胃舒湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍大鼠的治療作用及其對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響

賴日明，劉越滇，聶旭檢，倪文穎

廣州市增城區(qū)中醫(yī)院，廣東 廣州 510000

胃舒湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍大鼠的治療作用及其對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響

賴日明，劉越滇，聶旭檢，倪文穎

廣州市增城區(qū)中醫(yī)院，廣東 廣州 510000

目的：通過觀察胃舒湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍大鼠胃組織病理及胃組織白介素-2（IL-2），核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）p65蛋白表達(dá)水平的影響，探討其作用機(jī)制。方法：48只清潔級(jí)Wistar大鼠成功造模后，根據(jù)完全隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常組、模型組、奧美拉唑組、胃舒湯組。自造模后第3天，正常組和模型組給予生理鹽水，奧美拉唑組、胃舒湯組分別給予奧美拉唑膠囊溶液、胃舒湯水煎液灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃13天。觀察用藥過程中各組大鼠一般狀態(tài)、胃大體形態(tài)學(xué)和組織病理學(xué)，比較各組的胃組織病理指數(shù)，測定并比較各組胃組織IL-2、NF-κBp65蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：胃舒湯組和奧美拉唑組大鼠飲食、活動(dòng)量、被毛等一般狀態(tài)優(yōu)于模型組，且體重增長速度明顯大于模型組，尤以胃舒湯組更為明顯。胃舒湯組和奧美拉唑組潰瘍指數(shù)明顯低于模型組（P＜0.01），且胃舒湯組潰瘍指數(shù)明顯低于奧美拉唑組（P＜0.01）。模型組胃組織IL-2水平及NF-κBp65蛋白表達(dá)水平顯著高于正常組（P＜0.01），奧美拉唑組及胃舒湯組IL-2水平及NF-кBp65水平均顯著低于模型組，且胃舒湯組的IL-2及NF-κBp65水平更低于奧美拉唑組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論：胃舒湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍大鼠具有較好的治療作用，其作用機(jī)制可能與通過抑制NF-κB的活化及表達(dá)，減少炎癥因子的釋放有關(guān)。

胃潰瘍；白細(xì)胞介素-2（IL-2）；核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）；胃舒湯

胃潰瘍(GU)是消化內(nèi)科常見病之一，其發(fā)病緩慢，病程遷延，易反復(fù)發(fā)作，可見于任何年齡，尤以老年人為多見。研究認(rèn)為，消化性潰瘍是多種有害因素對(duì)胃黏膜的損害超過黏膜抵御外界損傷和自身修復(fù)能力所引起的結(jié)果[1]。GU周圍的黏膜往往存在慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生和異型增生的可能，若不及時(shí)治療，1%的GU有可能轉(zhuǎn)化為胃癌。本研究自擬胃舒湯干預(yù)實(shí)驗(yàn)性乙酸大鼠GU模型，旨在探討胃舒湯干預(yù)慢性GU的機(jī)制，期望為臨床治療GU提供新的用藥選擇。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar大鼠48只，雌雄各半，體重200～220g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證號(hào)：SCXK粵2010-0015。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 胃舒湯藥物組成：蒼術(shù)12 g，白術(shù)、茯苓、白芍、白及、蒲公英各10 g，陳皮、制半夏各9 g，田七3 g、甘草6 g。水煎煮2次，合并2次煎煮藥液并濃縮，于用時(shí)配成適當(dāng)濃度。奧美拉唑膠囊(海南海力制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：120104)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 細(xì)胞總蛋白提取試劑盒由美國Pierce公司提供；兔抗小鼠核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)p65、β-actine一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗均由美國Cell Signaling公司生產(chǎn)；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光液由北京碧云天生物技術(shù)研究所提供；DAB顯色試劑盒由北京中山金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；大鼠白介素-2(IL-2)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒均由RD公司提供。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 動(dòng)物分組及處理 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天，正常生長后用于實(shí)驗(yàn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將48只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、胃舒湯組、奧美拉唑組，每組12只。除正常組外，其余3組大鼠均采用改良Okabe的方法[2]造模。大鼠造模前均禁食不禁水24 h，10%水合氯醛以0.32 mL/100 g劑量腹腔內(nèi)注射麻醉，大鼠麻醉完全后仰臥固定于解剖板上，常規(guī)腹壁備皮消毒鋪洞巾，劍突下縱向做一長約2 cm切口剪開腹部，沿腹白線逐層打開腹腔，局部腹腔拉鉤暴露術(shù)野，通過無齒鑷逐步游離，最終沿肝臟后找出胃體，沿胃竇前壁近小彎側(cè)注入0.05mL的100%乙酸，深度應(yīng)至達(dá)胃壁肌層與漿膜層之間。0號(hào)絲線縫合線依次縫合腹膜、腹壁各層組織及皮膚。造模結(jié)束后將大鼠放回鼠籠飼養(yǎng)。正常組和模型組均自造模后第3天開始給予生理鹽水1 mL/100 g灌胃，每天1次。奧美拉唑組自造模后第3天后開始給予0.72 mL/100 g的奧美拉唑膠囊溶液(濃度為1 mg/mL)灌胃，每天1次。胃舒湯組自造模后第3天開始給予1 mL/100 g的胃舒湯水煎液(1 g生藥/kg)，每天1次，各組均連續(xù)灌胃給藥13天。取病理組織的前1天中午起，大鼠禁食不禁水。每組隨機(jī)處死2只大鼠，開腹、取胃組織后，用4%福爾馬林固定行病理組織學(xué)檢查。參照2009年版的《實(shí)用內(nèi)科學(xué)》中胃潰瘍的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)，3組大鼠胃潰瘍模型均造模成功。

1.5 一般狀態(tài)觀察 每天觀察并記錄實(shí)驗(yàn)性大鼠的食量、飲水量、體重、活動(dòng)情況及被毛光澤度等一般狀態(tài)。

1.6 胃大體形態(tài)學(xué)和組織病理學(xué)觀察 給予藥物干預(yù)13天后，各組大鼠均禁食24 h，運(yùn)用10%水合氯醛(0.32 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠后，剖腹取出全胃。胃大彎處剖開并用冰生理鹽水沖洗數(shù)次后，濾紙吸干，觀察胃組織大體形態(tài)。參照文獻(xiàn)[3]標(biāo)準(zhǔn)，測量潰瘍最大直徑及與直徑垂直的最寬距離，二者相乘即為潰瘍面積，深度則分為≥2 mm或＜2 mm計(jì)算。根據(jù)潰瘍指數(shù)表計(jì)算潰瘍體積。比較各組潰瘍指數(shù)。于各組大鼠胃小彎處剪取大小為0.5 cm×0.5 cm的組織條，4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色，置于光鏡下觀察胃黏膜損傷情況。

1.7 細(xì)胞因子IL-2和蛋白NF-κBp65的檢測 細(xì)胞因子IL-2嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書，采用ELISA法檢測胃黏膜組織IL-2水平。蛋白免疫印記法測定NF-κBp65的含量，取液氮速凍大鼠胃組織，迅速研磨成細(xì)粉并提取組織總蛋白，采用BCA法檢測蛋白含量。12%SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入NF-κBp65抗體，ECL顯色，顯影，定影，利用圖像處理軟件計(jì)算目的蛋白表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊采用LSD法，方差不齊采用Dennett T3法。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的一般狀態(tài) 正常組大鼠活動(dòng)自如，飲水、進(jìn)食量穩(wěn)定，體重增加，毛色光澤，尾色紅潤，大小便正常。模型組大鼠造模后1天即出現(xiàn)活動(dòng)量減少，食欲下降，精神萎頓，體重明顯減輕，反應(yīng)遲鈍，毛雜亂無光澤蓬松，喜靜扎堆，拱背，尾色蒼白無光，大便常稀溏無規(guī)律。術(shù)后第5天上述癥狀最為顯著。隨時(shí)間推移約10天后，上述癥狀逐漸緩解，飲食和活動(dòng)量恢復(fù)，被毛較前有光澤。胃舒湯組和奧美拉唑組用藥干預(yù)后，大鼠食欲下降、活動(dòng)減少、體重減輕等現(xiàn)象迅速恢復(fù)，用藥后約3天上訴癥狀基本緩解，但仍有部分大鼠大便稀溏不成形。用藥期間體重增長速度明顯高于模型組，尤以胃舒湯組最為明顯。

2.2 各組大鼠胃大體形態(tài)觀察及胃潰瘍指數(shù)比較 見表1。正常組大鼠胃黏膜正常，無損傷，呈粉紅色，表面光滑覆蓋大量黏液，皺襞平滑有光澤無斷續(xù)，胃壁彈性良好，未見潰瘍、充血及水腫。模型組大鼠胃內(nèi)可見大量內(nèi)容物殘留，胃竇前壁黏膜面可見直徑約0.5～1.2 cm圓形潰瘍，底部平坦并可見輕度充血水腫，胃皺襞不連續(xù)，新生皺黏膜稍粗大，愈合的潰瘍部位胃壁明顯增厚。胃舒湯組和奧美拉唑組用藥干預(yù)后大鼠胃腔內(nèi)容物殘留較模型組少，潰瘍的面積、深度均小于模型組。胃舒湯組和奧美拉唑組潰瘍指數(shù)明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而胃舒湯組潰瘍指數(shù)亦明顯低于奧美拉唑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表1 各組大鼠胃潰瘍指數(shù)比較(±s)

表1 各組大鼠胃潰瘍指數(shù)比較(±s)

與模型組比較，①P＜0.01；與奧美拉唑組比較，②P＜0.01。

組別正常組模型組奧美拉唑組胃舒湯組樣本數(shù)12 12 12 12潰瘍指數(shù)(mm3) 0 16.32±1.73 9.15±0.62①6.37±0.41①②

2.3 各組大鼠胃組織病理學(xué)觀察 見圖1。光鏡下觀察顯示，正常組大鼠胃黏膜正常，無充血、水腫和糜爛，胃黏膜上皮細(xì)胞和腺體排列整齊規(guī)則，分界清楚，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤。模型組胃竇小彎側(cè)黏膜可見潰瘍形成，有的潰瘍可深至肌層或達(dá)漿膜層，胃黏膜固有腺體結(jié)構(gòu)被破壞，局部充血、水腫明顯，潰瘍底部可見大量炎性細(xì)胞、壞死組織、肉芽組織形成。胃舒湯組和奧美拉唑組可見胃黏膜輕度破壞，局部潰瘍周圍可見上皮細(xì)胞移行，并可見肉芽組織覆蓋了大部分潰瘍底部，部分腺體已重建，僅黏膜層見少量炎性細(xì)胞浸潤，壞死組織消失，胃黏膜各層結(jié)構(gòu)清楚。胃舒湯組胃黏膜炎癥改善情況明顯好于奧美拉唑組。

圖1 各組大鼠胃組織病理學(xué)觀察（40×）

2.4 各組大鼠胃組織IL-2和NF-κBp65表達(dá)比較 見表2。模型組胃組織IL-2水平明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；干預(yù)后，各給藥組大鼠IL-2水平顯著低于模型組(P＜0.01)，奧美拉唑組和胃舒湯組間比較，以胃舒湯組降低更明顯(P＜0.01)。模型組大鼠胃組織NF-κBp65蛋白表達(dá)水平顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。干預(yù)后，奧美拉唑組和胃舒湯組NF-κBp65水平顯著降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，胃舒湯組降低最明顯(P＜0.01)。

表2 各組大鼠胃組織IL-2、NF-κBp65表達(dá)比較(±s)

表2 各組大鼠胃組織IL-2、NF-κBp65表達(dá)比較(±s)

與正常組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01；與奧美拉唑組比較，③P＜0.01

組別正常組模型組奧美拉唑組胃舒湯組樣本數(shù)IL-2(ng/L)N F-κBp65 12 12 12 12 21.06±7.239.13±1.02 263.52±27.61①132.76±23.51①②102.17±21.26①②③56.17±5.69①39.21±5.13①②21.65±3.27①②③

3 討論

GU是消化系統(tǒng)的常見病之一，臨床多表現(xiàn)為持續(xù)性上腹部灼痛，亦可表現(xiàn)為鈍痛、脹痛、劇痛或饑餓樣不適感等，多具有節(jié)律性，伴有腹脹、惡心、泛酸等，嚴(yán)重者可出現(xiàn)黑便與嘔血，GU可發(fā)生于任何年齡，老年人為主要的發(fā)病人群，臨床多發(fā)病緩慢、病程遷延，復(fù)發(fā)率較高，若不及時(shí)治療，遷延難愈，最終可轉(zhuǎn)化為胃癌。對(duì)于發(fā)病機(jī)制，近年來炎癥損傷在其發(fā)病的作用逐漸受到重視。多種炎癥細(xì)胞因子的過度表達(dá)導(dǎo)致胃黏膜的炎癥損傷[4～5]。NF-κB是一個(gè)多功能核轉(zhuǎn)錄因子，在多種炎癥反應(yīng)通路中起重要作用[6～7]。在病理?xiàng)l件下，NF-κB受氧自由基、內(nèi)毒素、細(xì)胞因子的刺激而磷酸化被激活，NF-κB迅速由胞漿移位至核內(nèi)，調(diào)控相應(yīng)的靶基因，如前炎癥介質(zhì)黏附分子、趨化因子的持續(xù)過度表達(dá)，且炎癥介質(zhì)可再次激活NF-κB，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的循環(huán)級(jí)聯(lián)放大，最終造成胃黏膜的損傷。

目前，針對(duì)GU的治療，西醫(yī)多以抑制胃酸分泌、抗幽門螺桿菌感染和保護(hù)胃黏膜為主，雖取得一定療效，但停藥后易復(fù)發(fā)，且有一定的不良反應(yīng)，部分患者難以耐受。部分學(xué)者運(yùn)用中醫(yī)藥方法治療GU取得較好療效，因此，中醫(yī)藥理論診治GU的研究成為熱點(diǎn)[8～9]。

GU辨病屬中醫(yī)“胃痛”“痞證”范疇。胃為中土，主受納腐熟水谷，以降為順，以通為用，濕熱、氣滯、血瘀、寒凝、痰濁等病理因素?fù)p傷脾胃，致脾胃虛弱，脾不化濕，胃氣失和，升降失調(diào)。因此GU以脾胃虛弱、升降失調(diào)為其主要病機(jī)，治療上以化濕、行滯、和胃為法。胃舒湯由蒼術(shù)、白術(shù)、陳皮、制半夏、茯苓、白芍、白及、田七、蒲公英、甘草組成。本方由平胃散和二陳湯加減而成，方中蒼術(shù)燥濕健脾，祛風(fēng)散寒，為君藥；陳皮理氣健脾，燥濕化痰，制半夏能行水濕，降逆氣，而善祛脾胃濕痰，茯苓滲濕利水，健脾和胃，白芍養(yǎng)血和營，緩急止痛，斂陰平肝，與甘草合用取芍藥甘草湯之意以平肝斂陰，緩急止痛，四藥合用共助君藥理氣健脾，燥濕化痰，且兼止痛之效，共為臣藥；白及收斂止血，消腫生肌，善治一切瘡癤癰疽，田七化瘀止血，活血定痛，用于各種內(nèi)、外出血，胸腹刺痛等，具有止血而不留瘀，化瘀而不傷正的特點(diǎn)，蒲公英清熱解毒，消癰散結(jié)，善治肺癰、腸癰、胃火、腸炎等，三藥合用則活血行氣、散瘀止痛、止血生??；甘草調(diào)和諸藥。方中諸藥合用共奏燥濕健脾、理氣止痛、斂瘡生肌之效。

本研究結(jié)果顯示，胃舒湯組和奧美拉唑組干預(yù)后大鼠的食欲下降、活動(dòng)減少、體重減輕等現(xiàn)象迅速恢復(fù)，一般狀態(tài)良好，體重增長速度明顯高于模型組，且胃舒湯組顯著高于奧美拉唑組。進(jìn)一步病理觀察顯示，胃舒湯組的潰瘍面積、深度均顯著縮小，且潰瘍指數(shù)顯著降低，且更低于奧美拉唑組，提示胃舒湯能顯著改善胃潰瘍大鼠的組織病理，減輕胃黏膜的病理損傷，從而進(jìn)一步改善大鼠的一般狀態(tài)。模型組胃組織IL-2水平及NF-κBp65蛋白表達(dá)水平顯著高于正常組，NF-κB的過度激活及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與了GU的發(fā)病。胃舒湯組IL-2水平及NF-κBp65水平均顯著低于模型組和奧美拉唑組，反映出胃舒湯對(duì)GU的治療作用可能通過抑制NF-κB的過度激活及炎癥反應(yīng)起作用，且療效優(yōu)于奧美拉唑。

綜上，胃舒湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性GU大鼠模型具有較好的治療作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制NF-κB的活化及表達(dá)，減少炎癥因子的釋放，減輕胃黏膜的炎癥反應(yīng)及病理損傷，從而起到治療作用。

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（責(zé)任編輯：駱歡歡）

Therapeutic Effect of Weishu Tang on the Mice with Experimental Gastric Ulcer and Its Impact on NF-κB Signal Path

LAI Riming，LIU Yuedian，NIE Xujian ，NI Wenying

Objective：To observe the curative effect of Weishu tang on stomach tissue pathology， and the expression levels of interleukin-2(IL-2)and Nuclear factor-κB p65(NF-κB p65)of mice with experimental gastric ulcer，and discuss its mechanism of action.Methods：After successfully molding，forty-eight clean Wistar mice were divided into normal group，model group，omeprazole group and Weishu tang group，according to the completely random number table.The third day after molding，mice in normal group and model group were given the normal saline，while mice in omeprazole group and Weishu tang group were respectively given omeprazole capsules solution and Weishu tang by gavaging one time per daycontinuously for 13 days.During the pharmacy process，observe the general status，the morphology and the histopathology of the mice in each group and compare the stomach tissue pathological index of each group and compare the expression level of IL-2 and NF-κBp65 of stomach tissue.Results：The general status such as eating and drinking，activity and further of mice in Weishu tang group and omeprazole group were better than that in model group，and the speed of weight growth was obviously higher than that in model group，especially for the mice in Weishu tang group.The Ulcer index in Weishu tang group and omeprazole group was obviously less than that in model group(P＜0.01)，and the ulcer index of Weishu tang group was obviously less than that in omeprazole group(P＜0.01).The levels of stomach tissue IL-2 and the protein expression levels of NF-κBp65 of mice in model group were obviously higher than those in normal group(P＜0.01).The IL-2 levels and the protein expression levels of NF-κBp65 in omeprazole group and Weishu tang group were all obviously less than those in model group(P＜0.01).The levels of IL-2 and NF-κBp65 in Weishu tang group were even less than those in omeprazole group (P＜0.01).Conclusion：Weishu tang has preferable therapeutic effect on the mice with experimental gastric ulcer.Its mechanism of action may be related with restraining the excitation and expression of NF-κB and reducing the release of inflammatory factor.

Gastric ulcer；Interleukin-2(IL-2)；Nuclear factor-κB p65(NF-κB p65)；Weishu tang

R285.5

A

0256-7415（2016）06-0279-04

10.13457/j.cnki.jncm.2016.06.122

2015-12-30

賴日明（1963-），男，副主任藥師，研究方向：中藥藥理與藥事管理研究。