成不包含第7號(hào)外顯子的SMN-D7蛋白Fig.5 Schematic diagram the regulation of SMN alternative splicing by miR-505-3p.I，SMN transcripts spliced to form exon-7 included SMN-FL protein with the presence of ASF；II，SMN transcripts spliced to form exon-7excluded SMN-D7 protein without the presence of ASF；III，the overexpression of exogenousmiR-505-3p interfereswith SMN-FL formation by targeted inhibition of ASF；VI，the interference bymiR-505-3p promotes the splicing towards SMN-D7 formation

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m iR-505-3p regulates the alternative sp licing of survivalmotor neuron gene by inhibiting the alternative sp licing factor in mouse embryonic fibroblasts

Yang Kan1，Li Xiaoning2，Ma Xiaoxiao2，Li Kai2，Zhou Yuxun2，Xiao Junhua1，2*
（1College of Environmental Science and Engineering，2College of Chemistry，Chemical Engineering and Biotechnology，Donghua University，Shanghai201620，China）

ObjectiveTo investigate the role ofmicroRNA 505-3p（miR-505-3p）inmodulating the alternative splicing of survivalmotor neuron（SMN）gene.M ethodsA prediction about the targetgene ofmiR-505-3p wasmadewith bio-information databases. Then a dual-luciferase reporter vector was constructed to verify inmouse embryonic fibroblasts（MEFs）that the target gene was an alternative splicing factor（ASF）gene.The inhibition of ASF bymiR-505-3p was verified by immunoblotting and immunofluorescent staining.Real-time PCR coupled with agarose gel electrophoresiswas used to detect the effect ofmiR-505-3p on the expression of normal full-length SMN（SMN-FL）and toxic exon-7 excluded SMN（SMN-D7）aswell as the role of ASF in the process.ResultsmiR-505-3p directly bonded with the 3＇UTR of ASF and inhibited the expression of ASFmRNA and protein，especially the expression and distribution of ASF protein in the nucleus.The over-expression ofmiR-505-3p promoted the transition from SMN-FL to SMN-D7，while the over-expressing of ASF or inhibition ofmiR-505-3p facilitated the retention of SMN-FL.ConclusionASF is indispensable for the normal splicing of SMN to form SMN-FL.By inhibiting ASF，miR-505-3p interferes with the regulation of the alternative splicing of SMN by ASF and leads to the transition of normal SMN-FL to toxic SMN-D7.

miR-505-3p；alternative splicing factor；survivalmotor neuron gene；mouse embryonic fibroblast

Q74

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2016.06.004

2016-10-23

2016-12-14

國(guó)家自然科學(xué)基金（3131257）；上海市科委重點(diǎn)項(xiàng)目（14140900502）；東華大學(xué)研究生創(chuàng)新基金（DH-D-2014049）

楊侃，男（1987年），漢族，博士研究生

*通訊作者（To whom correspondence should be addressed）：xiaojunhua＠dhu.edu.cn