腎胺酶預(yù)防大鼠缺血再灌注致急性腎損傷的機(jī)制研究

?

·基礎(chǔ)研究論著·

作者單位：510120 廣州，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎病科

腎胺酶預(yù)防大鼠缺血再灌注致急性腎損傷的機(jī)制研究

急性腎損傷(AKI)在住院患者中的發(fā)病率達(dá)21.6%，病死率達(dá)23.9%，并加快慢性腎衰竭的進(jìn)展速度，因此對(duì)其的診斷及防治是臨床和基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)[1-3]。AKI的病因多種多樣，其中以缺血再灌注損傷(IRI)最常見。腎胺酶是近年來發(fā)現(xiàn)的、主要由腎小管上皮細(xì)胞合成和分泌并降解循環(huán)系統(tǒng)中兒茶酚胺的蛋白質(zhì)，對(duì)其研究領(lǐng)域最初主要集中在心血管系統(tǒng)，后來發(fā)現(xiàn)其能夠改善缺血再灌注(IR)引起的器官損傷，譬如心臟、腦和腎臟等[4-7]。但是，目前有關(guān)腎胺酶對(duì)IR所致AKI(IR-AKI)的預(yù)防作用，其具體機(jī)制尚未完全闡明，因此進(jìn)一步探討腎胺酶預(yù)防IR-AKI的機(jī)制，為其在AKI的應(yīng)用具有重要意義。本研究構(gòu)建IR-AKI的大鼠模型，予外源性人重組腎胺酶預(yù)處理，旨在了解外源性人重組腎胺酶對(duì)IR-AKI的影響，并探討其可能機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

實(shí)驗(yàn)用SD大鼠由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK-(粵)2011-0015。實(shí)驗(yàn)方案通過廣州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)審核批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)在廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成。重組人腎胺酶購(gòu)自以色列ProSpecbio公司；兔抗鼠Bax及Bcl-2多克隆抗體均由武漢博士德公司提供，山羊抗兔二抗由北京中杉金橋公司提供，丙二醛由南京建成生物工程研究所提供。

二、方　法

1. 動(dòng)物分組

36只SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為假手術(shù)組、空白對(duì)照組(IR組)、腎胺酶干預(yù)組(IR+腎胺酶組)，每組各12只。

2. IR-AKI大鼠模型的構(gòu)建

參照文獻(xiàn)[8]方法，建立IR-AKI的SD大鼠模型：10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉生效后，腹正中線行一3~4 cm切口，找到左腎門，分離輸尿管游離出左腎蒂；動(dòng)脈血管夾夾閉腎蒂，肉眼可見左腎由鮮紅轉(zhuǎn)為暗紅，最后呈紫黑色，30 min后松開血管夾，待觀察左腎充血由紫黑轉(zhuǎn)暗紅再轉(zhuǎn)為鮮紅色后，腎表面可見散在出血點(diǎn)，切除右腎，縫合切口。假手術(shù)組大鼠僅游離出雙側(cè)腎蒂，不夾閉腎動(dòng)脈，傷口用生理鹽水紗布覆蓋，30 min后縫合切口。IR+腎胺酶組按照文獻(xiàn)[9]方法，麻醉前20 min腹腔注射重組人腎胺酶(1 mg/kg)；IR組麻醉前腹腔注射等劑量0.1 ml生理鹽水。18 h后3組大鼠麻醉后開腹，下腔靜脈采血后全部處死，血液經(jīng)高速離心后留上清血漿于-20℃保存，留取左腎組織行石蠟切片。

3. 腎臟組織病理改變的觀察

3組SD大鼠腎臟組織的石蠟切片經(jīng)常規(guī)蘇木素-伊紅染色后，觀察及評(píng)估其腎臟組織損傷的程度，包括腎小管上皮細(xì)胞水腫、壞死，腎小管萎縮、擴(kuò)張，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等，采用腎小管損傷指數(shù)進(jìn)行評(píng)估。每張切片在高倍鏡視野(×400)下取外髓皮質(zhì)部10個(gè)視野，半定量分析腎小管損傷指數(shù)：①正常，計(jì)0分；②輕微損傷，指受損腎小管<5%，計(jì)1分；③輕度損傷，指受損腎小管占5%~25%，計(jì)2分；④中度損傷，指受損腎小管占26%~75%，計(jì)3分；⑤重度損傷，指受損腎小管>75%，計(jì)4分。比較3組SD大鼠的腎小管損傷指數(shù)。

4. 腎臟組織Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用免疫組織化學(xué)(IHC)染色法，對(duì)3組SD大鼠腎臟組織的石蠟切片按常規(guī)程序脫蠟及抗原修復(fù)，3%H2O2滅活內(nèi)源性酶，用山羊血清封閉，然后嚴(yán)格按說明書進(jìn)行兔抗大鼠Bax免疫組織化學(xué)染色和兔抗大鼠Bcl-2免疫組織化學(xué)染色。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，在腎臟中主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色或黃褐色。Bax蛋白可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，也是主要表達(dá)于腎小管細(xì)胞胞漿中，陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色或黃褐色。先在光鏡低倍視野(×100)下觀察反應(yīng)結(jié)果，然后用IPP 6.0軟件計(jì)算高倍視野(×400)平均光密度(OD值)，根據(jù)光密度值分析3組SD大鼠的Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)情況。

5. 腎功能指標(biāo)的檢測(cè)

采用日本奧林巴斯AU2700全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)3組SD大鼠的血清肌酐和血尿素氮水平。

6. 血清丙二醛水平的檢測(cè)

嚴(yán)格按照說明書采用硫代巴比妥酸(TBA) 法測(cè)定3組SD大鼠的血清丙二醛水平，用分光光度計(jì)記錄532 nm處OD值，再將數(shù)據(jù)代入公式，算出血清丙二醛含量。每次檢測(cè)重復(fù)操作2次，結(jié)果取平均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)改變

1. 總體表現(xiàn)

假手術(shù)組大鼠腎臟外觀形態(tài)、色澤和大小正常，外表面呈鮮紅色，冠狀切面可見色澤從皮質(zhì)到髓質(zhì)由淡紅向深紅顏色加深；IR組腎臟體積增大，顏色為紫紅或紫黑色，表面有散在的出血點(diǎn)，冠狀切面可見皮質(zhì)蒼白，腎髓質(zhì)淤血。IR+腎胺酶組介于兩者之間。

2.光鏡下觀察

經(jīng)蘇木素-伊紅染色后，假手術(shù)組SD大鼠的腎小球和腎小管區(qū)未見異常，腎小球完整，結(jié)構(gòu)清晰，球囊比例正常；腎小管管腔基底膜完整，可見刷狀緣，見圖1A。IR+腎胺酶組可見局部腎小球膨大，腎小囊裂隙變窄，球囊比輕度增大；腎小管基底膜基本完整，腎小管上皮細(xì)胞輕度腫脹，空泡樣和玻璃樣變，部分近端小管上皮細(xì)胞刷狀緣缺失或脫落，偶見管腔淡紅色染色；腎間質(zhì)輕微水腫，局部有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖1B。IR組球囊比明顯增大，偶可見腎小囊基膜破裂；腎小管上皮細(xì)胞彌漫腫脹和壞死，胞漿呈空泡狀，刷狀緣基本缺失，管腔充滿碎片；腎間質(zhì)水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，比IR+腎胺酶組更嚴(yán)重，見圖1C。

圖1　假手術(shù)組、IR+腎胺酶組、IR組SD大鼠的腎臟病理檢查結(jié)果(蘇木素-伊紅染色，×400)

3. 3組SD大鼠的腎小管損傷指數(shù)比較

經(jīng)IR處理18 h后，假手術(shù)組、IR+腎胺酶組、IR組的腎小管損傷指數(shù)分別為0.15±0.03、1.70±0.23、3.51±0.40，3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=312.548，P<0.001)，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001)。

二、3組SD大鼠腎組織的Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平比較

1. Bcl-2

假手術(shù)組可見腎小管上皮細(xì)胞少量Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)，而IR組Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞多于假手術(shù)組，IR+腎胺酶組的Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞均較假手術(shù)組和IR組增多，見圖2。假手術(shù)組、IR組、IR+腎胺酶組Bcl-2的OD值分別為28.6±4.1、81.5±7.2、148.3±7.6，3組Bcl-2的OD值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 028.109，P<0.001)，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001)。

圖2　假手術(shù)組、IR+腎胺酶組、IR組SD大鼠腎組織的Bcl-2蛋白表達(dá)(IHC染色，×400)

2. Bax

假手術(shù)組可見少量Bax蛋白表達(dá)，IR+腎胺酶組的Bax陽(yáng)性細(xì)胞比假手術(shù)組增多、比IR組減少，見圖3。假手術(shù)組、IR組、IR+腎胺酶組Bcl-2的OD值分別為23.6±3.5、112.5±8.4、52.5±5.7，3組Bax的OD值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=641.083，P<0.001)，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001)。

圖3　假手術(shù)組、IR+腎胺酶組、IR組SD大鼠腎組織的Bax蛋白表達(dá)(IHC染色，×400)

三、3組SD大鼠的血清肌酐、血尿素氮水平比較

3組SD大鼠的血清肌酐、血尿素氮水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001)，IR+腎胺酶組的血清肌酐、血尿素氮水平均比IR組降低(t分別為10.144、6.015，P均<0.001)，但均高于假手術(shù)組(t分別為11.258、8.088，P<0.001)，見表1。

表1假手術(shù)組、IR組、IR+腎胺酶組

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與IR組比較，bP<0.01

四、3組SD大鼠的血清丙二醛水平比較

假手術(shù)組、IR組、IR+腎胺酶組的血清丙二醛分別為(3.61±0.79)、(9.74±1.28)、(7.51±0.54) μmol/L，3組血清丙二醛水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=135.982，P<0.001)，IR組與IR+腎胺酶組血清丙二醛水平均高于假手術(shù)組(t分別為14.111、14.107，P均<0.001)；與IR+腎胺酶組相比，IR組血清MDA水平更高(t=5.561，P<0.01)。

討論

AKI是急性腎衰竭的早期階段，其病因多種多樣，病理生理機(jī)制尚未完全闡明[10]。其中腎臟IR-AKI在臨床上十分常見，預(yù)后不理想[11]。因此，積極尋求有效的AKI防治方法具有重要意義。目前認(rèn)為，缺血、缺氧導(dǎo)致腎臟組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎臟組織細(xì)胞凋亡、壞死和氧化應(yīng)激損傷組織等參與了IR-AKI的病理生理過程[12]。

腎胺酶被發(fā)現(xiàn)已經(jīng)有10余年，研究主要集中在心血管和慢性腎衰竭領(lǐng)域，其作用機(jī)制尚存在爭(zhēng)議[13-14]。最近研究發(fā)現(xiàn)，腎胺酶不僅在降低血壓、控制心率和抑制心肌肥厚等心血管疾病中扮演重要角色，還能對(duì)IRI的器官具有保護(hù)作用。Lee等[9]發(fā)現(xiàn)，腎胺酶能夠預(yù)防順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞株HK-2損傷，炎癥因子表達(dá)明顯減少，在腎胺酶基因敲除小鼠中，不能耐受IRI。但是腎胺酶預(yù)防IR-AKI的作用機(jī)制尚未完全闡明。腎胺酶是作為單胺氧化酶降解循環(huán)中的兒茶酚胺改善缺血器官供血還是作為細(xì)胞因子與一種未知受體結(jié)合起作用，抑或存在其他未知機(jī)制尚存在爭(zhēng)議。

本研究建立SD大鼠IR-AKI模型后，SD大鼠血尿素氮和血清肌酐水平均比假手術(shù)組明顯升高，提示其腎功能下降，其腎臟形態(tài)學(xué)進(jìn)一步表明建模成功。IR前予外源性人重組腎胺酶預(yù)處理，腎功能受損程度顯著減輕，腎小管損傷指數(shù)明顯下降，說明了腎胺酶能夠保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞，減輕IR-AKI。

研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，IR+腎胺酶組的促凋亡蛋白Bax表達(dá)比IR組減少，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)比IR組表達(dá)增多。因此，腎胺酶可能是通過抑制凋亡蛋白表達(dá)和促進(jìn)抗凋亡蛋白表達(dá)，從而保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞免遭受IRI。

腎臟IR后會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，自由基一方面直接參與對(duì)組織細(xì)胞損傷，另一方面自由基會(huì)作為第二信使參與細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)[15]。自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，終產(chǎn)物為丙二醛，丙二醛本身具有細(xì)胞毒性。因此丙二醛的水平能夠反映機(jī)體過氧化程度。IR+腎胺酶組的丙二醛水平明顯低于IR組，由此可見腎胺酶具有減少丙二醛生成，達(dá)到穩(wěn)定細(xì)胞膜脂質(zhì)成分，減少細(xì)胞毒性物質(zhì)生成的作用，從而使IR后腎小管上皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激產(chǎn)物的損傷。

IR-AKI是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，本研究通過對(duì)IR-AKI大鼠模型予腎胺酶預(yù)處理，觀察氧化應(yīng)激產(chǎn)物、凋亡蛋白及抗凋亡蛋白的水平，推測(cè)腎胺酶預(yù)防IR-AKI大鼠模型是通過減少氧化應(yīng)激產(chǎn)物丙二醛、抑制凋亡蛋白和促進(jìn)抗凋亡蛋白的表達(dá)，研究結(jié)果將為腎胺酶在AKI的防治應(yīng)用提供依據(jù)。本研究尚有不足之處，如未從RNA及蛋白質(zhì)等水平動(dòng)態(tài)觀察表達(dá)情況，也沒有對(duì)上述各項(xiàng)指標(biāo)行多個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀測(cè)，腎胺酶還可能通過其他作用參與IR-AKI的保護(hù)機(jī)制等，日后我們將進(jìn)一步深入研究以獲取更多可靠的證據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]Coca SG, Singanamala S, Parikh CR.Chronic kidney disease after acute kidney injury: a systematic review and meta-analysis.Kidney Int,2012,81(5):442-448.

[2]Susantitaphong P, Cruz DN, Cerda J, Abulfaraj M, Alqahtani F, Koulouridis I, Jaber BL; Acute Kidney Injury Advisory Group of the American Society of Nephrology.World incidence of AKI: a meta-analysis.Clin J Am Soc Nephrol,2013,8(9):1482-1493.

[3]李廣然, 張滌華. 擠壓傷致急性腎衰竭的治療. 新醫(yī)學(xué), 2008, 39(11): 708-709.

[4]Luft FC.Renalase, a catecholamine-metabolizing hormone from the kidney.Cell Metab,2005,1(6):358-360.

[5]Farzaneh-Far R, Desir GV, Na B, Schiller NB, Whooley MA. A functional polymorphism in renalase (Glu37Asp) is associated with cardiac hypertrophy, dysfunction, and ischemia: data from the heart and soul study.PLoS One,2010,5(10):e13496.

[6]Desir GV, Wang L, Peixoto AJ.Human renalase: a review of its biology, function, and implications for hypertension.J Am Soc Hypertens,2012,6(6):417-426.

[7]Li X, Huang R, Xie Z, Lin M, Liang Z, Yang Y, Jiang W.Renalase, a new secretory enzyme: Its role in hypertensive-ischemic cardiovascular diseases.Med Sci Monit,2014,20:688-692.

[9]Lee HT, Kim JY, Kim M, Wang P, Tang L, Baroni S, D’Agati VD, Desir GV.Renalase protects against ischemic AKI.J Am Soc Nephrol,2013,24(3):445-455.

[10]Okusa MD, Davenport A.Reading between the (guide)lines-the KDIGO practice guideline on acute kidney injury in the individual patient.Kidney Int,2014,85(1):39-48.

[11]Findlay M, Donaldson K, Robertson S, Almond A, Flynn R, Isles C.Chronic kidney disease rather than illness severity predicts medium- to long-term mortality and renal outcome after acute kidney injury.Nephrol Dial Transplant,2015,30(4):594-598.

[12]Molitoris BA.Therapeutic translation in acute kidney injury: the epithelial/endothelial axis.J Clin Invest,2014,124(6):2355-2363.

[13]Eikelis N, Hennebry SC, Lambert GW, Schlaich MP.Does renalase degrade catecholamines? Kidney Int,2011,79(12):1380.

[14]Xu J, Li G, Wang P, Velazquez H, Yao X, Li Y, Wu Y, Peixoto A, Crowley S, Desir GV.Renalase is a novel, soluble monoamine oxidase that regulates cardiac function and blood pressure.J Clin Invest,2005,115(5):1275-1280.

[15]Kim J, Jung KJ, Park KM.Reactive oxygen species differently regulate renal tubular epithelial and interstitial cell proliferation after ischemia and reperfusion injury.Am J Physiol Renal Physiol,2010,298(5):F1118-F1129.

(本文編輯：林燕薇)

吳永東汪華林林蓉宇蔣強(qiáng)袁春玲

【摘要】目的探討腎胺酶在預(yù)防腎臟缺血再灌注(IR)致急性腎損傷(AKI)的作用及機(jī)制。方法選擇36只SD大鼠制作IR-AKI模型，隨機(jī)分成假手術(shù)組(僅游離出雙側(cè)腎蒂，不夾閉腎動(dòng)脈)、空白對(duì)照組(IR組，缺血前30 min腹腔注射生理鹽水)、腎胺酶干預(yù)組(IR+腎胺酶組，缺血前20 min腹腔注射腎胺酶1 mg/kg)3組。于IR 18 h后，取腎臟組織行蘇木素-伊紅染色和免疫組織化學(xué)檢查，光鏡下觀察病理學(xué)改變，比較凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)水平；靜脈采血測(cè)血尿素氮、血清肌酐和丙二醛含量。結(jié)果IR+腎胺酶組的血清肌酐、血尿素氮和丙二醛水平和急性腎小管壞死指數(shù)均低于IR組(P均<0.01)、高于假手術(shù)組(P均<0.01)。IR+腎胺酶組的Bcl-2蛋白表達(dá)均高于IR組和假手術(shù)組(P<0.01)。IR+腎胺酶組的Bax蛋白表達(dá)低于IR組(P<0.01)、高于假手術(shù)組(P<0.01)。結(jié)論腎胺酶可減輕腎臟IR導(dǎo)致的AKI，其機(jī)制可能是通過抑制氧化應(yīng)激產(chǎn)物的產(chǎn)生，并與上調(diào)Bcl-2抗凋亡蛋白和下調(diào)Bax促凋亡蛋白表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】腎胺酶；缺血再灌注；急性腎損傷；氧化應(yīng)激；凋亡

Mechanism of renalase in prevention of acute renal injury induced by ischemia and reperfusionWuYongdong,WangHualin,LinRongyu,JiangQiang,YuanChunling.DepartmentofNephropathy,theFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510120,China

Correspondingauthor,WangHualin,E-mail:hualinwang@126.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of renalase in preventing acute kidney injury (AKI) induced by renal ischemia/reperfusion (IR). MethodsA total of 36 IR-AKI SD rat models were established and randomly divided into the sham-operated group (renal pedicle was separated without renal artery clipping), normal control (IR group, intraperitoneal injection of normal saline at 30 min before ischemia)group and renalase intervention group (IR+renalase group, intraperitoneal injection of 1.5mg/kg of renalase at 30 min before ischemia). At 18 h after IR, renal tissues were collected for H.E staining and immunohistochemical analysis and observed for pathological changes under light microscope. The expression levels of Bcl-2 and Bax were detected and statistically compared among three groups. The contents of serum creatinine, urea nitrogen and serum malonyldialdehyde were measured. ResultsThe levels of serum creatinine, urea nitrogen, serum malonyldialdehyde and acute tubular necrosis scoring index in the IR+ renalase group were significantly lower than those in the IR group (all P<0.01), whereas considerably higher compared with those in the shame-operated group (all P<0.01). The expression of Bcl-2 in the IR+renalase group was significantly higher compared with those in both the IR and shame groups (both P<0.01). The expression level of Bax in the IR+renalase group was significantly lower than that in the IR group (P<0.01) but dramatically higher compared with that in the sham-operated group (P<0.01). ConclusionsRenalase can alleviate IR-induced AKI probably by inhibiting the production of oxidative stress products, down-regulating the expression of of Bax and up-regulating the expression of Bcl-2.

【Key words】Renalase; Ischemia reperfusion; Acute kidney injury; Oxidative stress;Apoptosis

收稿日期：(2015-09-28)

通訊作者，汪華林，E-mail：hualinwang@126.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30801140)

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.01.004