武當山區(qū)不同采收期寬葉重樓地上部分總黃酮的累積規(guī)律

楊金霞　張　慧　葉　方▲　黃良永　孫良學　雷　攀1.湖北省十堰市太和醫(yī)：湖北醫(yī)藥學：附屬醫(yī)：藥學部，湖北十堰2000；2.湖北醫(yī)藥學：湖北省藥用植物綜合利用工程技術研究中心，湖北十堰2000；.湖北中醫(yī)藥大學藥學：，湖北武漢006；.湖北濟世藥業(yè)有限責任公司，湖北十堰2000

武當山區(qū)不同采收期寬葉重樓地上部分總黃酮的累積規(guī)律

楊金霞1，2張慧3葉方1，2▲黃良永1，2孫良學4雷攀1，2
1.湖北省十堰市太和醫(yī)：湖北醫(yī)藥學：附屬醫(yī)：藥學部，湖北十堰442000；2.湖北醫(yī)藥學：湖北省藥用植物綜合利用工程技術研究中心，湖北十堰442000；3.湖北中醫(yī)藥大學藥學：，湖北武漢430064；4.湖北濟世藥業(yè)有限責任公司，湖北十堰442000

目的以武當山區(qū)野生轉家種寬葉重樓為樣本，測定寬葉重樓不同采收期地上部分總黃酮含量，研究總黃酮累積規(guī)律。方法根據(jù)黃酮與Al3+絡合形成穩(wěn)定絡合熒光物質的特點，以蘆丁為標準品，采用熒光光度法測定寬葉重樓地上部分的黃酮含量。結果寬葉重樓地上部分總黃酮含量在4月上旬最高，隨后呈降低趨勢，到6月下旬種子開始發(fā)育時含量升高，然后再下降，到7月下旬最低。4月上旬、下旬，5、6、7、9月總黃酮含量分別為1.11%、0.76%、0.47%、0.70%、0.19%、0.53%。結論以總黃酮含量為考察指標，考慮到植株生長發(fā)育的實際因素，寬葉重樓地上部分可在6月中下旬采收。

寬葉重樓；熒光光度法；地上部分；總黃酮；累積規(guī)律

［Avsteact］Ovjective To study the dynamic change of total flavonoids in aerial parts of PaTis polyphylla var.latifolia in Wudang Mountain area，and to explore the optimal harvest period of PaTis polyphylla var.latifolia.M ethods According to the characteristic that flavonoids could reactwith Al3+to form stable flurescent complex，taking rutin as the standard sample，and fluorescence spectrophotometric method to determine the content of total flavonoids was used in the aerial parts of PaTis polyphylla var.latifolia in different harvest periods.Results The content of total flavonoids reached highest level in early April，after that it had a trend to decrease，but it increased and then decreased in the last June，and reached the lowest in late July.The content of early April，late April，May，June，July，September was 1.11%，0.76%，0.47%，0.70%，0.19%，0.53%respectively.Conclusion The optimal harvest period of PaTis polyphylla var.latifolia in Wudang Mountain area is confirmed in mid to late June，for the content of total flavonoids as reference indexes with considering the actual factors.

［Key woeds］PaTis polyphylla var.latifolia；Fluorescence spectrophotometry；Aerial parts；Total flavonoids；Accumulative rules

重樓（Paridis Rhizoma）是百合科重樓屬植物，始載于《神農本草經》，稱“蚤休”，列為下品［1］。味苦，性微寒，有小毒，歸肝經，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚的功效［2］。現(xiàn)代藥理研究證明重樓具有抗腫瘤、止血止痛［3-4］、抗炎抑菌、心血管系統(tǒng)作用［5］等藥理活性，其活性成分有重樓總皂苷和黃酮類化合物［6］。重樓主要分布于亞歐大陸的溫帶、亞熱帶地區(qū)［7］，約有10個品種，我國分布有7種8變種［8］，主要分布于云南、貴州、四川、湖北等地。武當山區(qū)分布有2種6變種［9］，主要有七葉一枝花（華重樓）、滇重樓、球藥隔重樓、長藥隔重樓、狹葉重樓、寬葉重樓等。重樓是多年生草本，對生長環(huán)境要求較高，不同的海拔高度、氣溫、氣候、土壤等因素都可能影響重樓質量及產量［10］。另外，山體走向也會影響其生長，同樣是高海拔地區(qū)，重樓喜背陰坡，而朝陽坡基本不生長，且需要腐殖質豐富的土壤。武當山區(qū)以其獨特的地理氣候環(huán)境，適于重樓等藥用植物的生長［9］。重樓的主要藥用部位是根莖，主要藥用成分是甾體皂苷類，一般需要種植5年以上才能藥用。而重樓每年生長的地上部分沒有得到利用，造成資源浪費［11］。

黃酮類化合物是重樓的化學成分之一［12］。黃酮類化合物具有抗心律失常、抗血脂、鎮(zhèn)靜、抗抑郁、抗菌抗病毒、免疫調節(jié)等作用，目前含有黃酮類化合物的藥物有很多，如舒血寧片、心脈舒通等［13］。通過研究重樓中黃酮類化合物的分布情況有可能開發(fā)新的藥用資源，使重樓地上部分得到合理應用。本次試驗采用熒光光度法，測定重樓地上部分黃酮含量，研究總黃酮的累積規(guī)律，根據(jù)各地重樓的黃酮累積規(guī)律合理確定采收時間，以合理利用資源。

1　儀器與試藥

1.1儀器

熒光光譜儀（日立F-7000），電子分析天平（FA-2004，上海精密儀器），數(shù)字式酸度計（PHSJ-A，上海雷磁儀器），電熱恒溫水浴箱（HW1A，北京醫(yī)療設備廠）。

1.2試藥

蘆丁標準品（中國食品藥品檢定研究：，100080-201408，供含量測定用，92.8%）。

重樓藥材采自武當山區(qū)龍王寨重樓種植基地，由湖北醫(yī)藥學：藥學：葉方副教授鑒定，樣本保存在湖北醫(yī)藥學：附屬十堰市太和醫(yī)：藥學部標本室。其樣品基源地及產地信息見表1。藥材洗凈，50℃烘干，粉碎過3號篩備用。硝酸鋁、醋酸鈉、冰乙酸均為分析純，水為自制去離子水。

表1　樣品基源及產地信息和含量測定結果

2　方法與結果

2.1對照品的制備

精密稱取蘆丁對照品10.3 mg于50 mL容量瓶中，用60%的乙醇溶解，定容至刻度，搖勻，得濃度為0.2060mg/mL的對照品溶液。

2.2供試品的制備

精密稱取重樓地上部分干燥粉末1 g，置于100mL錐形瓶中，加入25mL石油醚，60℃水浴回流2 h，棄去石油醚液，藥渣揮干后加入60%乙醇30 mL，80℃水浴回流2 h。濾過，濾渣用60%乙醇洗滌3次，濾液定容至50mL容量瓶中，搖勻，得到樣品提取液A1～A6［14］。

2.3測定方法及檢測波長的確定

精密量取“2.1”項下對照品溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中，加入10%硝酸鋁溶液1mL，pH=4的HAc-NaAc緩沖溶液3mL，用60%乙醇定容至刻度。精密量取A1溶液0.5mL于10mL容量瓶中，同法操作［14-15］。固定激發(fā)波長（λex），在200～700 nm范圍內進行對照品和樣品溶液熒光掃描，確定發(fā)射波長（λem），結果最佳λem為484 nm，見圖1～2；固定λem為484 nm，掃描λex在200～700 nm范圍內對照品及樣品溶液熒光強度，結果最佳λex為445 nm，見圖3～4。確定檢測波長：λex為445 nm，λem為484 nm，狹縫寬度為2.5 nm。

圖1　蘆丁標準品：固定激發(fā)波長掃描發(fā)射波長

圖2　樣品溶液：固定激發(fā)波長掃描發(fā)射波長

圖3　蘆丁標準品：固定發(fā)射波長掃描激發(fā)波長

圖4　樣品溶液：固定發(fā)射波長掃描激發(fā)波長

2.4方法學考察

2.4.1標準曲線的考察分別精密移取蘆丁對照品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mL，置于10 mL容量瓶中，加入10%的硝酸鋁溶液1 mL，pH=4的HAc-NaAc緩沖溶液3 mL，用60%乙醇定容，搖勻，靜置25 min，即配成標準工作溶液。以60%乙醇溶液為空白對照，在固定激發(fā)波長為445 nm，發(fā)射波長為484 nm，狹縫寬度為2.5 nm的條件下，測定熒光強度。以熒光光度值為Y軸，蘆丁濃度（μg/mL）為X軸繪制標準曲線，求回歸方程。結果蘆丁的線性方程為：Y= 0.019 05X+0.0385（T2=0.9968），說明在2.06～32.96μg/mL范圍內蘆丁濃度與熒光強度呈良好的線性關系。

2.4.2精密度試驗取標準品溶液1.0 mL于容量瓶中，按“2.4.1”項下操作，靜置25min后，在λex=445 nm，λem=484 nm處連續(xù)測定光度值5次，計算RSD值。結果RSD=1.50%。表明儀器精密度良好。

2.4.3重復性試驗取1號樣品6份，精密量取同樣的體積，按“2.4.1”項下操作，測定它們的光度值，計算總黃酮含量，6份樣品的平均總黃酮含量為1.11%，RSD值為1.39%。表明重復性良好。

2.4.4穩(wěn)定性試驗取同一樣品在0、0.5、1.0、2.0、4.0 h內測定光度值，結果RSD=1.25%。表明樣品溶液在4 h內穩(wěn)定性良好。

2.4.5加樣回收率測定精密稱取同批次6號藥材粉末0.5 g，共計6份，按“2.2”項下提取樣品溶液，石油醚揮干后加入濃度為2.6500 mg/mL的蘆丁對照品溶液1 mL，同法操作，用60%乙醇定容后按“2.3”項下絡合顯色。測得其平均回收率為96.87%，RSD為1.48%，說明蘆丁的加樣回收率符合規(guī)定。見表2。

表2　加樣回收率試驗結果

2.5樣品含量測定

在狹縫寬度為2.5 nm、激發(fā)波長為λex=445 nm、發(fā)射波長λem=484 nm的條件下按“2.3”項下操作方法測定樣品中總黃酮的熒光強度，再用回歸方程計算含量，結果見表1。

2.6重樓地上部分總黃酮含量動態(tài)積累規(guī)律結果分析

根據(jù)含量測定結果，結合采收時間繪制重樓地上部分總黃酮含量變化曲線圖見圖5。由圖5可知，含量最高的為4月上旬，達到1.11%，然后開始降低，6月下旬花發(fā)育成熟出現(xiàn)一個高峰，然后再降低，至7月下旬降到最低，為0.19%，然后又開始上升。

3　討論

通過對寬葉重樓不同采收期總黃酮含量的測定可以看出，不同采收期總黃酮含量有較大差異。由于重樓是多年生藥用植物，根莖繁殖需4～5年采收，種子繁殖需要8～9年采收，周期較長。在人工種植重樓過程中，為了讓養(yǎng)分集中供應根莖部位以利生長，一般在5～6月花萼片展開后，及時剪去全部花花萼，以提高產量［16-17］。這樣地上部分均被浪費，在野生資源日趨緊張的大環(huán)境下，有必要開展藥材新資源的研究［18］。如能用寬葉重樓地上部分為原料提取黃酮，對擴大其臨床用藥的藥源具有積極的經濟意義。所以如按重樓中黃酮成分考察，可以在6月中下旬采收重樓地上部分。

圖5　重樓不同采收期黃酮含量

重樓在許多中藥制劑中都有應用，是云南白藥、季德勝蛇藥片、宮血寧膠囊、樓蓮膠囊、熱毒清膠囊等重要中成藥的主要成分。但在《中國藥典》中藥用重樓僅為云南重樓和七葉一枝花，各地野生重樓資源下降嚴重，有的甚至瀕臨滅絕，所以可以考慮其他民間應用的品種，如多葉重樓、寬葉重樓等替代云南重樓和七葉一枝花。重樓的地上部分生長較快［19］，也可以通過考察地上部分有效成分的含量，挖掘其隱含著藥用及經濟價值，避免資源浪費。

根據(jù)黃酮類化合物能與鋁離子反應形成熒光螯合物的原理［20］，可以采用熒光分光光度法測定黃酮類化合物的含量。重樓地上部分含有大量的葉綠素，在樣品處理過程中用石油醚除去葉綠素，但可能還是會對黃酮成分的分析存在干擾，本研究采用硝酸鋁在酸性條件下與蘆丁等黃酮類化合物產生熒光物質的原理，用熒光分光光度法測定總黃酮含量，專屬性較高。

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Dynam ic change of total flavonoids in aeeial paets of Paris polyphylla vae. latifolia in vaeious haevest times feom W udang M ountain aeea

YANG Jinxia1，2ZHANG Hui3YE Fang1，2▲HUANG Liangyong1，2SUN Liangxue4LEIPan1，2

1.Department of Pharmacy，Shiyan Taihe Hospital，the Affiliated Hospital of Hubei University of Medicine，Hubei Province，Shiyan 442000，China；2.Engineering Research Center for Herbal Utilization of Hubei Province，Hubei Province，Shiyan 442000，China；3.College of Pharmacy，Hubei University of Chinese Medicine，Hubei Province，Wuhan 430064，China；4.Hubei Jishi Pharmaceutical Co.Ltd.，Hubei Province，Shiyan 442000，China

R927.1

A

1674-4721（2016）08（c）-0016-05

2016-04-20本文編輯：趙魯楓）

湖北省2011計劃（2011JH-2014CXTT13）；湖北省藥用植物綜合利用工程技術研究中心項目（GC2015204）。