新型2-溴苯酰胺類小分子CCR5拮抗劑的合成及其GTPγS結(jié)合性

程德軍， 黃　斌， 楊　郭

(四川理工學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，四川 自貢　643000)

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新型2-溴苯酰胺類小分子
CCR5拮抗劑的合成及其GTPγS結(jié)合性

程德軍， 黃斌， 楊郭*

(四川理工學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，四川 自貢643000)

摘要：以2-羥基-5-溴苯甲醛為起始原料，經(jīng)取代,還原和NBS溴化反應(yīng)制得5-溴-2-(4-氯苯甲氧基)溴甲苯(3)；以4-哌啶酮鹽酸鹽為原料，經(jīng)保護(hù),還原和縮合反應(yīng)制得N-烯丙基-2-溴-N-哌啶基苯酰胺(7)； 3和7經(jīng)取代反應(yīng)合成了一個(gè)新型的非肽類小分子CCR5拮抗劑——N-烯丙基-2-溴-N-{N-[2-(4-氯苯甲氧基)-5-溴芐基]-4-哌啶基}苯酰胺(8)，總產(chǎn)率32.5%,其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，13C NMR， IR和ESI-MS表征。用GTPγS法測試了8的生物結(jié)合性。結(jié)果表明：8的生物結(jié)合性與TD0232接近，其IC50為(8.12±0.3) nmol·L-1。

關(guān)鍵詞：2-羥基-5-溴苯甲醛; 5-溴-2-(4-氯苯甲氧基)溴甲苯;N-烯丙基-2-溴-N-哌啶基苯酰胺; CCR5拮抗劑; 非肽類小分子； 合成； GTPγS結(jié)合性

通信聯(lián)系人： 楊郭，副教授， E-mail: yangguo0813@163.com

近年來，趨化因子受體CCR5作為介導(dǎo)HIV-1病毒進(jìn)入細(xì)胞的研究受到生物醫(yī)學(xué)工作者的廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，具有特定結(jié)構(gòu)的非肽類小分子化合物可以與趨化因子RANTES競爭性地結(jié)合CCR5，使CCR5發(fā)生特定的基因突變[1]，使抑制趨化因子受體CCR5與巨噬細(xì)胞炎癥蛋白MIP-1α結(jié)合，用于治療人類感染HIV-1[2-4]。日本Takeda Chemical Industries公司開發(fā)的TAK-652和美國Schering-Plough公司開發(fā)的SCH-D已進(jìn)入臨床III期研究。這類突變基因型非肽類小分子化合物作為一種新型的CCR5拮抗劑具有很大的開發(fā)潛力。

一般來說，突變基因型非肽類小分子化合物只能結(jié)合單一位點(diǎn)的CCR5，效果有限。為增加苯酰胺類小分子的結(jié)合位點(diǎn)，提高CCR5拮抗劑的生物結(jié)合性，在分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)作如下考慮[5]：酰胺結(jié)構(gòu)和哌啶結(jié)構(gòu)中含有叔氮原子，連接基團(tuán)為哌啶環(huán)狀結(jié)構(gòu)，引入疏水基團(tuán)。

本文依據(jù)活性結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)原理，以2-羥基-5-溴苯甲醛為起始原料，經(jīng)取代、還原和NBS溴化反應(yīng)制得5-溴-2-(4-氯苯甲氧基)溴甲苯(3)；以4-哌啶酮鹽酸鹽為原料，經(jīng)保護(hù)、還原和縮合反應(yīng)制得N-烯丙基-2-溴-N-哌啶基苯酰胺(7)； 3和7經(jīng)取代反應(yīng)合成了一個(gè)新型的非肽類小分子CCR5拮抗劑——N-烯丙基-2-溴-N-{N-[2-(4-氯苯甲氧基)-5-溴芐基]-4-哌啶基}苯酰胺(8， Scheme 1)，總產(chǎn)率32.5%,其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，13C NMR， IR和ESI-MS表征。用GTPγS法[7]測試了8的生物結(jié)合性。結(jié)果表明：8的生物結(jié)合性與TD0232接近，其IC50為(8.12±0.3) nmol·L-1。

Scheme 1

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

Bruker AV 600 MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；TENSOR27型傅立葉變換紅外光譜儀(KBr壓片)；AGILENT MSD VL型質(zhì)譜儀。

1~3按文獻(xiàn)[8]方法合成；GDP, GTPγS和[35S]GTPγS(1 200 Ci·mmol-1), Sigma公司；CHO-K1細(xì)胞(ATCC)，DuPont-NewEngland Nuelear公司。

1.2合成

(1)N-Boc-哌啶酮(4)的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入丙酮60 mL，水360 mL和4-哌啶酮鹽酸鹽18.30 g(0.12 mol)，攪拌下緩慢滴加二碳酸二叔丁酯27.50 g(0.13 mol)的丙酮(60.0 mL)溶液，滴畢，回流反應(yīng)12 h。蒸除溶劑，殘余物加水30 mL，用乙酸乙酯(2×40 mL)萃取，合并萃取液，蒸除溶劑得白色固體4 22.81 g，產(chǎn)率95.4%， m.p.86.8~88.3 ℃;1H NMRδ: 1.46(s, 9H, CH3), 2.56(t,J=7.1 Hz, 4H, CH2), 3.74(t,J=7.1 Hz, 4H, CH2); ESI-MSm/z: 299.26[M+]。

(2) 4-烯丙胺-N-Boc哌啶(5)的合成[9]

在反應(yīng)瓶中依次加入3-氨基丙烯1.95 g(34 mmol)， 4 2.38 g(30 mmol)， THF 80.0 mL和甲醇12.0 mL，攪拌20 min；緩慢滴加三乙酰氧基硼氫化鈉(STAB)9.50 g(45 mmol)，滴畢，于室溫反應(yīng)至終點(diǎn)。冷卻至室溫，倒入30.0 mL水中，用乙酸乙酯(150 mL)萃取，水層調(diào)至pH 10后用乙酸乙酯(100 mL)萃取，合并萃取液，蒸除溶劑得黃色油狀液體5 5.60 g，產(chǎn)率78.1%；1H NMRδ: 1.61(s, 9H, CH3), 1.72~1.86(m, 4H, CH2), 2.72(m, 1H, CH), 3.22(m, 2H, CH2), 3.38(s, 1H, NH), 3.51~3.65(m, 4H, CH2), 5.63(m, 1H, C=CH), 5.91(m, 1H, C=CH); ESI-MSm/z: 240.15[M+]。

(3)N-烯丙基-2-溴-N-(N-Boc哌啶基)苯酰胺(6)的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入CH2Cl225 mL， 1-羥基苯并三唑(HOBT)0.60 g和2-溴苯甲酸1.20 g(6 mmol)，攪拌30 min；加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)0.80 g和5 1.21 g(5 mmol)，回流反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC檢測)。倒入50.0 mL水中，用二氯甲烷(2×50 mL)萃取，合并萃取液，用飽和食鹽水洗滌，濃縮后經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：A=V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)=10 ∶1]純化得黃色油狀液體6 1.67 g，產(chǎn)率79.1%；1H NMRδ: 1.47(s, 9H, CH3), 1.82~1.96(m, 4H, CH2), 3.33~3.47(m, 4H, CH2), 3.68(m, 1H, CH), 3.89(m, 1H, CH), 5.10(m, 2H, CH), 5.80(m, 1H, C=CH), 7.32~7.60(m, 4H, ArH); ESI-MSm/z: 445.31, 447.27{[M+Na]+}。

(4) 7的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入二氯甲烷15.0 mL， 6 1.27 g(3 mmol)和三氟乙酸(TFA)2.00 mL，攪拌下回流反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC檢測)。蒸除溶劑，殘余物加入二氯甲烷15.0 mL，蒸除殘余TFA，加入乙酸乙酯80 mL，過濾，濾液用飽和食鹽水洗滌，蒸除溶劑得無色油狀液體7 0.73 g，產(chǎn)率85.8%；1H NMRδ: 1.29~1.35(m, 4H, CH2), 2.20(s, 1H, NH), 2.52~2.61(m, 4H, CH2), 3.74(m, 1H, CH), 3.91(m, 2H, CH2), 5.41(m, 2H, C=CH), 5.88(m, 1H, C=CH), 7.50(m, 2H, ArH), 7.75(m, 1H, ArH), 7.85(m, 1H, ArH);13C NMRδ: 30.7, 44.8, 49.2, 63.3, 116.3, 119.4, 126.5, 128.9, 132.8, 134.7, 138.5, 164.2; ESI-MSm/z: 322.12, 322.16[M+]。

(5) 8的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入DMF 15.0 mL，碳酸鉀0.17 g， 3 0.40 g(1 mmol)和7 0.32 g(1 mmol)，攪拌下回流反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC檢測)。倒入50 mL水中，搖勻，用乙酸乙酯(2×100 mL)萃取，合并萃取液，用飽和食鹽水洗滌，濃縮后經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=10 ∶1)純化得白色固體8 0.43 g，產(chǎn)率78.3%， m.p.380.5~385.1 ℃；1H NMRδ: 1.42~1.47(m, 4H, 16,18-H), 1.58~1.68(m, 4H, 15,19-H), 3.65(m, 1H, 17-H), 3.97(s, 2H, 14-H), 4.10(m, 2H, 20-H), 5.27(s, 2H, 7-H), 5.36(m, 2H, 22-H), 6.16(m, 1H, 21-H), 6.61~6.72(m, 5H, 3,5,10,12,13-H), 7.23~7.35(m, 4H, 2,6,27,28-H), 7.78(dd,J=2.5 Hz, 9.5 Hz, 1H, 26-H), 7.92(dd,J=2.5 Hz, 9.5 Hz, 1H, 29-H) ;13C NMRδ: 29.6, 30.1, 30.2, 32.0, 45.2, 46.6, 52.7, 53.5, 55.9, 57.8, 69.7, 113.7, 116.9, 118.3, 119.7, 122.2, 124.6, 128.7, 128.4, 129.3, 129.8, 130.2, 130.9, 131.8, 132.8, 133.6, 133.9, 134.2, 134.6, 134.9, 135.6, 141.5, 154.7, 167.4, 169.1; IRν: 3 078(C-H), 1 665(C=O), 1 614, 1 565, 1 474(C=C), 1 262(C-O-C) cm-1; ESI-MSm/z: 630.16, 632.10[M+]。

1.3GTPγS活性測定[10]

配制緩沖液(10 mmol·L-1EDTA， 10 mmol·L-1Tris-HCl和10 mmol·L-1EGTA)，調(diào)至pH 7.5，加入CHO-K1細(xì)胞，混合均勻；用胰島素針筒抽吸5次，離心，濾渣加入緩沖液體系(pH 7.5, 1.0 mmol·L-1EDTA， 5.0 mmol·L-1MgCl2， 100 mmol·L-1NaCl和50 mmol·L-1Tris-HCl)中，加入10 nmol·L-1[35S]GTPγS和50 mmol·L-1GDP，于30 ℃溫育，分別加入TD-0232[11]和8，當(dāng)被測物抑制率為50%時(shí)，測定液閃計(jì)數(shù)。

2結(jié)果與討論

2.1合成

參照文獻(xiàn)[11]方法，采用Boc保護(hù)哌啶氮原子的方法，以2-羥基-5-溴苯甲醛為起始原料合成了8，總產(chǎn)率32.5%。該方法路線較短，反應(yīng)條件較溫和。

8符合預(yù)期設(shè)計(jì)要求，即酰胺結(jié)構(gòu)和哌啶結(jié)構(gòu)中含有叔氮原子，在生理pH值條件下均可質(zhì)子化，形成具有生物活性的季氮原子；中間連接結(jié)構(gòu)為環(huán)狀哌啶基；引入疏水基團(tuán)(溴原子和氯原子)，增強(qiáng)了受體結(jié)合性。

2.2GTPγS活性

用Sigmaplot繪圖計(jì)算8的IC50為(8.12±0.3) nmol·L-1，與TD-0232[IC50=(3.1±0.3) nmol·L-1]接近。

此外，通過[35S]GTPγS結(jié)合實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn), 當(dāng)被測物抑制率達(dá)到50%時(shí)，8與TD0232均可激活CHO-K1細(xì)胞膜上的蛋白, 說明8能與膜上某種“受體”結(jié)合，進(jìn)入胞質(zhì)溶膠，直接使核糖體失活, 從而抑制蛋白質(zhì)合成并導(dǎo)致CHO-K1細(xì)胞死亡。因此，與TD0232作用機(jī)理類似，8也可通過與趨化因子RANTES競爭性地結(jié)合CCR5，使CCR5發(fā)生特定的基因突變，進(jìn)而預(yù)防人類感染HIV-1病毒。

3結(jié)論

合成了2-溴苯酰胺類小分子拮抗劑——N-烯丙基-2-溴-N-(1-(2-(4-氯苯甲氧基)-5-溴芐基)-4-哌啶基)苯酰胺(8)。8的[35S]GTPγS活性[IC50=(8.12±0.3) nmol·L-1]與抗艾滋藥TD0232接近。

8的合成路線較短，產(chǎn)率較高，成本較低，有望作為抗HIV-1藥物開發(fā)的候選藥物。

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Synthesis and GTPγS Binding Activity of

Novel 2-Bromo-benzamides Small Molecule CCR5 Antagonists

CHENG De-jun,HUANG Bin,Yang Guo*

(College of Materials and Chemical Engineering， Sichuan University of Science and Engineering， Zigong 643000, China)

Abstract：5-Bromo-1-[(4-chlorobenzyl)oxy]-2-bromotoluene(3) was obtained by substitution reaction, reduction and NBS bromination from 5-bromo-2-hydroxybenzaldehyde.N-allyl-2-bromo-N-(4-piperidinyl)benzamide(7) was prepared by protection, reduction and condensation reaction from 4-piperidone hydrochlorid. A novel non-peptide small molecule compound,N-allyl-2-bromo-N-【1-{2-[(4-chlorobenz)oxyyl]-5-bromobenz}-4-piperidin】 benzamide(8) with total yield of 32.5%, was synthesized by substitution reaction of 3 with 7. The structure was characterized by1H NMR，13C NMR， IR and ESI-MS. The biological activity of 8 was detected by the SPA GTPγS assay. The results indicated that the biological binding activity of 8 approach to TD0232 with IC50of (8.12±0.3) nmol·L-1.

Keywords：5-bromo-2-hydroxybenzaldehyde; 5-bromo-1-[(4-chlorobenzyl)oxy]-2-bromotoluene;N-allyl-2-bromo-N-(4-piperidinyl)benzamide; CCR5 antagonist; non-peptide small molecular; synthesis; GTPγS binding activity

作者簡介：程德軍(1976-)男，漢族，四川仁壽人，碩士，主要從事藥物合成的研究。 E-mail: 80131515@163.com

基金項(xiàng)目：四川省教育廳科研項(xiàng)目(15ZB0215)； 四川省自貢市重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014ZC01)

收稿日期：2015-10-28;

修訂日期：2015-12-23

中圖分類號(hào)：O621.3； R914.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.02.15358