• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    Dock2通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性和抗原特異性IgG抗體的產(chǎn)生來控制腸道檸檬酸桿菌感染

    2021-05-28 05:59:12孟凡陳峻劉雨霞謝璐李子俊劉志平
    實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志 2021年8期
    關(guān)鍵詞:檸檬酸脾臟結(jié)腸炎

    孟凡 陳峻 劉雨霞 謝璐 李子俊 劉志平,

    1贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(江西贛州341000);2贛南醫(yī)學(xué)院2019級研究生(江西贛州341000),3贛南醫(yī)學(xué)院心腦血管防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室炎癥與免疫中心(江西贛州341000);4贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(江西贛州341000);5南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床分委會,廣東省人民醫(yī)院(廣州510000)

    細(xì)胞分裂貢獻(xiàn)者2(Dedicator of cytokinesis 2,Dock2)是鳥嘌呤核苷酸交換因子家族的成員,它可以激活小G蛋白Rac,調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重組[1-2]。Dock2似乎僅在造血細(xì)胞如嗜中性粒細(xì)胞,淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中表達(dá)[3]。Dock2對于免疫細(xì)胞(包括T細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、B細(xì)胞、胸腺細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞)的遷移至關(guān)重要[4-6]。Dock2?Rac通過影響突觸的形成來控制NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性[7]。Dock2還顯示出通過下調(diào)IL?4Rα表面表達(dá)來抑制Th2譜系發(fā)育,從而抑制了由利什曼原蟲感染引起的足墊腫脹[8]。Dock2可能是控制移植排斥和阿爾茨海默病的分子靶標(biāo)[9-10]。此外,實(shí)驗(yàn)室前期研究表明,Dock2在抵抗鼠類檸檬酸桿菌(citrobacter rodentium)感染引起的早期結(jié)腸炎中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[11]。

    檸檬酸桿菌感染是一種常用于研究結(jié)腸炎形成的模型[12-13]。檸檬酸桿菌是腸道桿狀菌革蘭氏陰性菌,是黏附/擦拭(attaching and effacing,A/E)病原體家族的成員[14],因此也可用于研究臨床上重要的人類病原體(例如引起大量腹瀉的腸病原性和腸出血性大腸桿菌)的發(fā)病機(jī)制[15-16]。前期研究表明,Dock2-/-小鼠對檸檬酸桿菌感染比野生型(Wild?type,WT)小鼠更為易感。在感染后第14天,Dock2-/-小鼠具有更嚴(yán)重的死亡率、體質(zhì)量損失、細(xì)菌負(fù)荷、結(jié)腸縮短和組織學(xué)損害等結(jié)腸炎相關(guān)指標(biāo)。進(jìn)一步研究表明Dock2的缺乏并不會導(dǎo)致感染早期保護(hù)性促炎細(xì)胞因子和抗菌肽的產(chǎn)生減少。在感染后14 d Dock2-/-小鼠腸道中的巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞從粘膜下層遷移至黏膜層存在缺陷,這可能直接影響宿主對檸檬酸桿菌感染的易感性[11]。但是,在宿主對抗檸檬酸桿菌感染的適應(yīng)性免疫中Dock2的功能仍然未知。研究檸檬酸桿菌感染后期淋巴細(xì)胞變化與細(xì)菌清除率之間的關(guān)系,并進(jìn)一步探索可能影響宿主對檸檬酸桿菌敏感性的其他因素,將對結(jié)腸炎的治療提供重要思路。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Dock2-/-小鼠由日本九州大學(xué)Yo?shinori Fukui博士提供。TCRa-/-小鼠購自The Jack?son Laboratory。C57BL/6小鼠用作WT對照。所有動(dòng)物程序均遵循贛南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物使用和倫理委員會批準(zhǔn)的方案。

    1.2 檸檬酸桿菌感染檸檬酸桿菌購于ATCC(ATCC#51459。挑取檸檬酸桿菌置于LB肉湯中37℃搖震蕩培養(yǎng)8~9 h。小鼠感染前禁食8 h,然后以1×1010CFU/小鼠的濃度通過灌胃方式感染。為確定感染情況,將糞便,脾臟,腸系淋巴結(jié)(mesenter?ic lymph nodes,MLN)和肝臟勻漿,用1×PBS梯度稀釋,種板于麥康凱瓊脂平板上,37℃孵育24 h,計(jì)算各載菌量。

    1.3 組織學(xué)分析取結(jié)腸組織固定、包埋、切片,H/E染色觀察病理學(xué)變化;CD3、IgA、F4/80和Gr?1抗體分別對T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞進(jìn)行染色,觀察結(jié)腸免疫細(xì)胞浸潤。

    1.4 促炎細(xì)胞因子分析利用含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液將結(jié)腸組織勻漿,ELISA檢測結(jié)腸組織和血清中的細(xì)胞因子IFN?γ,TNF?α,KC,MCP?1,MIP?2,IL?6和IL?17的蛋白表達(dá)水平。

    1.5 抗原特異Ig抗體分析利用ELISA法檢測特異于檸檬酸桿菌的血清抗體產(chǎn)生[17]。將加熱滅活的檸檬酸桿菌包被在ELISA板上,封閉后加入血清樣本,室溫下孵育2 h。檢測血清中IgM,IgG,IgG1,IgG2b,IgG2c和IgG3的含量,用3,3′,5,5′′?四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯影并讀取450 nm的OD值。

    1.6 結(jié)腸固有層淋巴細(xì)胞(lamina propria lym?phocytes,LPL)的分離分離結(jié)腸LPL的方法如前所述[18]。用預(yù)冷PBS洗滌結(jié)腸并切成1 cm的小塊。然后將結(jié)腸與5 mmol/L EDTA和10 mmol/L HEPES在37℃孵育10 min,放入含有DNase I和膠原酶D的1640培養(yǎng)基中于37℃消化1 h。

    1.7 流式細(xì)胞儀分析取小鼠脾臟制成單細(xì)胞懸液。用CD11b、CD11c、Gr?1、CD4、CD19和CD8進(jìn)行染色。利用不同顏色的抗CD4用作補(bǔ)償對照。染色后,使用FACSCalibur(BD)上機(jī),F(xiàn)lowJo 10軟件分析細(xì)胞。

    1.8 T細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)取WT和Dock2-/-小鼠的脾臟,碾磨成單細(xì)胞,通過磁珠分選富集分離出T淋巴細(xì)胞(CD3+),眼靜脈注射入TCRa-/-小鼠(107/每個(gè)小鼠),分別用作TCRa-/-+WT組和TCRa-/-+Dock2-/-組。10 d后,TCRa-/-+WT和TCRa-/-+Dock2-/-小鼠分別灌胃感染1×1010CFU的檸檬酸桿菌,之后檢測體重。在感染后14 d,處死小鼠,測量結(jié)腸長度和重量,取結(jié)腸做組織切片并HE染色。收集血清,通過ELISA檢測的IgM,IgG,IgG1,IgG2b,IgG2c,IgG3和IgA3的水平。

    1.9 血清抗體轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)對Dock2-/-小鼠進(jìn)行C.rodentium感染。在感染后第3、4和5天,靜脈注射150 μL未感染的WT小鼠血清(D0血清)或者感染21 d的WT小鼠血清(D21血清)。檢測Dock2-/-+D0血清和Dock2-/-+D21血清小鼠在感染后的生存率。

    1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)。使用studentt檢驗(yàn)或單因素方差分析計(jì)算所有P值。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 Dock2在檸檬酸桿菌感染后期宿主清除致病菌中起重要作用與WT小鼠相比,Dock2-/-小鼠的體質(zhì)量下降明顯(圖1A)、結(jié)腸更短(圖1C)。測量了糞便和結(jié)腸組織中的病原體負(fù)擔(dān),發(fā)現(xiàn)在感染后21 d,WT小鼠清除了腸道所有的檸檬酸桿菌但Dock2-/-小鼠糞便中卻有107至108/g的細(xì)菌負(fù)荷(圖1B)。感染后21 d,收集肝臟,脾臟和MLN,分析各組織的活菌負(fù)荷。結(jié)果表明,感染后第21天Dock2-/-小鼠具有更高的檸檬酸桿菌負(fù)荷,并且小鼠結(jié)腸,脾臟,MLN和肝臟中細(xì)菌負(fù)荷的趨勢相似(圖1D?G)。組織學(xué)分析還顯示,在感染后14 d和21 d,Dock2-/-小鼠比WT小鼠具有更嚴(yán)重的組織學(xué)病變和更高的隱窩高度(圖1H?J)。

    2.2 感染晚期Dock2-/-小鼠中促炎細(xì)胞因子的過量產(chǎn)生感染21 d后,Dock2-/-小鼠的結(jié)腸組織和血清中細(xì)胞因子IFN?γ,TNF?α,KC,MCP?1,IL?6和IL?17的水平均顯著升高(圖1A?B;D?I;K?N)。MIP?2水平在Dock2-/-小鼠結(jié)腸組織中顯著升高(圖2C),但在血清中無明顯變化(圖2J)。

    2.3 檸檬酸桿菌感染后期Dock2-/-小鼠的炎癥細(xì)胞浸潤在檸檬酸桿菌感染21 d后,與WT相比,Dock2-/-小鼠結(jié)腸中的巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞浸潤更多(圖2A)。利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn),經(jīng)檸檬酸桿菌感 染21 d后,Dock2?/?小 鼠 的 結(jié) 腸和脾臟中樹突狀細(xì)胞(CD11b+CD11c+),髓樣細(xì)胞(CD11b+)和嗜中性粒細(xì)胞(CD11b+Gr?1+)細(xì)胞數(shù)比例更高(圖2B,C)。Ki67的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,與WT小鼠相比,Dock2-/-小鼠表現(xiàn)出更多的腸道上皮細(xì)胞增殖(圖2A)。

    圖1 Dock2在檸檬酸桿菌感染后期宿主清除致病菌中起重要作用Fig.1 Dock2 was required for host bacterial clearance after C.rodentium infection

    2.4 Dock2-/-小鼠在感染檸檬酸桿菌期間有T細(xì)胞缺陷Dock2-/-小鼠在感染前及感染后第14天,第21天的脾臟CD4+和CD8+細(xì)胞數(shù)量均顯著降低(圖2A?B)。除了CD8+CD69+T細(xì)胞(圖2H),感染后21 d Dock2-/-小鼠的脾臟中激活T細(xì)胞的數(shù)量少于WT小鼠(圖2C?G)。

    圖2 檸檬酸桿菌感染后WT和Dock2-/-小鼠結(jié)腸中的炎癥細(xì)胞浸潤Fig.2 Inflammatory cell infiltration in Dock2-/-mice after C.rodentium infection

    造血祖細(xì)胞在胸腺發(fā)育為成熟的T細(xì)胞。感染前,WT與Dock2-/-小鼠的胸腺大小相似,但Dock2-/-小鼠的胸腺中CD4+和CD8+細(xì)胞的百分比更低(圖3A?B)。感染14 d后,Dock2-/-小鼠的胸腺明顯縮小且細(xì)胞數(shù)較WT更少(圖3A?C)。此時(shí),胸腺細(xì)胞的組成急劇變化。與WT小鼠相比,Dock2-/-小鼠的CD4+和CD8+細(xì)胞的百分比略顯著降低,但CD4+CD8-,CD4-CD8+和CD4-CD8-細(xì)胞的百分率有所升高(圖3D?G)。在CD4-CD8-雙陰性(double?negative,DN)細(xì)胞中,Dock2-/-小鼠的DN第4階段(DN4)百分比顯著高于WT小鼠(圖3H),表明Dock2-/-胸腺細(xì)胞再生的缺陷可能始于DN4。

    2.5 感染了檸檬酸桿菌的Dock2-/-小鼠相對對照有更少的B細(xì)胞和抗原特異性IgG抗體的產(chǎn)生感染后第14天,在WT結(jié)腸中可見到許多B細(xì)胞,但是,Dock2-/-小鼠的結(jié)腸中幾乎沒有B細(xì)胞(圖4A?B),同時(shí)與WT相比Dock2-/-小鼠脾臟中的B細(xì)胞數(shù)量也明顯更低(圖4C)。這表明Dock2-/-小鼠感染部位的B細(xì)胞數(shù)量較少。

    本研究檢測了檸檬酸桿菌特異性血清抗體的產(chǎn)生,發(fā)現(xiàn)在感染后第14天及21天,Dock2-/-小鼠的血清中IgG水平均顯著低于WT小鼠,而IgM的水平則無明顯區(qū)別(圖4D?E)。盡管在感染后第21天,Dock2-/-小鼠有更嚴(yán)重的細(xì)菌負(fù)擔(dān)(圖1 B,D),但I(xiàn)gG,IgG1,IgG2b,IgG2c和IgG3的水平仍比WT小鼠低(圖4E?I)。

    圖3 檸檬酸桿菌感染后WT和Dock2-/-小鼠胸腺細(xì)胞概況Fig.3 Thymocyte profiles of WT and Dock2-/-mice after C.rodentium infection

    2.6 血清轉(zhuǎn)移和T細(xì)胞轉(zhuǎn)移對檸檬酸桿菌誘導(dǎo)的結(jié)腸炎具有抑制作用Dock2-/-小鼠中的T細(xì)胞在檸檬酸桿菌感染過程中存在缺陷(圖4A、B)。為了確定對Dock2-/-小鼠補(bǔ)充T細(xì)胞是否可以抑制檸檬酸桿菌誘導(dǎo)的結(jié)腸炎,分別將WT和Dock2-/-小鼠的T細(xì)胞注射到TCRa-/-小鼠體內(nèi)。在感染檸檬酸桿菌14 d后,TCRa-/-+Dock2-/-小鼠比TCRa-/-+WT小鼠的體質(zhì)量減輕更為嚴(yán)重(圖5A)。結(jié)腸縮短也更嚴(yán)重(圖5B),且具有更重的結(jié)腸重量(圖5C)和更高的組織學(xué)損傷評分(圖5D)。為確定補(bǔ)充性T細(xì)胞是否通過改變TCRa-/-小鼠血清中抗體的含量來抵抗檸檬酸桿菌感染所致結(jié)腸炎,測試了TCRa-/-+WT和TCRa-/-+Dock2-/-小鼠的IgG,IgG1,IgG2b,IgG2c,IgG3,IgA和IgM的水平。TCRa-/-+Dock2-/-小鼠中的IgG,IgG1,IgG2b,和IgG2c的水平低于TCRa?/?+WT小鼠的水平(圖5E,補(bǔ)圖3A?C)。IgG3,IgA和IgM的水平無顯著差異(補(bǔ)圖3D?F)。補(bǔ)充的T細(xì)胞可能部分通過增加IgG水平抑制結(jié)腸炎。

    為了測試補(bǔ)充WT小鼠血清中的抗體是否可以改變Dock2-/-小鼠結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度,將未感染的WT小鼠的血清(Dock2-/-+D0血清)和檸檬酸桿菌感染21 d后的WT小鼠血清(Dock2-/-+21 d血清),分別注入Dock2-/-小鼠體內(nèi)。與Dock2-/-+D0血清小鼠相比,Dock2-/-+21 d血清小鼠的存活率明顯提高(圖5F),表明檸檬酸桿菌感染后WT小鼠血清中的抗體具有緩解Dock2-/-小鼠結(jié)腸炎的作用。

    圖4 感染了檸檬酸桿菌的Dock2-/-小鼠體內(nèi)B細(xì)胞數(shù)量和抗體產(chǎn)生減少Fig.4 The decrease in B cells and antibody production in Dock2-/-mice infected with C.rodentium infection

    3 討論

    先前研究表明,Dock2-/-小鼠在檸檬酸桿菌感染后第14天表現(xiàn)出感染體征[11]。但是,感染后期Dock2在宿主清除腸道病原菌中的作用尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn),Dock2參與到檸檬酸桿菌感染后宿主清除細(xì)菌中。檸檬酸桿菌感染第21天,Dock2-/-小鼠產(chǎn)生了更多的促炎細(xì)胞因子,表現(xiàn)出更高的死亡率。腸道也有更強(qiáng)的巨噬細(xì)胞/嗜中性粒細(xì)胞浸潤。說明Dock2-/-小鼠的嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可以到達(dá)細(xì)菌病原體入侵的位置。但是,Dock2-/-小鼠在機(jī)體清除病原菌的過程中仍然存在嚴(yán)重缺陷。Dock2缺失引起的在檸檬酸桿菌感染中的細(xì)菌清除障礙的機(jī)制可能與Dock2-/-小鼠的T細(xì)胞缺陷、B細(xì)胞數(shù)量減少和特異性IgG抗體減少有關(guān)。且轉(zhuǎn)移含Dock2的T細(xì)胞和血清對檸檬酸桿菌誘導(dǎo)的結(jié)腸炎有保護(hù)作用。

    炎癥性腸?。╥nflammatory bowel diseases,IBDs)包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎,是一種病因不明的腸道炎癥,具有慢性、非特異性和復(fù)發(fā)性等特征[19]。IBDs是當(dāng)前世界的主要健康問題之一,發(fā)病率居高不下[20]。在過去的20年中,IBD的患病率在中國迅速增加,已成為中國常見的消化系統(tǒng)疾病之一[21]。IBD的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,可能與遺傳缺陷,免疫應(yīng)答功能障礙和腸道菌群紊亂有關(guān)[19,22]。有研究表明,IBD的發(fā)病可能與某些腸道細(xì)菌的過度生長和腸上皮細(xì)胞中的宿主基因缺陷有關(guān)[23]。然而,IBD的發(fā)病機(jī)理目前尚不明確。本研究的結(jié)果提示,Dock2可能參與對結(jié)腸炎或者IBD的調(diào)控。

    圖5 T細(xì)胞和血清轉(zhuǎn)移對結(jié)腸炎具有抑制作用Fig.5 T cell and serum transfer has inhibitory effects on colitis

    對食管腺癌和大腸癌患者的癌組織進(jìn)行全基因測序鑒定發(fā)現(xiàn)DOCK2基因發(fā)生高頻突變[24-25],這提示Dock2可能在維持粘膜表面穩(wěn)態(tài)中起重要作用。在5例合并免疫缺陷疾病的嬰兒患者中也發(fā)現(xiàn)了DOCK2突變。在趨化因子刺激下,T細(xì)胞中的Rac1活化受到抑制,且突變個(gè)體患有T細(xì)胞,B細(xì)胞和NK細(xì)胞的遷移缺陷,并且NK細(xì)胞的變性也受到影響[26]。這些研究的結(jié)果和本研究結(jié)果一致,提示調(diào)控Dock2的表達(dá)對于研究機(jī)體腸道功能及抗感染有重要作用。

    最近有研究表明,抑制Dock2可能抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化,并且Dock2可能是治療內(nèi)毒素血癥相關(guān)性急性肺損傷的新靶標(biāo)[27]。利用shR?NA下調(diào)Dock2的表達(dá)可導(dǎo)致B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖減弱,該機(jī)制可能與Dock2介導(dǎo)的Rac/ERK有關(guān)[28]。在前列腺癌細(xì)胞的增殖中,Dock2通過介導(dǎo)CXCL13/ERK/Akt信號通路起重要作用,這可能會成為治療前列腺癌的新靶標(biāo)[29]。本研究中確定了Dock2是宿主對抗檸檬酸桿菌感染的重要因子,并且對于腸道病原體感染后期的細(xì)菌清除至關(guān)重要,這與T細(xì)胞活性和抗原特異性IgG抗體產(chǎn)生的缺陷密切相關(guān)。但是Dock2-/-小鼠對檸檬酸桿菌感染的高敏感性是否與CXCL13/ERK/Akt信號通路激活或者腸道相關(guān)菌群失調(diào)密切相關(guān),目前尚不清楚。下一步研究的方向需要確定Dock2在檸檬酸桿菌感染后炎癥激活的信號通路的作用及維持腸道微生物群平衡中的作用機(jī)制。

    猜你喜歡
    檸檬酸脾臟結(jié)腸炎
    小蘇打檸檬酸自制清潔劑
    “結(jié)腸炎”背后的親子關(guān)系問題
    中老年保健(2022年5期)2022-08-24 02:37:30
    檸檬酸中紅外光譜研究
    保留脾臟的胰體尾切除術(shù)在胰體尾占位性病變中的應(yīng)用
    對診斷脾臟妊娠方法的研究
    腹腔鏡脾切除術(shù)與開腹脾切除術(shù)治療脾臟占位的比較
    光催化Fe(Ⅲ)/檸檬酸降解諾氟沙星
    檸檬酸修飾油菜秸稈對Pb2+的吸附行為研究
    中西醫(yī)結(jié)合治療潰瘍性結(jié)腸炎40例
    辨證論治慢性腹瀉型結(jié)腸炎45例
    精品一品国产午夜福利视频| 精品午夜福利在线看| 美女高潮到喷水免费观看| 春色校园在线视频观看| 一二三四中文在线观看免费高清| 久久精品久久精品一区二区三区| 午夜激情久久久久久久| 久久99精品国语久久久| 满18在线观看网站| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 五月天丁香电影| 亚洲国产色片| 最近2019中文字幕mv第一页| 2021少妇久久久久久久久久久| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 热99久久久久精品小说推荐| 美女午夜性视频免费| 免费黄频网站在线观看国产| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲经典国产精华液单| 午夜福利一区二区在线看| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 免费日韩欧美在线观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 婷婷色综合大香蕉| 日本色播在线视频| 母亲3免费完整高清在线观看 | 国产亚洲一区二区精品| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产精品一国产av| 电影成人av| av网站免费在线观看视频| 国产成人精品无人区| 国产成人精品无人区| 久久这里有精品视频免费| 欧美成人精品欧美一级黄| 性色av一级| 国产男人的电影天堂91| 国产视频首页在线观看| 婷婷色麻豆天堂久久| 男女免费视频国产| 十八禁网站网址无遮挡| 精品人妻在线不人妻| 亚洲第一青青草原| 捣出白浆h1v1| 看十八女毛片水多多多| 美女脱内裤让男人舔精品视频| av视频免费观看在线观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲欧美一区二区三区久久| 黑人欧美特级aaaaaa片| 最近中文字幕高清免费大全6| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲欧美一区二区三区久久| 亚洲情色 制服丝袜| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产一级毛片在线| 香蕉精品网在线| 欧美日韩亚洲高清精品| 999久久久国产精品视频| 最近的中文字幕免费完整| 男人爽女人下面视频在线观看| 日本欧美国产在线视频| videossex国产| 国产高清国产精品国产三级| 国产人伦9x9x在线观看 | 免费黄网站久久成人精品| 最近2019中文字幕mv第一页| 日韩成人av中文字幕在线观看| av网站在线播放免费| 在线观看三级黄色| 免费av中文字幕在线| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲av电影在线进入| 18+在线观看网站| 亚洲第一av免费看| 久久精品国产亚洲av天美| 999精品在线视频| 亚洲精品第二区| 嫩草影院入口| 久久久久人妻精品一区果冻| 亚洲av福利一区| av免费在线看不卡| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 26uuu在线亚洲综合色| 男女无遮挡免费网站观看| 午夜精品国产一区二区电影| 男女午夜视频在线观看| 精品视频人人做人人爽| 韩国精品一区二区三区| 日本欧美国产在线视频| 最近中文字幕高清免费大全6| av国产久精品久网站免费入址| 欧美人与性动交α欧美软件| 免费黄色在线免费观看| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲精品国产av蜜桃| 日韩一区二区三区影片| 亚洲精品在线美女| 少妇精品久久久久久久| 成年动漫av网址| 欧美日本中文国产一区发布| 久久女婷五月综合色啪小说| 美女中出高潮动态图| 在现免费观看毛片| 国产成人av激情在线播放| 91精品伊人久久大香线蕉| 成年人午夜在线观看视频| 另类精品久久| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲欧美一区二区三区国产| 久久精品国产综合久久久| 一区二区三区四区激情视频| 日韩欧美精品免费久久| 一二三四在线观看免费中文在| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 美女午夜性视频免费| 午夜福利一区二区在线看| 国产男女超爽视频在线观看| 在线天堂最新版资源| 黑丝袜美女国产一区| 国产成人精品无人区| av免费观看日本| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 18+在线观看网站| 国产一区有黄有色的免费视频| 欧美在线黄色| 精品人妻一区二区三区麻豆| 成人二区视频| 一二三四在线观看免费中文在| 97人妻天天添夜夜摸| 久久精品久久久久久久性| 久久久a久久爽久久v久久| 国产精品久久久久久久久免| 免费看av在线观看网站| 天堂俺去俺来也www色官网| 一级黄片播放器| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲三区欧美一区| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 久久精品久久久久久久性| 成人二区视频| 十八禁高潮呻吟视频| av线在线观看网站| 99热全是精品| 三级国产精品片| 韩国高清视频一区二区三区| 少妇熟女欧美另类| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 午夜激情av网站| 又黄又粗又硬又大视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品久久久久久精品古装| 欧美av亚洲av综合av国产av | 考比视频在线观看| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产av一区二区精品久久| 在线天堂最新版资源| 国产 一区精品| 黑人欧美特级aaaaaa片| av电影中文网址| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 美女国产高潮福利片在线看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲国产日韩一区二区| 一区二区日韩欧美中文字幕| 999久久久国产精品视频| 老熟女久久久| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 成年美女黄网站色视频大全免费| 亚洲熟女精品中文字幕| 欧美国产精品一级二级三级| 美国免费a级毛片| 国产综合精华液| 午夜免费鲁丝| 人妻人人澡人人爽人人| 久久久久网色| 午夜激情av网站| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲,欧美,日韩| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲色图综合在线观看| 五月天丁香电影| 国产成人欧美| videos熟女内射| 午夜福利在线免费观看网站| 久久人妻熟女aⅴ| 一区二区三区精品91| av免费在线看不卡| 最近中文字幕高清免费大全6| 欧美精品亚洲一区二区| 伊人久久国产一区二区| 欧美在线黄色| 欧美亚洲日本最大视频资源| 午夜精品国产一区二区电影| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 麻豆av在线久日| 一级片免费观看大全| 电影成人av| 免费观看a级毛片全部| 最近最新中文字幕免费大全7| 免费av中文字幕在线| av在线播放精品| 久久午夜福利片| 五月天丁香电影| 新久久久久国产一级毛片| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 一级毛片 在线播放| 成年女人毛片免费观看观看9 | 日韩av不卡免费在线播放| 丝袜人妻中文字幕| 制服诱惑二区| 一级片'在线观看视频| 美国免费a级毛片| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 日韩 亚洲 欧美在线| 精品人妻一区二区三区麻豆| 看免费成人av毛片| 日韩一本色道免费dvd| 国产精品 国内视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久韩国三级中文字幕| 飞空精品影院首页| 少妇被粗大的猛进出69影院| 精品一品国产午夜福利视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 18+在线观看网站| www.av在线官网国产| 超色免费av| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 一区二区三区四区激情视频| 日韩免费高清中文字幕av| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 2022亚洲国产成人精品| 欧美国产精品一级二级三级| 9热在线视频观看99| 免费黄网站久久成人精品| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 一本大道久久a久久精品| 韩国高清视频一区二区三区| 日韩欧美一区视频在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产男女内射视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 激情五月婷婷亚洲| 国产 精品1| 久久久久久久国产电影| 一区二区日韩欧美中文字幕| 满18在线观看网站| 成人国产av品久久久| 纯流量卡能插随身wifi吗| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产xxxxx性猛交| 久久精品人人爽人人爽视色| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 久久青草综合色| 9191精品国产免费久久| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产乱人偷精品视频| 免费在线观看完整版高清| 在线看a的网站| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 成人影院久久| 成年人午夜在线观看视频| 九九爱精品视频在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 久久久亚洲精品成人影院| 午夜久久久在线观看| 久久 成人 亚洲| 欧美日韩av久久| 亚洲图色成人| 亚洲男人天堂网一区| 免费观看在线日韩| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 亚洲av电影在线进入| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 少妇的逼水好多| 久久久精品免费免费高清| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 精品亚洲成国产av| 九色亚洲精品在线播放| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 9热在线视频观看99| 秋霞在线观看毛片| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产人伦9x9x在线观看 | 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| videossex国产| 春色校园在线视频观看| 国产精品免费视频内射| 欧美成人精品欧美一级黄| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久女婷五月综合色啪小说| 欧美bdsm另类| 嫩草影院入口| 国产亚洲精品第一综合不卡| 日本免费在线观看一区| 七月丁香在线播放| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲av免费高清在线观看| 97人妻天天添夜夜摸| 晚上一个人看的免费电影| 欧美+日韩+精品| 香蕉国产在线看| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| av有码第一页| 满18在线观看网站| 色婷婷av一区二区三区视频| 午夜福利视频精品| 18禁观看日本| 青春草亚洲视频在线观看| 天堂俺去俺来也www色官网| av在线老鸭窝| 香蕉丝袜av| 欧美国产精品一级二级三级| 国产日韩欧美视频二区| 国产在线视频一区二区| 女人精品久久久久毛片| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产伦理片在线播放av一区| 少妇人妻 视频| 亚洲国产色片| 亚洲国产精品999| 久久免费观看电影| 777米奇影视久久| 黄色视频在线播放观看不卡| 1024香蕉在线观看| 久久精品亚洲av国产电影网| 久久热在线av| 曰老女人黄片| 在线观看免费视频网站a站| 久久精品亚洲av国产电影网| 高清不卡的av网站| 欧美精品高潮呻吟av久久| 精品人妻偷拍中文字幕| 午夜激情久久久久久久| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产精品国产三级国产专区5o| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久97久久精品| 老司机影院成人| 亚洲图色成人| 亚洲成人av在线免费| 婷婷色综合大香蕉| av国产精品久久久久影院| 纯流量卡能插随身wifi吗| 精品酒店卫生间| 极品人妻少妇av视频| 日韩欧美精品免费久久| 国产野战对白在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 色吧在线观看| 五月天丁香电影| 免费在线观看完整版高清| 精品一区二区免费观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 妹子高潮喷水视频| 欧美+日韩+精品| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 两个人看的免费小视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲,欧美精品.| 91aial.com中文字幕在线观看| 人人澡人人妻人| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲在久久综合| 香蕉国产在线看| 久久99热这里只频精品6学生| 丝袜在线中文字幕| 久久久久国产网址| 久久久久精品久久久久真实原创| 91精品国产国语对白视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久久国产精品麻豆| 国产麻豆69| 日韩欧美精品免费久久| 欧美av亚洲av综合av国产av | 国产亚洲精品第一综合不卡| 黄色配什么色好看| 成人毛片60女人毛片免费| 在线观看美女被高潮喷水网站| 丁香六月天网| 国产精品无大码| 超碰成人久久| 极品少妇高潮喷水抽搐| 九草在线视频观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产亚洲欧美精品永久| 国产精品一二三区在线看| 久久99一区二区三区| 国产免费视频播放在线视频| 秋霞伦理黄片| 久久精品久久久久久噜噜老黄| av女优亚洲男人天堂| 亚洲中文av在线| 国产片内射在线| 丝袜在线中文字幕| 伦理电影大哥的女人| 一边亲一边摸免费视频| 午夜精品国产一区二区电影| 男女边摸边吃奶| 一级毛片我不卡| 伦精品一区二区三区| 亚洲综合色网址| 国产精品久久久久久久久免| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲精品国产一区二区精华液| 美女国产高潮福利片在线看| 成年动漫av网址| 亚洲精品视频女| 免费观看无遮挡的男女| av视频免费观看在线观看| 一级毛片 在线播放| 999精品在线视频| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲国产欧美网| 亚洲,欧美,日韩| 日韩制服骚丝袜av| 黄色怎么调成土黄色| 国产乱人偷精品视频| 亚洲av国产av综合av卡| 嫩草影院入口| 少妇的逼水好多| 亚洲国产av新网站| a 毛片基地| 成年人免费黄色播放视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲一区二区三区欧美精品| 精品国产国语对白av| 亚洲,欧美精品.| 成年女人毛片免费观看观看9 | 成人国语在线视频| 好男人视频免费观看在线| 校园人妻丝袜中文字幕| 欧美在线黄色| 久久这里只有精品19| 青春草国产在线视频| 成人毛片60女人毛片免费| 91精品国产国语对白视频| 男女无遮挡免费网站观看| 69精品国产乱码久久久| 国产精品久久久久成人av| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲四区av| 伦精品一区二区三区| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产 精品1| 国产免费现黄频在线看| 欧美精品国产亚洲| 香蕉精品网在线| 国产成人精品久久二区二区91 | 亚洲成色77777| 激情五月婷婷亚洲| 91成人精品电影| 91国产中文字幕| 国产精品久久久久久精品电影小说| 看十八女毛片水多多多| 两个人看的免费小视频| 丝袜喷水一区| 日本色播在线视频| 亚洲成人av在线免费| 欧美精品国产亚洲| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产男女超爽视频在线观看| √禁漫天堂资源中文www| av在线app专区| 日本av免费视频播放| 久久国内精品自在自线图片| 国产探花极品一区二区| 国产精品熟女久久久久浪| 日韩精品免费视频一区二区三区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲国产色片| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 天美传媒精品一区二区| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 日韩精品有码人妻一区| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产精品.久久久| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| videos熟女内射| 视频区图区小说| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 成年人午夜在线观看视频| 国产av码专区亚洲av| 黄色怎么调成土黄色| 国产免费又黄又爽又色| 人人妻人人澡人人看| 一区二区三区激情视频| 亚洲精品aⅴ在线观看| 一本久久精品| 亚洲,欧美,日韩| 欧美国产精品一级二级三级| 久久久国产欧美日韩av| 精品国产乱码久久久久久小说| 少妇 在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 精品一区在线观看国产| h视频一区二区三区| 日韩三级伦理在线观看| 韩国精品一区二区三区| 国产精品偷伦视频观看了| 国产精品熟女久久久久浪| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 97在线视频观看| 一级爰片在线观看| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 久久人人爽人人片av| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 精品少妇黑人巨大在线播放| 免费av中文字幕在线| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲美女视频黄频| 美女视频免费永久观看网站| 天天操日日干夜夜撸| 咕卡用的链子| 国产精品.久久久| 黄色怎么调成土黄色| 国产精品国产av在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 男女午夜视频在线观看| 日韩精品有码人妻一区| 三上悠亚av全集在线观看| 美女主播在线视频| 欧美成人精品欧美一级黄| av视频免费观看在线观看| 午夜久久久在线观看| 考比视频在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 人妻 亚洲 视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 晚上一个人看的免费电影| 国产熟女午夜一区二区三区| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 成年av动漫网址| 国产国语露脸激情在线看| 韩国精品一区二区三区| 精品久久久久久电影网| 国产野战对白在线观看| 精品午夜福利在线看| 欧美97在线视频| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲视频免费观看视频| 亚洲情色 制服丝袜| 精品酒店卫生间| 亚洲欧美一区二区三区久久| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产精品久久久久成人av| 久久免费观看电影| 久热久热在线精品观看| 精品久久久久久电影网| 男人添女人高潮全过程视频| av天堂久久9| 美女高潮到喷水免费观看| 久久精品国产综合久久久| 国产成人精品久久二区二区91 | 黄片播放在线免费| 欧美激情极品国产一区二区三区| 丝袜美足系列| 国产精品av久久久久免费| 亚洲国产色片| 亚洲精品视频女| 性色av一级| 免费在线观看黄色视频的| 免费黄网站久久成人精品| 七月丁香在线播放| 国产免费又黄又爽又色| 高清av免费在线| 久久av网站| 毛片一级片免费看久久久久| 日本免费在线观看一区| 少妇 在线观看| 看非洲黑人一级黄片| 日本91视频免费播放| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 亚洲视频免费观看视频| 久久韩国三级中文字幕| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 精品久久久久久电影网| 国产色婷婷99|