抗壞血酸對(duì)減輕繼發(fā)性腦損傷作用機(jī)制的研究

張　昊，茆　翔，劉佰運(yùn),2

(1.中國人民武裝警察部隊(duì)總醫(yī)院神經(jīng)創(chuàng)傷科，北京　100039；

2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科，北京　100050)

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抗壞血酸對(duì)減輕繼發(fā)性腦損傷作用機(jī)制的研究

張昊1，茆翔1，劉佰運(yùn)1,2

(1.中國人民武裝警察部隊(duì)總醫(yī)院神經(jīng)創(chuàng)傷科，北京100039；

2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科，北京100050)

摘要：目的探討抗壞血酸減輕顱腦創(chuàng)傷后繼發(fā)性腦損傷加重的機(jī)制。方法將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)+生理鹽水組、假手術(shù)+抗壞血酸組、打擊+生理鹽水組及打擊+抗壞血酸組，每組 12 只。建立中度顱腦損傷模型，顱腦創(chuàng)傷后24 h進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評(píng)分；采用酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定腦組織超氧化物歧化酶(SOD)活性；采用Western blot法測(cè)定顱腦創(chuàng)傷后24 h的損傷側(cè)腦組織中細(xì)胞色素P450(CYP2E1),基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和血腦屏障緊密連結(jié)蛋白Occludin的表達(dá)情況。結(jié)果打擊+抗壞血酸組的損傷程度與打擊+生理鹽水組相比明顯減輕，SOD活力增高，CYP2E1表達(dá)減少，MMP-9的含量降低，Occludin的含量增高。結(jié)論抗壞血酸可以通過降低血腦屏障的破壞程度，減輕繼發(fā)性顱腦損傷的進(jìn)一步加重，其作用可能是依靠抑制CYP2E1的表達(dá)而發(fā)揮的。

關(guān)鍵詞：顱腦創(chuàng)傷；抗壞血酸；CYP2E1；氧化應(yīng)激

外傷性腦損傷后所發(fā)生的各種繼發(fā)性腦損傷是導(dǎo)致繼發(fā)性神經(jīng)元障礙和死亡的主要原因。血腦屏障的破壞和開放是外傷性腦損傷后常見的繼發(fā)性腦損傷[1]。這種繼發(fā)性腦損傷危害嚴(yán)重，因此探討如何減輕打擊引起的繼發(fā)性腦損傷并探討其可能的機(jī)制就顯得十分重要。

抗壞血酸是一種抗氧化劑，能防止自由基對(duì)人體的傷害。有研究表明[2]，抗壞血酸可減輕外傷后早期的氧化應(yīng)激，延緩打擊后的病情進(jìn)一步發(fā)展，因此補(bǔ)充抗壞血酸在臨床上已成為減輕繼發(fā)性腦損傷的重要方法。

細(xì)胞色素P450(cytochromeP450，CYPs)是一組結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的超家族基因編碼的同工酶，是溫和條件下能夠把底物中反應(yīng)惰性的碳?xì)滏I氧化的單加氧酶,參與大多數(shù)內(nèi)源性物質(zhì)的代謝，外源性物質(zhì)的解毒、前致癌物質(zhì)的激活[3]。CYP2E1是其中的重要成員，它可以催化許多前致癌物質(zhì)和前毒物轉(zhuǎn)化為致癌物和有毒物，危害機(jī)體，而有些藥物可以抑制它的表達(dá)與活性。

本實(shí)驗(yàn)的目的在于使用抗壞血酸對(duì)顱腦創(chuàng)傷后的大鼠進(jìn)行干預(yù)，探究CYP2E1在其中發(fā)揮的作用，研究抗壞血酸對(duì)顱腦創(chuàng)傷保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物及分組成年健康雄性SD大鼠, 體質(zhì)量(270±15)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為四組:假手術(shù)+生理鹽水組、假手術(shù)+抗壞血酸組、打擊+生理鹽水組及打擊+抗壞血酸組,每組12只。

1.2試劑及藥品抗壞血酸；10%水合氯醛；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物公司)；超氧化物歧化酶(SOD)ELISA檢測(cè)試劑盒(南京建成)，基質(zhì)金屬蛋白酶9抗體(MMP-9，ab38899；Abcam公司)；緊密連接蛋白Occludin抗體(ab31721，Abcam公司)； 細(xì)胞色素P450抗體(CYP2E1，ab28146，Abcam公司)。

1.3動(dòng)物模型的建立假手術(shù)+生理鹽水組、假手術(shù)+抗壞血酸組、打擊+生理鹽水組及打擊+抗壞血酸組大鼠按 400 mg·kg-1采用 10% 水合氯醛麻醉，取頭皮正中切口，分離骨膜，暴露顱骨。在右側(cè)前囟和人字縫尖中間，開直徑為 5 mm 的骨窗，注意保持硬膜完整。將大鼠固定于立體定位儀上。將撞擊錘(直徑 4 mm) 安置于顱窗內(nèi)，緊貼硬膜。采用PinPointTM顱腦損傷撞擊器，建立中度損傷的可控性皮質(zhì)打擊模型，打擊條件: 撞擊速度2 m·s-1，撞擊深度2.5 mm，接觸時(shí)間85 ms。術(shù)后縫合創(chuàng)口。假手術(shù)組大鼠除不進(jìn)行撞擊外，其余手術(shù)操作同損傷組。術(shù)中用恒溫手術(shù)臺(tái)維持實(shí)驗(yàn)大鼠肛溫(37±0.5)℃。

1.4給藥生理鹽水和抗壞血酸均采用腹腔注射的給藥途徑。生理鹽水注射劑量為5 mL·kg-1，抗壞血酸注射劑量為200 mg·kg-1，注射時(shí)間均為傷后即刻開始。

1.5神經(jīng)功能缺損評(píng)分在損傷后24 h對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分[4]，采用18分的神經(jīng)功能量表從感覺試驗(yàn)，平衡試驗(yàn)，反射試驗(yàn)等方面評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)大鼠的神經(jīng)功能缺損程度。分?jǐn)?shù)越高，神經(jīng)功能缺損程度越重，采用雙盲法對(duì)各組進(jìn)行評(píng)分。

1.6SOD活力的測(cè)定大鼠斷頭取腦組織(去除小腦、腦干) ,稱量,按1∶10的比例加入生理鹽水,勻漿4 000 r·min-1離心10 min取上清液保存用于ELISA實(shí)驗(yàn)。SOD活性測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法,具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7Western Blot 檢測(cè)裂解的蛋白置于100℃水浴10 min后，上樣于10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，后將蛋白轉(zhuǎn)印于硝酸纖維素膜上，將該膜浸于50 g·L-1的1×TBST中室溫輕搖60 min用于封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，1×TBST洗3次，每次5 min。加入兔抗大鼠MMP-9和Occludin抗體，4℃孵育過夜，后移去一抗，1×TBST洗3次，每次5 min。加入二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗羊和抗兔IgG,1∶5 000),室溫孵育1 h，ECL 光化學(xué)法顯色并拍片。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理對(duì)于連續(xù)變量采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差；對(duì)于分級(jí)變量采用百分比；對(duì)于連續(xù)變量，運(yùn)用Kolmorogov-Smirnov 檢驗(yàn)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，而后進(jìn)行方差齊性的分析。對(duì)于兩組正態(tài)連續(xù)變量，使用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。采用 ANOVA 方差分析及posthoc檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)對(duì)多組計(jì)量資料進(jìn)行比較。P<0.05為差異有顯著性。

2結(jié)果

2.1神經(jīng)功能損傷評(píng)分24 h后進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評(píng)分，假手術(shù)+生理鹽水組的評(píng)分為(1.0±0.2)分，假手術(shù)+抗壞血酸組的評(píng)分為(0.9±0.3)分，打擊+生理鹽水組的評(píng)分為(10.2±1.8)分，打擊+抗壞血酸組的評(píng)分為(7.9±2.1)分。打擊+生理鹽水組的神經(jīng)功能損傷評(píng)分明顯高于假手術(shù)組+生理鹽水組，假手術(shù)組+抗壞血酸組和打擊+抗壞血酸組(P<0.05)。打擊+抗壞血酸組的評(píng)分則低于打擊+生理鹽水組(P<0.05)。見圖1。

2.2SOD的活力假手術(shù)+生理鹽水組SOD活力為(91.00±0.93)U·mgprot-1，假手術(shù)+抗壞血酸組為(86.50±1.12)U·mgprot-1，打擊+生理鹽水組SOD活力為(72.88±1.70)U·mgprot-1，打擊+抗壞血酸組為(80.38±1.05)U·mgprot-1。打擊+生理鹽水組和打擊+抗壞血酸組的SOD活力明顯低于假手術(shù)+生理鹽水組和假手術(shù)+抗壞血酸組(P<0.05)，但打擊+抗壞血酸組的SOD活力高于打擊+生理鹽水組(P<0.05)，見圖2。

圖1　神經(jīng)功能損傷評(píng)分

注：1.假手術(shù)+生理鹽水組；2.假手術(shù)+抗壞血酸組；3.打擊+生理鹽水組；4.打擊+抗壞血酸組；*：與1、2、4組比較；#：與3組比較。

圖2　SOD的活力

注：1.假手術(shù)+生理鹽水組；2.假手術(shù)+抗壞血酸組；3.打擊+生理鹽水組；4.打擊+抗壞血酸組；*：與1、2組比較；#：與3組比較。

2.3CYP2E1的含量與假手術(shù)+生理鹽水和假手術(shù)+抗壞血酸組相比，打擊+生理鹽水組和打擊+抗壞血酸組CYP2E1表達(dá)明顯增加(P<0.05)；而與打擊+生理鹽水組比，打擊+抗壞血酸組CYP2E1表達(dá)減少(P<0.05)，見圖3。

圖3　CYP2E1的含量

注：1.假手術(shù)+生理鹽水組；2.假手術(shù)+抗壞血酸組；3.打擊+生理鹽水組；4.打擊+抗壞血酸組 ；*：與1、2組比較；#：與3組比較。

2.4MMP-9的含量 與假手術(shù)+生理鹽水和假手術(shù)+抗壞血酸組相比，打擊+生理鹽水組和打擊+抗壞血酸組MMP-9表達(dá)明顯增加(P<0.05)；而相對(duì)于打擊+生理鹽水組比，打擊+抗壞血酸組MMP-9表達(dá)減少(P<0.05)，見圖4。

圖4　MMP-9的含量

注：1.假手術(shù)+生理鹽水組；2.假手術(shù)+抗壞血酸組；3.打擊+生理鹽水組；4.打擊+抗壞血酸組；*：與1、2組比較；#：與3組比較。

2.5Occludin蛋白的含量與假手術(shù)+生理鹽水和假手術(shù)+抗壞血酸組相比，打擊+生理鹽水組和打擊+抗壞血酸組Occludin蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)；而相對(duì)于打擊+生理鹽水組比，打擊+抗壞血酸組Occludin蛋白表達(dá)增多(P<0.05)，見圖5。

注：1.假手術(shù)+生理鹽水組；2.假手術(shù)+抗壞血酸組；3.打擊+生理鹽水組；4.打擊+抗壞血酸組；*：與1，2組比較；#：與3組比較。

圖5　Occludin蛋白的含量

注：1.假手術(shù)+生理鹽水組;2.假手術(shù)+抗壞血酸組;3.打擊+生理鹽水組;4.打擊+抗壞血酸組。

3討論

顱腦創(chuàng)傷致殘、致死率高,給家庭，社會(huì)及醫(yī)療保健體系帶來很重的負(fù)擔(dān)。因此近期的研究主要集中于研究顱腦創(chuàng)傷后的繼發(fā)性腦損傷，尤其是缺血缺氧性損傷[5]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，打擊+生理鹽水組的神經(jīng)功能損傷評(píng)分，CYP2E1表達(dá)量，基質(zhì)金屬蛋白酶-9的含量明顯高于假手術(shù)+生理鹽水組和假手術(shù)+抗壞血酸組；SOD活力，血腦屏障緊密連接蛋白含量則明顯降低。而打擊+抗壞血酸組在給予抗壞血酸治療后，神經(jīng)功能損傷評(píng)分，CYP2E1表達(dá)量，基質(zhì)金屬蛋白酶-9的含量均明顯降低；SOD活力，血腦屏障緊密連接蛋白含量則升高。說明抗壞血酸能夠抑制血腦屏障的破壞程度，減緩了神經(jīng)元的死亡，減輕了顱腦創(chuàng)傷后繼發(fā)性腦損傷的進(jìn)一步發(fā)展。

自由基是一類包含未配對(duì)電子的化學(xué)物質(zhì)，包括超氧陰離子，羥自由基等，在機(jī)體正常狀態(tài)下，其產(chǎn)生和消耗處于動(dòng)態(tài)平衡之中[6]。外傷性腦損傷后，在前列腺素等的作用下，自由基含量迅速增加，對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生破壞。而超氧化物歧化酶(SOD)是腦內(nèi)重要的清除自由基物質(zhì)，其活力與自由基的清除呈正比[7]。從本實(shí)驗(yàn)可以看出，打擊后腦組織中SOD活力迅速降低，反映了自由基增加迅速，加重了繼發(fā)性腦損傷。而抗壞血酸可以增加SOD的活力，減少自由基的產(chǎn)生，對(duì)顱腦創(chuàng)傷起到了較好的保護(hù)作用。

MMP-9在腦組織中由神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，它是一種能夠分解緊密連接和細(xì)胞基底層等細(xì)胞外基膜的蛋白酶體[8]，其過度表達(dá)的結(jié)果是破壞了血腦屏障的完整性，研究表明[9]，MMP-9的表達(dá)與外傷后腦水腫的程度呈正比。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說明了抗壞血酸可以抑制MMP-9的表達(dá)，減少血腦屏障緊密連接的分解及完整性的破壞，減輕腦水腫。

Occludin蛋白是一種存在于腦內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接跨膜蛋白，它的作用是維持緊密連接復(fù)合體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和功能的正常發(fā)揮，而這種緊密連接復(fù)合體也是血腦屏障的核心結(jié)構(gòu)。研究表明[10]，Occludin蛋白的高表達(dá)可以降低血腦屏障的通透性，維持其物理屏障功能[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，說明了抗壞血酸可以增加Occludin蛋白的表達(dá)，減少緊密連接結(jié)構(gòu)和功能的變化，降低血腦屏障通透性，減輕腦水腫。

CYP2E1是細(xì)胞色素氧化酶P450的重要成員，催化前致癌物質(zhì)和前毒物轉(zhuǎn)化為致癌物和有毒物。經(jīng)國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)[12]，CYP2E1對(duì)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸具有較高的氧化活性，可不依賴配體產(chǎn)生自由基，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞。在創(chuàng)傷性腦外傷的發(fā)展中，CYP2E1的存在導(dǎo)致產(chǎn)生更多的氧自由基，進(jìn)一步加重了繼發(fā)性腦損傷。

抗壞血酸是一種抗氧化劑，可以保護(hù)其它抗氧化劑，防止自由基對(duì)人體的傷害。本試驗(yàn)結(jié)果表明，打擊后大鼠的CYP2E1表達(dá)明顯增加，而在給予抗壞血酸藥物后，大鼠的CYP2E1表達(dá)減少?；谝陨辖Y(jié)果，可以猜測(cè)抗壞血酸中可能含有CYP2E1抑制物，使用抗壞血酸后，CYP2E1的表達(dá)減少，氧自由基的產(chǎn)生減少，減少了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，保護(hù)血腦屏障，減輕腦水腫，防止神經(jīng)元膜結(jié)構(gòu)的破壞，減輕顱腦創(chuàng)傷后的繼發(fā)性腦損傷。其對(duì)外傷性腦損傷保護(hù)作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)可能是CYP2E1。

4結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果說明，抗壞血酸對(duì)減輕繼發(fā)性顱腦損傷加重的作用機(jī)制可能為對(duì)CYP2E1產(chǎn)生了抑制作用，導(dǎo)致氧自由基的產(chǎn)生減少，對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破環(huán)降低，減輕了血腦屏障的破壞開放，為抗壞血酸進(jìn)一步應(yīng)用于臨床治療提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為顱腦損傷的臨床治療提供了新思路，但其中具體的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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Mechanisms of ascorbic acid reducing secondary brain injury in rats

ZHANG Hao1, MAO Xiang1, LIU Bai-yun1，2

(1.GeneralHospitalofArmedPoliceForces,Beijing100039,China;

2.DepartmentofNeurosurgery,CapitalMedicalUniversity,Beijing100050，China)

Abstract:Objective To investigate the effect of ascorbic acid on reducing secondary brain injury caused by traumatic brain injury and its possible mechanism.MethodsRats were randomly assigned into sham + saline group, sham + ascorbic acid group, hit + saline group and hit + ascorbic acid group, 12 in each group. Moderate traumatic brain injury model was established,and 24 hours later TBI neurological injury score was graded. The activity of superoxide dismutase in brain tissue was measured by ELISA. Western blot was used to determine the expressions of P450(CYP2E1), MMP-9 and Occludin in the tissue of the damaged brain 24 hours after the traumatic brain injury.ResultsCompared with the hit + saline group, in the blow + ascorbic acid group the trauma was significantly alleviated, the activity of SOD increased, the expression of CYP2E1 decreased, MMP-9 reduced and Occludin increased. ConclusionsAscorbic acid can alleviate the secondary brain injury by reducing the destruction of blood brain barrier, the mechanism of which is to inhibit the expression of CYP2E1.

Key words:traumatic brain injury；ascorbic acid;CYP2E1;oxidative stress

收稿日期：(2015-08-22，修回日期：2015-11-27)

通信作者：劉佰運(yùn)，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)創(chuàng)傷，E-mail:liubaiyun1212@163.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(No 81471238)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.007