慢性粒細(xì)胞白血病患者外周血Bmi1 mRNA的表達(dá)水平

葛　熙,趙　枰,周　峰,胡忠圣

(南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇南通 226001)

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·臨床研究·

慢性粒細(xì)胞白血病患者外周血Bmi1 mRNA的表達(dá)水平

葛熙,趙枰,周峰,胡忠圣

(南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇南通 226001)

摘要:目的采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Rt-PCR)檢測(cè)Bmi1基因表達(dá)的方法，了解慢性粒細(xì)胞白血病(CML)患者外周血Bmi1基因的表達(dá)水平。方法采用Rt-PCR方法檢測(cè)CML患者41例和10例健康人外周血中Bmi1基因的表達(dá)水平。結(jié)果Rt-PCR的結(jié)果顯示，基因Bmi1在健康人、CML患者慢性期、加速期及急變期中的表達(dá)相對(duì)值分別為0.544±0.233、1.624±0.632、3.021±0.923及3.561±1.005。CML患者中Bmi1的表達(dá)水平明顯高于健康人(P<0.05)，加速期及急變期中Bmi1的表達(dá)水平明顯高于慢性期，急變期Bmi1的表達(dá)水平明顯高于加速期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論Bmi1基因在CML外周血中有高水平的表達(dá)，是監(jiān)測(cè)CML患者病情進(jìn)展及判斷預(yù)后有價(jià)值的分子標(biāo)記物。

關(guān)鍵詞:白血病;Bmi1;實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

慢性粒細(xì)胞白血病(CML)是血液系統(tǒng)惡性腫瘤之一，起源于造血干細(xì)胞。臨床上一般分為三期：慢性期、加速期和急變期。CML是臨床治療過程中引起死亡的主要原因。關(guān)于CML 急變的機(jī)制仍不明確。Bil1基因是干細(xì)胞自我更新的關(guān)鍵調(diào)控因子，在血液腫瘤發(fā)病機(jī)制和治療等方面具有較高的潛在價(jià)值，Bmi1基因表達(dá)增高的病例更易轉(zhuǎn)變?yōu)榧毙园籽1]。如何準(zhǔn)確測(cè)定外周血BMI1基因的表達(dá)水平以指導(dǎo)臨床治療，是許多臨床工作者關(guān)注的問題，因此，我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Rt-PCR)技術(shù)檢測(cè)了CML患者外周血Bmi1基因的表達(dá)水平，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料2010年1月至2014年12月在南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院就診的門診和住院部CML患者41例納入研究組，其中男29例，女12例，年齡42～79歲。所有患者均經(jīng)臨床、血象、骨髓象及組織化學(xué)染色檢查，符合1981年FAB協(xié)作組提出的分類診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中急性變9例，加速期6例，慢性期26例。同期本院體檢健康志愿者10例納入對(duì)照組，其中男7例，女3例，年齡48～70歲。

1.2方法

1.2.1RNA的提取及cDNA合成采集2 mL靜脈血，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，加于等量的人淋巴細(xì)胞分離液上，以2 000 r/min離心15 min，分離單個(gè)核細(xì)胞，用吸管吸取，提取外周血總RNA(提取總RNA 試劑盒為美國Invitrogen公司提供)，測(cè)A260、A280吸光度值，計(jì)算出RNA水平，使用Promega逆轉(zhuǎn)錄劑盒，按說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2Bmi1基因表達(dá)的檢測(cè)Rt-PCR 1 μL 稀釋的模板，2 μL引物對(duì)(5 μM)，7 μL 無菌去離子水，反應(yīng)混合溶液共10 μL。每種引物，每種模板，都做3個(gè)平行管反應(yīng)。引物設(shè)計(jì) Bmi1 引物對(duì)為5′-ATT CTA CCA GTC CCG AGG TTT G-3′，5′-GGT TCA ACT GCT CAT CAT AGC G-3′；內(nèi)參基因GAPDH引物對(duì)為，5′-CAT CCA TGA CAA CTT TGG TAT C-3′，5′-CCA TCA CGC CAC AGT TTC-3′。Rt-PCR 反應(yīng)程序：95 ℃10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。循環(huán)40次。取3個(gè)平行孔Ct比值的平均數(shù)，計(jì)算同一個(gè)樣品Bmi1的Ct值與GAPDH的Ct值比值，作圖時(shí)將正常對(duì)照的Ct比值平均數(shù)設(shè)為1.0，計(jì)算出所有樣品的相對(duì)值后制圖。儀器為Applied Biosystems，ABI7500 型Rt-PCR儀。

2結(jié)果

41例CML患者Bmi1基因的表達(dá)水平顯示，Bmi1基因表達(dá)水平在急變期時(shí)高于加速期，慢性期時(shí)表達(dá)水平最低，3組間的表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1　　41例CML患者Bmi1基因的表達(dá)水平

*：P<0.05，與對(duì)照組比較；#：P<0.05，與研究組慢性期比較；△：P<0.05，與研究組加速期比較。

3討論

1991年荷蘭癌癥中心的學(xué)者們?cè)趯?duì)小鼠淋巴瘤進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)了癌基因——Bmi1基因，開始被認(rèn)為是癌基因C-myc的協(xié)同基因，把它歸屬于多梳基因PcG家族；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)人類的Bmi1基因定位于10號(hào)染色體的短臂1區(qū)3帶(10p13)，該區(qū)域與惡性淋巴瘤和兒童白血病的染色體移位有關(guān)，研究還發(fā)現(xiàn)Bmi1基因與干細(xì)胞成長(zhǎng)調(diào)控，細(xì)胞分化及惡性病變密切相關(guān)[2-7]。此外，Bmi1基因在細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、細(xì)胞的永生化和衰老方面也發(fā)揮著重要作用[8-9]。Bmi1基因還可通過作用于PcG 家族中的某些靶位，使靶基因轉(zhuǎn)錄沉默。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，首先Bmi1表達(dá)陽性的小鼠其外周血中白血病細(xì)胞的數(shù)量明顯高于Bmi1表達(dá)陰性的小鼠[10]；其次，將Bmi1缺失小鼠的骨髓細(xì)胞移植給受者小鼠，這些小鼠不發(fā)生急性髓系白血病，然而將Bmi1轉(zhuǎn)染給原本Bmi1缺失的小鼠骨髓細(xì)胞中，然后再移植給受者小鼠，受者小鼠則可發(fā)生急性髓系白血病，上述研究表明Bmi1對(duì)白血病干細(xì)胞的增殖和其致白血病的能力具有決定性作用。研究還發(fā)現(xiàn)[11-12]，急性白血病患者的骨髓中Bmi1的表達(dá)水平明顯高于健康人，尤其是在急性髓細(xì)胞白血病微分化型的患者骨髓中，Bmi1的表達(dá)水平更高。通過實(shí)時(shí)R-PCR的方法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CML患者外周血中Bmi1基因的表達(dá)具有一定的規(guī)律性：急性變患者表達(dá)相對(duì)值在5的數(shù)量級(jí)，加速期患者其表達(dá)相對(duì)值在2的數(shù)量級(jí)，經(jīng)化療后轉(zhuǎn)入慢性期的患者其表達(dá)的相對(duì)值僅小于1的數(shù)量級(jí)，3者之間依次相差1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，表明Bmi1基因在CML患者外周血中的表達(dá)相對(duì)值是隨其白血病細(xì)胞數(shù)的減少而降低的。在CMI治療過程的不同時(shí)期，Bmi1基因的表達(dá)相對(duì)值存在明顯差異，因而外周血中Bmi1基因檢測(cè)可作為監(jiān)測(cè)CML病情進(jìn)展及判斷預(yù)后的有價(jià)值的分子標(biāo)記物。

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(收稿日期：2015-11-20)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.03.041

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)03-0382-02