不同載體-宿主菌組合對重組蛋白表達(dá)量的影響

楊剛剛，王　澤，白海靜，楊亞娟，徐存拴

(1.河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007；2.河南新鄉(xiāng)華星藥廠，河南 新鄉(xiāng) 453007；3.河南省-科技部共建細(xì)胞分化國家重點實驗室培育基地和河南省生物工程重點實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453007)

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不同載體-宿主菌組合對重組蛋白表達(dá)量的影響

楊剛剛1,3，王澤2，白海靜1,3，楊亞娟1,3，徐存拴1,3

(1.河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007；2.河南新鄉(xiāng)華星藥廠，河南 新鄉(xiāng) 453007；3.河南省-科技部共建細(xì)胞分化國家重點實驗室培育基地和河南省生物工程重點實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453007)

摘要：研究了不同載體-宿主菌組合對畢赤酵母重組蛋白表達(dá)量的影響。以豹蛙抗瘤酶(onconase,ONC)、IL-1α、IL-1β、IL-1Ra、人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)與ONC的融合蛋白即HSA-(Gly4Ser1)3-ONC(簡稱HSA-ONC)等5種重組蛋白為報告蛋白,設(shè)計并合成了5種基因。分別插入3種酵母表達(dá)載體pPIC9、pPIC9K和pPICZα-A中，轉(zhuǎn)化3種畢赤酵母受體菌X-33、GS115和SMD1168。篩選得到7種載體-宿主菌組合，在搖瓶規(guī)模進(jìn)行誘導(dǎo)并定量。研究結(jié)果表明：5種外源蛋白在pPICZα-A/X-33組合中表達(dá)量最高，在pPIC9/SMD1168組合中最低。從重組蛋白表達(dá)量來說，pPICZα-A/X-33組合優(yōu)于其他6種載體-宿主菌組合。

關(guān)鍵詞：載體；宿主菌；載體-宿主菌組合；重組蛋白；表達(dá)量

0引言

巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)系統(tǒng)是近30年來表現(xiàn)優(yōu)秀、應(yīng)用廣泛的表達(dá)系統(tǒng)之一[1-4]，目前，已有1 000余種重組蛋白在該表達(dá)系統(tǒng)中成功得到表達(dá)[5]。隨著酵母基因組測序工作的完成，該系統(tǒng)已發(fā)展成為理想的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)[6]。

現(xiàn)有畢赤酵母宿主都是由原始菌株巴氏畢赤酵母 NRRLY-11430衍變而來的[7]，主要有3種類型：野生型(X-33)[8]、組氨酸缺陷型 (GS115、KM71和MC100-3)以及SMD系列蛋白酶缺陷型(SMD1163、SMD1165和SMD1168)。畢赤酵母表達(dá)載體與酵母基因組整合后可穩(wěn)定遺傳[9-10]，常見的表達(dá)載體分為兩種：胞內(nèi)表達(dá)載體和分泌型表達(dá)載體。常見的胞內(nèi)表達(dá)載體有pPICZ、pGAPZ、pHIL-2、pPIC3K和PAO815，胞內(nèi)載體表達(dá)的蛋白無法運(yùn)輸至胞外，不利于后期表達(dá)純化。常見的分泌型表達(dá)載體包括pPIC9(原核氨芐青霉素抗性，真核無抗性)、pPIC9K(原核卡那霉素抗性，真核G418抗性)和pPICZα系列(原核和真核均為Zeocin抗性)[11]。

重組蛋白的表達(dá)量受基因自身性質(zhì)、表達(dá)載體、宿主菌以及培養(yǎng)條件等多種因素的影響[12-13]。本文從載體與宿主菌角度考察多種重組蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)情況，包括rIL-1α、rIL-1β、rIL-1Ra、rONC和rHSA-ONC等。將含有柔性連接肽(Gly4Ser1)3的HSA-ONC融合基因構(gòu)建至3類常見分泌型表達(dá)載體(pPIC9、pPIC9K和pPICZα-A)，分別轉(zhuǎn)化至3種酵母宿主(X-33、GS115和SMD1168)，考察不同載體-宿主組合對重組蛋白表達(dá)量的影響。

1材料與方法

1.1　材料

(1)菌株、質(zhì)粒和基因。大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α菌株購自武漢晶賽生物工程技術(shù)有限公司；分泌型酵母表達(dá)載體(pPIC9、pPIC9K、pPICZα-A)以及畢赤酵母(X-33、GS115、SMD1168)菌株均購自Invitrogen公司；豹蛙抗瘤酶(onconase,ONC)基因委托上海捷瑞生物工程有限公司合成；白細(xì)胞介素IL-1(α、β、Ra)和人血清白蛋白-豹蛙抗瘤酶(HSA-ONC)融合基因委托上海生工生物工程有限公司合成。

(2)試劑和工具酶。質(zhì)粒快速提取試劑盒購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；酵母基因組快速提取試劑盒購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司；限制性內(nèi)切酶PmeI、BamH I、EcoR I、SacI購自MBI公司；Protein Ladder購自上海賽默飛世爾科技有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

(3)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。常用培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基(Luria-Bertani 培養(yǎng)基)、酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose medium,YPD)、最小緩沖甘油培養(yǎng)基(buffered minimal glycerol-complex medium,BMGY)等參考Invitrogen公司的酵母表達(dá)手冊。培養(yǎng)條件：溫度28 ℃，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速300 r/min，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速200 r/min，rIL-1(α、β和Ra)誘導(dǎo)4 d，rONC誘導(dǎo)7 d，rHSA-ONC誘導(dǎo)10 d。

(4)主要儀器。高速低溫離心機(jī)(Multifuge 3SR+)和紫外分光光度計(NANO Drop 2000)購自上海賽默飛世爾科技公司。全溫振蕩培養(yǎng)箱(211B)購自上海智城分析儀器制造有限公司。細(xì)胞電轉(zhuǎn)化儀(Electroporator Ⅱ)購自Invitrogen公司。Typhoon FLA 7000 IP激光掃描成像儀購自美國GE公司。

1.2　方法

(1)HSA-ONC基因的序列優(yōu)化與載體構(gòu)建。通過GenBank查詢ONC基因序列 (AF332139.1)和HSA基因序列(NM_000477.5)，于兩個基因間插入連接肽(Gly4Ser1)3，簡稱HSA-ONC (全長2 187 bp)。融合蛋白信號肽為HSA的信號肽，序列經(jīng)密碼子優(yōu)化后由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成，分別構(gòu)建至pPIC9、pPIC9K和pPICZα-A。

(2)工程酵母菌的制備與篩選。提取pPIC9/HSA-ONC、pPIC9K/HSA-ONC和pPICZα-A/HSA-ONC重組質(zhì)粒，PmeI分別線性化后轉(zhuǎn)化至酵母感受態(tài)，即將pPIC9/HSA-ONC、pPIC9K/HSA-ONC和pPICZα-A/HSA-ONC分別轉(zhuǎn)化至X-33、GS115和SMD1168。其中：含抗性載體為pPIC9K(G418)和pPICZα-A(Zeocin)；組氨酸缺陷型宿主菌為GS115和SMD1168。載體與宿主菌株組合后需要篩選標(biāo)記方可進(jìn)行陽性克隆篩選，去掉pPIC9/X-33(無抗性)和pPIC9K/X-33(G418用于篩選多拷貝且費用高)共得到7種載體-宿主菌組合。轉(zhuǎn)化方法參考Invitrogen公司的畢赤酵母表達(dá)手冊。轉(zhuǎn)化菌液涂布平板后于28 ℃倒置培養(yǎng)3 d。挑取單克隆提取酵母基因組，使用AOX通用引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)，產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

1~4.重組質(zhì)粒pPIC9/HSA-ONC的鑒定：1.重組質(zhì)粒pPIC9/HSA-ONC；2.Pme I單酶切；3.BamH I和EcoR I雙酶切；4.PCR。5~8.重組質(zhì)粒pPIC9K/HSA-ONC的鑒定：5.重組質(zhì)粒pPIC9K/HSA-ONC；6.Pme I單酶切；7.BamH I和EcoR I雙酶切；8.PCR。9~12.重組質(zhì)粒pPICZα-A/HSA-ONC的鑒定：9.重組質(zhì)粒pPIC9K/HSA-ONC；10.Pme I單酶切；11.BstB I和EcoR I雙酶切；12.PCR。M.DNA maker DL 10 000。圖1　重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

(3)篩選最佳載體-宿主菌組合及蛋白定量。隨機(jī)挑選7個組合(每種組合至少挑選10株以上)中鑒定正確的菌種，在平板上活化，挑取少許活化后菌落接種至含10 mL YPD培養(yǎng)基的50 mL三角瓶，于28 ℃、250 r/min培養(yǎng)18~24 h。當(dāng)菌體密度(OD600)達(dá)到10時，取1 mL培養(yǎng)液接種至含100 mL BMGY培養(yǎng)基的1 L三角瓶中，28 ℃、280 r/min培養(yǎng)24 h后開始誘導(dǎo)。每12 h補(bǔ)加1次甲醇，補(bǔ)加量為發(fā)酵液體積的1%，培養(yǎng)條件改為23 ℃、200 r/min。誘導(dǎo)10 d后，取50 μL發(fā)酵上清進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測，蛋白條帶經(jīng)Typhoon FLA 7000 IP激光掃描成像系統(tǒng)灰度掃描后，定量并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2結(jié)果

2.1　重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

pPIC9/HSA-ONC、pPIC9K/HSA-ONC和pPICZα-A/HSA-ONC重組質(zhì)粒用PmeⅠ進(jìn)行單酶切、雙酶切和PCR鑒定，結(jié)果如圖1所示。

2.2　重組菌株的鑒定

載體與宿主菌株進(jìn)行組合后，至少具有抗性或篩選標(biāo)記方可進(jìn)行陽性克隆篩選，本文載體-宿主組合如表1所示。

以得到的7種組合單克隆的基因組為模板進(jìn)行PCR，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證，引物為AOX通用引物，結(jié)果如圖2所示。由圖2可看出：重組菌株均能擴(kuò)增出2 400 bp左右的特異條帶(信號肽+HSA-ONC)和2 200 bp的酵母自身條帶。測序結(jié)果表明基因序列與預(yù)期一致。

表1　不同載體-宿主組合匯總表

2.3　重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

隨機(jī)挑取鑒定正確的單克隆進(jìn)行誘導(dǎo)(每個組合最少挑選10株以上)，取誘導(dǎo)10 d發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果見圖3。由圖3可見：在77.3 kD左右均有蛋白條帶高表達(dá)，最高表達(dá)量組合為pPICZα-A/X-33。另外，還有一條66 kD左右的降解條帶。

M.DNAmakerDL3000;1.pPIC9/SMD1168組合;2.pPIC9K/SMD1168組合;3.pPICZα-A/SMD1168組合;4.pPIC9/GS115組合;5.pPIC9K/GS115組合;6.pPICZα-A/GS115組合;7.pPICZα-A/X-33組合。圖2 重組菌落的基因組PCR鑒定圖3 不同載體-宿主組合rHSA-ONC表達(dá)量的比較

2.4　不同載體-宿主組合對不同重組蛋白表達(dá)量的影響

重組蛋白rONC、rIL-1α、rIL-1β和rIL-1Ra的表達(dá)、構(gòu)建、篩選、誘導(dǎo)和定量方法同rHSA-ONC，不同外源重組蛋白的表達(dá)結(jié)果如表2所示。rHSA-ONC、rONC、rIL-1α、rIL-1β和rIL-1Ra從高到低的載體-宿主組合順序相同，依次為：pPICZα-A/X-33、pPICZα-A/GS115、pPIC9K/GS115、pPIC9/GS115、pPICZα-A/SMD1168、pPIC9K/SMD1168和pPIC9/SMD1168。

表2　不同載體-宿主組合對重組蛋白表達(dá)量的影響　mg/L

注：均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差。

3討論

3.1　不同載體-宿主菌組合對rHSA-ONC表達(dá)量的影響

研究發(fā)現(xiàn)：rHSA-ONC在pPIC9載體的表達(dá)量最低，pPIC9K載體和pPICZα-A載體的表達(dá)差異不明顯。推測其原因可能是pPIC9載體為單拷貝型載體，與酵母染色體整合時缺乏優(yōu)勢，在表達(dá)量上較pPIC9K載體和pPICZα-A載體低；而pPICZα-A載體長度僅為pPIC9K載體長度的1/3，在電轉(zhuǎn)化時可能更利于多拷貝的形成，本試驗中最佳的表達(dá)載體為pPICZα-A。

同時，研究發(fā)現(xiàn)：rHSA-ONC在3種宿主菌株中均可正常表達(dá)，從同一載體的不同宿主角度進(jìn)行比較，SMD1168菌株的表達(dá)水平最低，X-33菌株的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于SMD1168菌株，也高于GS115菌株，而3種菌株表達(dá)的總蛋白無明顯差異。由此推測X-33菌株作為表達(dá)宿主時對外源蛋白的表達(dá)效率更高?？赡芘cX-33菌株是野生型的酵母菌株，具有更強(qiáng)的分泌能力，對外源蛋白適應(yīng)能力更強(qiáng)有關(guān)[14]。SMD1168菌株作為his4位點有突變的畢赤酵母，同時也是Pep4蛋白酶的缺陷型，SMD1168菌株細(xì)胞的生長能力受到一定影響，生長速率和代謝活性與正常菌株相比更弱[5]。在本研究中，雖然融合蛋白在表達(dá)過程中有較嚴(yán)重的降解(圖3中除目標(biāo)條帶外，有一條66 kD左右的降解條帶)，但采用SMD1168宿主表達(dá)的蛋白降解程度并沒有明顯改善(可能與敲除的蛋白酶基因不合適有關(guān))，研究結(jié)果表明：重組蛋白表達(dá)時采用X-33菌株要優(yōu)于GS115和SMD1168宿主菌[15]。

3.2　不同載體-宿主菌組合對其他重組蛋白表達(dá)量的影響

本文還利用其他4種重組蛋白：rONC、rIL-1α、rIL-1β和rIL-1Ra進(jìn)行了不同載體-宿主組合的篩選。試驗結(jié)果表明：rONC、rIL-1α、rIL-1β和rIL-1Ra的表達(dá)水平與載體和宿主有關(guān)，這4種重組蛋白在pPICZα-A/X-33組合的表達(dá)水平均高于其他載體-宿主組合。雖然不同重組蛋白在自身表達(dá)量上有一定差異，但在不同載體-宿主組合中表達(dá)量趨勢基本一致，即pPICZα-A/X-33組合表達(dá)量高于GS115的3種組合(pPIC9/GS115、pPIC9K/GS115和pPICZα-A/GS115)，明顯高于SMD1168的3種組合(pPIC9/SMD1168、pPIC9K/SMD1168和pPICZα-A/SMD1168)。

4結(jié)論

本文通過5種重組蛋白在不同載體-宿主組合條件下進(jìn)行篩選，并建立其表達(dá)體系，最終得出5種重組蛋白在pPICZα-A/X-33組合中表達(dá)量明顯高于其他組合。設(shè)計重組蛋白的表達(dá)時，對不同載體-宿主組合的篩選是十分必要的，可優(yōu)先考慮pPICZα-A/X-33組合。本結(jié)論對其他重組蛋白選擇載體和宿主菌具有指導(dǎo)意義。

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文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

中圖分類號：Q815

DOI:10.15926/j.cnki.issn1672-6871.2016.02.016

文章編號：1672-6871(2016)02-0078-04

收稿日期：2015-01-29

作者簡介：楊剛剛(1987-),男,河南洛陽人,博士生;徐存拴(1958-),男,通信作者,河南安陽人,教授,博士,博士生導(dǎo)師，主要從事肝再生及藥物研發(fā)方面的研究.

基金項目：國家“973”前期研究專項基金項目(2012CB722304);河南省自然科學(xué)基金項目(142300413212,132300413208);河南省重大科技攻關(guān)基金項目(111100910600)