長(zhǎng)松蘿中非核糖體肽合成酶NRPS基因克隆與鑒定*

原曉龍,陳劍,張傳光,畢瑋,王娟,王毅

(1.云南省林業(yè)科學(xué)院，云南　昆明650201;2.云南省森林植物培育與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

國(guó)家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南　昆明650201；

3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，資源與環(huán)境學(xué)院，云南　昆明650201)

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長(zhǎng)松蘿中非核糖體肽合成酶NRPS基因克隆與鑒定*

原曉龍1,2,陳劍1,2,張傳光3,畢瑋1,2,王娟1,2,王毅1,2

(1.云南省林業(yè)科學(xué)院，云南昆明650201;2.云南省森林植物培育與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

國(guó)家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650201；

3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，資源與環(huán)境學(xué)院，云南昆明650201)

摘要：非核糖體肽具抗生素、抗病毒、抗癌及免疫抑制劑等重要的藥用價(jià)值。以長(zhǎng)松蘿的地衣型真菌為研究材料，通過(guò)同源克隆和Gene walking的方法獲取長(zhǎng)松蘿地衣型真菌全長(zhǎng)非核糖體肽合成酶基因(UsNRPS)，并對(duì)得到的UsNRPS進(jìn)行生物信息學(xué)分析、分子系統(tǒng)進(jìn)化分析及基因表達(dá)分析。結(jié)果表明：在地衣型真菌中，非核糖體肽在長(zhǎng)松蘿中為首次發(fā)現(xiàn)，BLAST比對(duì)表明其為NRPS基因的A結(jié)構(gòu)域，生物信息學(xué)分析顯示UsNRPS蛋白是一種非分泌蛋白，位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中；分子進(jìn)化分析顯示UsNRPS與埃默森藍(lán)狀菌(Rasamsoniaemersonii)的NRPS基因的A結(jié)構(gòu)域蛋白聚為一類；RT-PCR分析表明：2 %肌醇、10 %甘露醇、2 %山梨醇、2 %葡萄糖、10 %葡萄糖、0.2 %谷氨酰胺、1 %甘氨酸、0.2 %丙氨酸能夠誘導(dǎo)NRPS基因的輕微表達(dá)，2 %、10 %蔗糖和果糖均能誘導(dǎo)NRPS基因的強(qiáng)烈表達(dá)；0.2 %、1 %的天冬氨酸均抑制NRPS基因的誘導(dǎo)表達(dá)。

關(guān)鍵詞：長(zhǎng)松蘿；NRPS；基因克??；生物信息學(xué)分析；分子系統(tǒng)進(jìn)化分析; 誘導(dǎo)表達(dá)

非核糖體(non-ribosomal peptides,NRPS)是一種在細(xì)菌和真菌中通過(guò)非核糖體肽合成酶(non-ribosomal peptides synthetases,NRPS)途徑合成的一系列的小分子肽類化合物[1]。NRPS的結(jié)構(gòu)復(fù)雜、后修飾途徑多樣化及具有廣泛的生物活性[1～2]。NRPS廣泛應(yīng)用于多肽類抗生素、免疫抑制劑藥物、生物表面活性劑、抗癌藥物、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑和抗病毒藥物等[3]，如用于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌感染的Cubicin(達(dá)托霉素)[4]，能有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及擴(kuò)散的Blenoxane(博來(lái)霉素)[5]。多肽骨架肽鏈的合成由非核糖體肽合成酶(NRPS)催化。NRPS是一種由多模塊組成的酶，不同的模塊按照起始、延伸和終止的空間順序排列而成[6]，每個(gè)模塊均有腺苷酰化結(jié)構(gòu)域(A結(jié)構(gòu)域)，肽酰載體蛋白結(jié)構(gòu)域(T結(jié)構(gòu)域)和縮合結(jié)構(gòu)域(C結(jié)構(gòu)域)3個(gè)核心結(jié)構(gòu)域[7]，特定的結(jié)構(gòu)域具特定的酶活性[8]，已發(fā)現(xiàn)的NRPS有線型(A型)、重復(fù)型(B型)和非線性(C型)3種[9～10]。NRPS在催化合成新肽鏈過(guò)程中，A結(jié)構(gòu)域特異性識(shí)別特定氨基酸，以ATP為能量將其活化為氨?；?AMP中間物[11～12]，功能類似于氨酰tRNA合成酶、乙酰CoA合成酶(Acetyl CoA synthetases，ACS)、4-香豆酸-CoA連接酶(4-counarate coenzyme A ligase,4CL)等[13]。雖然NRPS A結(jié)構(gòu)域與氨酰tRNA合成酶催化相似的反應(yīng)[14]，但它們?cè)谶M(jìn)化或結(jié)構(gòu)上并沒(méi)有關(guān)系，而與ACS、4CL同屬于酰苷酸合成酶超家族[7]。腺苷?；Y(jié)構(gòu)域(A結(jié)構(gòu)域)是NRPS的核心保守模件，在催化NRPS合成過(guò)程中起著重要的啟動(dòng)和決定作用[15]，在A結(jié)構(gòu)域中有1個(gè)約100個(gè)氨基酸殘基的小C端和1個(gè)約400個(gè)氨基酸殘基的大N端[14]。A結(jié)構(gòu)域具有多種不同的片段，不同的片段專一選擇特定的氨基酸，進(jìn)而決定了NRPS的功能和生物活性的多樣性[16]。

地衣是由真菌(子囊菌或擔(dān)子菌)與共生藻〔藍(lán)藻(Cyanobacteria)〕共生形成的具高度遺傳穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)特殊的一類生物有機(jī)體[17～18]。地衣的次生代謝產(chǎn)物一般由共生真菌產(chǎn)生，具抗氧化、抗輻射、抗菌、抗腫瘤、抗病毒等獨(dú)特活性，還可作為植物生長(zhǎng)抑制劑等[19]，在藥用天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域具廣闊的應(yīng)用前景。在自然界地衣生長(zhǎng)極其緩慢，目前尚難以通過(guò)人工培養(yǎng)獲得具生物活性的地衣次生代謝產(chǎn)物。在醫(yī)藥應(yīng)用方面，天然藥物具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)，但限于原料的供應(yīng)和產(chǎn)量，藥物的價(jià)格往往較高，且對(duì)生態(tài)的破壞較為嚴(yán)重。利用基因挖掘技術(shù)，發(fā)掘與其產(chǎn)物相關(guān)的基因，利用組合生物合成的方法可有效改善這一現(xiàn)狀，如李晶等[20]將白樺脂酸的關(guān)鍵調(diào)控基因HFA1、HMG1和ERG9克隆出來(lái)，并將脂肪酸和萜類前體合成途徑整個(gè)代謝通路裝入酵母細(xì)胞，使白樺脂酸的合成的生物量顯著提高。在細(xì)菌和真菌中，NRPS基因廣泛存在，王晗等在黑茶的散囊菌屬(Eurotium)中檢測(cè)到NRPS基因片段的存在[21]；NRPS基因在海洋微生物中也廣泛存在[22～23]，極地微生物中也已發(fā)現(xiàn)NRPS基因的存在[24]。目前在地衣中尚沒(méi)有關(guān)于非核糖體多肽合成酶相關(guān)的報(bào)道。本研究擬從基因出發(fā)，通過(guò)Gene walking克隆地衣的NRPS相關(guān)基因，用半定量PCR檢測(cè)不同碳氮源添加物對(duì)NRPS基因表達(dá)的影響，為利用地衣基因資源和開(kāi)發(fā)潛在的地衣NRP化合物奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1　試劑和材料

長(zhǎng)松蘿(Usnealongissima)地衣型真菌由韓國(guó)地衣資源中心提供，于MYA培養(yǎng)基上15℃條件下培養(yǎng)，定期轉(zhuǎn)接。MYA培養(yǎng)基配方為麥芽糖提取物20 g，酵母提取物2 g，瓊脂8 g，用水定容至1 000 mL。pEASY-T3克隆試劑盒及Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞 (北京全式金公司)；TaKaRaLA Taq酶、Prime Script 1stStand cDNA Synthesis試劑盒 (大連寶生物工程有限公司)；TRIzol試劑、Tiangen 2×Taq酶 (上海生工生物公司)；所用的引物由華大基因合成。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1基因片段的同源克隆

2014年12月，收集長(zhǎng)松蘿地衣型真菌菌絲團(tuán)，用植物提取試劑盒提取其基因組DNA。利用在線簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)軟件Gene Fisher (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher2/)，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物(表1)，以其基因組DNA為模板進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。PCR體系和反應(yīng)程序參考王毅等[25]的體系，稍加改動(dòng)。1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

將PCR產(chǎn)物回收純化后連接到克隆載體pEASY-T3上，轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。從轉(zhuǎn)化的平板中挑選白斑，接種到0.5 mL的液體培養(yǎng)基中，200 r/min，37℃培養(yǎng)12 h后，進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，篩選含插入片段的克隆，送到上海生工進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)特異引物(表1)，以地衣型真菌的DNA為模板，采用TAKARA的Genome Walking Kit試劑盒克隆獲得UsNRPS基因全長(zhǎng)。

1.2.3UsNRPS基因的生物信息學(xué)分析

將測(cè)序結(jié)果用DNAman去除載體后，通過(guò)NCBI對(duì)其DNA序列和氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，選擇同源性較高的序列并用MEGA 6.0軟件進(jìn)行聚類分析；理化性質(zhì)的預(yù)測(cè)借助于ProParam在線工具；信號(hào)肽預(yù)測(cè)利用SignalP 4.1 server；用Target P預(yù)測(cè)其亞細(xì)胞定位，用NCBI中的Conversed Domain Database數(shù)據(jù)庫(kù)搜索NsNRPS的結(jié)構(gòu)功能域；利用Swiss-Model在線工具分析蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，并用Procheck在線工具構(gòu)建拉氏構(gòu)象圖，檢測(cè)其合理性。生物信息學(xué)所用在線工具及其網(wǎng)址見(jiàn)表2。

1.2.4UsNRPS基因的半定量表達(dá)分析

將收獲的長(zhǎng)松蘿菌絲團(tuán)分別接種在添加了不同碳氮源的MYA基本培養(yǎng)基上。碳源分別為肌醇、甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖和果糖，按照2 %和10 % (V/W) 2個(gè)不同濃度分別加入基本培養(yǎng)基MYA中。氮源分別為谷氨酰胺、天冬氨酸、甘氨酸和丙氨酸，按照0.2 %和1 %(V/W)2個(gè)不同濃度分別加入基本培養(yǎng)基MYA中。置于15℃人工氣候箱培養(yǎng)2個(gè)月后，獲取菌絲團(tuán)。

按照RNeasy Plant Mini Kit(Qiangen)的說(shuō)明書提取不同培養(yǎng)基上的長(zhǎng)松蘿地衣型真菌總RNA，用1.2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，將RNA保存于-80℃冰箱。cDNA合成參照Prime Script 1stStand cDNA Synthesis的說(shuō)明書操作，并將cDNA保存在-20℃冰箱。以特異引物(表1)檢測(cè)非核糖體多肽合成酶UsNRPS基因的表達(dá)情況。

2結(jié)果與分析

2.1　基因片段的同源克隆

用簡(jiǎn)并引物Fnrps和RnrpsL2，以地衣型真菌的基因組DNA為模板，獲得保守區(qū)域片段，回收純化后連接到克隆載體pEASY-T3上，選擇陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)其中有一個(gè)約720 bp的克隆片段含有NRPS結(jié)構(gòu)基因片段。根據(jù)這一片段設(shè)計(jì)特異引物(NRPS-FSP1、NRPS-FSP2、NRPS-FSP3、NRPS-RSP1、NRPS-RSP2、NRPS-RSP3，序列見(jiàn)表1)。將其經(jīng)NCBI中的BLASTX比對(duì)，結(jié)果顯示該片段的編碼產(chǎn)物與Eutypalata的NRPS(GeneBank NO. xp 779494723.1) 的相應(yīng)片段具60 %的相似性。

注：Oi為OidiodendronmaiusZn NRPS(KIM98444);Pe為PestalotiopsisficiNRPS(XP007833606);Gl為GlarealozoyensisNRPS(XP008079965);Sp為SporothrixschenckiiNRPS(ERT01323);所有保守氨基酸殘基用*標(biāo)記，兩個(gè)氨基酸的變化用.表示。

Fig.2Alignment ofUsnealongissimapredicted non-ribosomal peptidessynthetases(NRPS)

active sites with five closely fungal NRPS

2.2　UsNRPS基因全長(zhǎng)的獲得

用Genome Walking Kit試劑盒，設(shè)計(jì)特異引物，以地衣型真菌DNA為模板，獲得了UsNRPS基因。利用NCBI-ORF Finder上進(jìn)行開(kāi)放閱讀框的的查找和翻譯，得到了3個(gè)開(kāi)放閱讀框，全長(zhǎng)3 057 bp，比對(duì)DNA和cDNA序列發(fā)現(xiàn)UsNRPS基因含有2個(gè)內(nèi)含子(從起始密碼子開(kāi)始依次為1 522-1 568、1 830-1 895)和5'端、3'端的非編碼區(qū)(圖1)。3個(gè)外顯子拼接總長(zhǎng)1 686 bp，編碼氨基酸殘基561個(gè)。通過(guò)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該基因有1個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，即腺苷?；Y(jié)構(gòu)域(AFD Class Ⅰ超酶家族)其保守活性位點(diǎn)為HSSGSTG-PKP-FH-YGSTE(圖2)，其主要功能為識(shí)別、活化特定的氨基酸，并將其結(jié)合、傳遞到下一個(gè)結(jié)構(gòu)域上，形成氨酰-AMP復(fù)合物。對(duì)UsNRPS基因的5'和3'端的非編碼區(qū)進(jìn)行BLAST比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)與其同源的蛋白質(zhì)序列。

河北的雜文刊物早年叫《雜文界》，只是一份在圈子內(nèi)部交流的理論刊物，其主持者杜文遠(yuǎn)和樓滬光都是擔(dān)任過(guò)《河北日?qǐng)?bào)》副總編輯的老前輩，他們都曾經(jīng)編發(fā)過(guò)我談雜文創(chuàng)作的理論稿子，也轉(zhuǎn)發(fā)過(guò)我的雜文（該刊不發(fā)原作）。后來(lái)，該刊改為《雜文月刊》，以發(fā)作品為主，我與其幾任主編都保持著聯(lián)系，幾乎是“有求必應(yīng)”。作為一個(gè)作者，得到這樣的支持是很幸運(yùn)的。

2.3　UsNRPS的生物信息學(xué)分析

2.3.1UsNRPS的理化性質(zhì)分析

用在線軟件ProtParam預(yù)測(cè)UsNRPS蛋白氨基酸殘基序列的理化性質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量為62 656.7，結(jié)構(gòu)式C2820H4399N755O821S20，等電點(diǎn)6.00，半衰期20 h，脂肪系數(shù)85.26，不穩(wěn)定系數(shù)40.56。不穩(wěn)定系數(shù)在40以上為不穩(wěn)定蛋白[26]，可能是過(guò)渡蛋白，性質(zhì)不穩(wěn)定。SignalP分析結(jié)果顯示，UsNRPSs不存在信號(hào)肽，是一種非分泌蛋白，直接在細(xì)胞質(zhì)合成。采用Target P軟件預(yù)測(cè)其亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明其蛋白位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中。

2.3.2分子系統(tǒng)進(jìn)化分析

用MEGA對(duì)UsNRPS和其他11條同源蛋白序列進(jìn)行Cluster比對(duì)，利用鄰位連接法繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果(圖3)顯示，長(zhǎng)松蘿的NRPS蛋白與RasamsoniaemersoniiAFD(KKA21664) 、TalaromycesmarneffeiAFD(XP 002143737) 、TalaromycesstipitatusAFD(XP 002477949)的蛋白聚為一類，與?；鵆oA連接酶(ACS)和4-香豆酸-CoA連接酶(4CL)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。4CL、ACS和腺苷?；Y(jié)構(gòu)域(AFD)同屬于酰苷酸合成酶超家族，它們通過(guò)不同的保守的腺苷酸結(jié)合基序界定，它們的功能與氨基酰-tRNA合成酶的功能相似，即識(shí)別、活化特定的氨基酸。

2.3.3UsNRPS蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用在線軟件Swiss-Model 獲取蛋白質(zhì)的同源建模結(jié)果，預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)Phi(φ)和Psi(ψ)角的分布方式，利用RasMol預(yù)測(cè)UsNRPS蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，并用在線軟件PROCHECK對(duì)建模結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在二級(jí)結(jié)構(gòu)αβαβα結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上形成了較為致密的球狀結(jié)構(gòu)(圖4A)。PROCHECK分析同源建模的結(jié)果，氨基酸殘基的φ、ψ角均位于區(qū)域核心，證明其空間結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，符合其對(duì)應(yīng)天然蛋白質(zhì)的構(gòu)象。

圖4UsNRPS蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型(A)和拉氏構(gòu)象圖(B)

Fig.4The putative 3D structure(A) and Ramachandram of UsNRPS protein(B)

2.4　不同碳氮源對(duì)UsNRPS基因的誘導(dǎo)表達(dá)情況的檢測(cè)

以微管蛋白(tublin)為參照，TNRPKSF、TNRPKSR作為特異引物檢測(cè)UsNRPS基因的誘導(dǎo)表達(dá)情況。RT-PCR結(jié)果(圖5)顯示，NRPS基因在MYA基本培養(yǎng)基和添加了天冬氨酸的培養(yǎng)基上不表達(dá)，在添加了2 %肌醇、10 %甘露醇、2 %山梨醇、2 %葡萄糖、10 %葡萄糖、0.2 %谷氨酰胺、1 %甘氨酸、0.2 %丙氨酸上有微弱表達(dá)。在添加了濃度為10 %肌醇、2 %甘露醇、10 %山梨醇、1 %谷氨酰胺、0.2 %甘氨酸的MYA培養(yǎng)基上表達(dá)強(qiáng)烈。在含2 %、10 %蔗糖和果糖的MYA培養(yǎng)基上均能誘導(dǎo)NRPS基因的強(qiáng)烈表達(dá)，但在含濃度為2 %、10 %葡萄糖的MYA培養(yǎng)基都只有微弱的表達(dá)。

圖5UsNRPS在添加不同碳氮源的MYA培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)表達(dá)情況

注：CK為MYA基本培養(yǎng)基;A為添加不同碳源；Ino為肌醇;Man為甘露醇;Sor為山梨醇;Sur為蔗糖;Glu為葡萄糖;

Fru為果糖;2,10分別代表2 %,10 %;B為添加不同氮源；Gmi為谷氨酰胺;Asp為天冬氨酸;Gly為甘氨酸; Ala為丙氨酸; 0.2,1代表0.2 %,1 %。

Fig.5Gene inducible expression ofUsNRPSwith different carbon source and amino acid

3討論

長(zhǎng)松蘿是一種松蘿科(Usneaceae)松蘿屬(Usnea)的地衣型植物，主要生于北半球原始森林的冷杉(Abiesfabri)、云杉(Piceaasperata)及松科(Pinaceae)植物上，因長(zhǎng)松蘿具清熱解毒、止咳化痰、消炎等功效而被廣泛當(dāng)做民族藥材使用[27]。長(zhǎng)松蘿中含有許多抗癌、消炎及抗菌的化合物，如長(zhǎng)松蘿的地衣絲狀體中含巴爾巴地衣酸、松蘿酸、地弗地衣酸、地衣聚糖、長(zhǎng)松蘿多糖、扁枝衣酸乙酯等[28～29]，還含有具藥用價(jià)值的多肽類次生代謝產(chǎn)物。長(zhǎng)松蘿中有地衣型真菌和非地衣型內(nèi)生真菌，因此本研究采取藻菌分離技術(shù)獲取長(zhǎng)松蘿的地衣型真菌，并以長(zhǎng)松蘿地衣型真菌為研究對(duì)象研究長(zhǎng)松蘿中NRPS的誘導(dǎo)合成。

本研究利用同源克隆獲得NRPS基因片段，根據(jù)此片段設(shè)計(jì)特異引物，以地衣型真菌DNA為模板，采用Gene walking的方法克隆得到UsNRPS基因的A結(jié)構(gòu)域全長(zhǎng)。結(jié)合BLAST比對(duì)和結(jié)構(gòu)域分析顯示，NRPS的A結(jié)構(gòu)域能獨(dú)立地行使其功能，是一個(gè)具獨(dú)立活性的酶。利用同源序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，UsNRPS蛋白和RasamsoniaemersoniiAFD(KKA21664)、TalaromycesmarneffeiAFD(XP 002143737)、TalaromycesstipitatusAFD(XP 002477949)蛋白聚為一類，與結(jié)構(gòu)域分析相一致，其主要功能為識(shí)別、活化特定的氨基酸，即與特定的氨基酸結(jié)合形成氨酰-AMP復(fù)合物。NRPS的A結(jié)構(gòu)域的特異性是由其中部的約200個(gè)氨基酸殘基組成核心基序決定的，結(jié)合Torsten等的研究[30]，本研究中長(zhǎng)松蘿NRPS A結(jié)構(gòu)域的保守活性位點(diǎn)HSSGSTG-PKP-FH-YGSTE可能是特性識(shí)別某些非極性氨基酸。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，UsNRPS不存在信號(hào)肽，定位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，是一種性狀不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物合成酶，可能參與形成NRPS；其蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)同Eutypalata的NRPS三維結(jié)構(gòu)基本一致，均是在αβαβα二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上形成了致密的蛋白質(zhì)三維立體結(jié)構(gòu)[31]。

滲透壓和不同碳氮源添加物影響地衣型真菌的次生代謝產(chǎn)物和誘導(dǎo)產(chǎn)物的合成[32]。利用RT-PCR檢測(cè)添加了不同碳氮源的MYA培養(yǎng)基上的UsNRPS基因的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在MYA基本培養(yǎng)基上UsNRPS基因不會(huì)表達(dá)，但在添加了不同碳氮源的培養(yǎng)基上，會(huì)不同程度地部分誘導(dǎo)表達(dá)，蔗糖和果糖會(huì)強(qiáng)烈地誘導(dǎo)UsNRPS基因的表達(dá)。不同的碳氮源能夠影響地衣型真菌產(chǎn)物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，王毅等[25]在研究長(zhǎng)松蘿聚酮合酶的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)10 %的山梨醇和蔗糖(2 %和10 %)能夠強(qiáng)烈地誘導(dǎo)UlPKS基因的表達(dá)。許靈波等[33]也發(fā)現(xiàn)不同的碳氮源對(duì)銀杏(Ginkgobiloba)內(nèi)生真菌能夠明顯地促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的合成。NRPS的A結(jié)構(gòu)域識(shí)別特定的底物并將其活化成氨?；佘账醄34]。不同的A結(jié)構(gòu)域識(shí)別不同的氨基酸，結(jié)合本研究中A結(jié)構(gòu)域的誘導(dǎo)表達(dá)情況，天冬氨酸的極性最高，不能誘導(dǎo)A結(jié)構(gòu)域的表達(dá)，可能不是其底物；而相對(duì)應(yīng)的谷氨酰胺和丙氨酸的極性較低，能夠隨著濃度的增加而提高誘導(dǎo)的效率；而甘氨酸是一種不帶電荷的極性氨基酸，極性程度較低，能夠在較低濃度的情況下誘導(dǎo)A結(jié)構(gòu)域的表達(dá)，隨著濃度的增加其誘導(dǎo)表達(dá)效率會(huì)相應(yīng)地降低；本研究所克隆的UsNRPS的A結(jié)構(gòu)域可識(shí)別谷氨酰胺(Gmi)和丙氨酸(Ala)，對(duì)較低濃度的甘氨酸(Gly)具有較高的敏感度。在地衣型真菌中，非核糖體肽在長(zhǎng)松蘿中為首次發(fā)現(xiàn)，結(jié)合其誘導(dǎo)表達(dá)情況，可能是在長(zhǎng)松蘿生長(zhǎng)過(guò)程中，合成并能夠促進(jìn)其地衣體生長(zhǎng)的次生代謝物，僅在地衣體生長(zhǎng)旺盛時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)從長(zhǎng)松蘿地衣型真菌中首次克隆到了NRPS基因的A結(jié)構(gòu)域的全長(zhǎng)，并檢測(cè)其在不同碳氮源的培養(yǎng)基中的表達(dá)情況，為利用工程菌發(fā)酵獲得非核糖體肽類物質(zhì)奠定基礎(chǔ)，提供必要材料。

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The Genetic Clone and Identification of Non-ribosomal Peptides
Synthetases(NRPS)from Usnea longissima

YUAN Xiao-long1,2,CHEN Jian1,2,ZHANG Chuan-guang3,BI Wei1,2,WANG Juan1,2,WANG Yi1,2

(1.Yunnan Academy of Forestry, Kunming Yunnan 650201, P.R.China;2.Key Laboratory for Conservation of Rare,Endangered & Endemic Forest

Plants,State Forestry Administration,Yunnan Provincial Key Laboratory of Cultivation and Exploitation of Forest Plants,Kunming Yunnan 650201,

P.R.China;3.College of Resource and Environment, Yunnan Agricultural University,Kunming Yunnan 650201,P.R.China)

Abstract:TakingUsnealongissimalichen forming fungi as the materials, the segment and full length ofNRPSwere cloned by homology-based cloning and gene walking approaches,and relevant analysis on its bioinformatics,molecular phylogeny evolution and genetic inducible expression were also conducted.For the lichen fungi, the non-ribosomal peptide was first reported inUsnealongissimi, and the BLAST comparison shows that it is at A(adenylation)structure domain of theNRPSsgene.The bioinformatics analysis showsNRPSis a kind of secreted protein, which located in cytoplasmic matrix.The A domain proteins ofNRPSgene of bothUsNRPSandRasamsoniaemersoniiwere clustered.The RT-PCR analysis reveals that 2 % inositol,10 % mannitol,2 % sorbitol,2 % glucose,10 % glucose,0.2 % glutamine,1 % glacine,0.2 % alanine could induce the expression ofNRPSslightly,2 %,10 % sucrose and fructose could lure the expression ofNRPSheavily,while 0.2 %,1 % asparagines could suppress the expression ofNRPS.

Key words:Usnealongissimi;NRPS;gene clone;bioinformatics analysis;molecular phylogeny evolution;inducible expression

中圖分類號(hào)：R 284;R 285

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-8246(2016)01-0014-08

*收稿日期：2015-06-30

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31400488)，云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才培養(yǎng)項(xiàng)目(2010CI016)。

第一作者簡(jiǎn)介：原曉龍(1986-)，男，研究實(shí)習(xí)員，碩士，主要從事林木分子生物學(xué)研究。E-mail:xiaolony@126.com

通訊作者簡(jiǎn)介：王毅(1981-)，男，博士，助理研究員，主要從事植物學(xué)和分子生物學(xué)研究。E-mail:22825818@qq.com