欖香烯逆轉(zhuǎn)肺癌化療藥物耐藥的實(shí)驗(yàn)研究

曾暉，張永軍，張愛琴，包文龍，史華，姜志明，顧丹琳

浙江省腫瘤醫(yī)院，浙江 杭州 310022

欖香烯逆轉(zhuǎn)肺癌化療藥物耐藥的實(shí)驗(yàn)研究

曾暉，張永軍，張愛琴，包文龍，史華，姜志明，顧丹琳

浙江省腫瘤醫(yī)院，浙江 杭州 310022

目的：觀察與探討欖香烯逆轉(zhuǎn)肺癌化療耐藥的作用。方法：采用細(xì)胞培養(yǎng)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分別從體外、體內(nèi)研究欖香烯逆轉(zhuǎn)化療耐藥的作用；采用噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)由含藥血清培養(yǎng)的A549肺腺癌細(xì)胞的增殖率；通過復(fù)制Lewis肺癌小鼠模型，并予欖香烯及多柔比星進(jìn)行處理，最終測(cè)量各組小鼠腫瘤的體積，計(jì)算抑瘤率。結(jié)果：細(xì)胞研究結(jié)果顯示，欖香烯、多柔比星及欖香烯+多柔比星組的Optical Density光密度值（OD值）均小于模型組（P＜0.01），而欖香烯組OD值高于多柔比星組及欖香烯+多柔比星組（P＜0.01），多柔比星組OD值高于欖香烯+多柔比星組（P＜0.01）。動(dòng)物研究結(jié)果顯示：與模型組比較，欖香烯組、多柔比星組及欖香烯+多柔比星組腫瘤體積均明顯縮?。≒＜0.01），而多柔比星組的抑瘤率高于欖香烯組（P＜0.01），低于欖香烯+多柔比星組（P＜0.01）。結(jié)論：欖香烯具有一定的抑瘤作用，且具有逆轉(zhuǎn)化療藥物耐藥的作用。

肺癌；欖香烯；多柔比星；化療耐藥

近年來，原發(fā)性肺癌的發(fā)病率和死亡率均居我國惡性腫瘤首位。雖然目前的診斷、藥物及手術(shù)方式較前有較大進(jìn)展，但患者5年生存率仍徘徊于15%左右[1]，造成這一現(xiàn)象的根本原因是治療失敗，而患者對(duì)化療藥物耐藥是導(dǎo)致治療失敗的首要原因。因此，如何預(yù)防肺癌化療藥物耐藥發(fā)生已成為現(xiàn)今研究的重點(diǎn)。

β-欖香烯(分子式C15H24，分子量204.35)是從姜科植物溫郁金中提取的有效成分。多柔比星為抗腫瘤藥中細(xì)胞毒類藥物(分子式C27H29NO11，分子量543.52)，已在基礎(chǔ)和臨床研究中證實(shí)有廣譜抗腫瘤作用，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于肺癌、胃癌、大腸癌等惡性腫瘤[2]。近年來，筆者在臨床運(yùn)用中發(fā)現(xiàn)β-欖香烯有一定逆肺癌化療耐藥的作用，故進(jìn)行了細(xì)胞與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，擬進(jìn)一步驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株 C57BL/6小鼠50只，雌雄各半，4～6周齡，體重18～22 g，與A549肺腺癌細(xì)胞同購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 β-欖香烯混合液(大連華立金港藥業(yè)有限公司，規(guī)格：每瓶20 mL/100 mg)，等量換算小鼠的用量，1 kg體重使用100 mg。多柔比星(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：每瓶10 mg)，等量換算小鼠的用量，1 kg體重使用4 mg。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 二甲基亞砜(分析純)(江蘇鴻聲化工廠)；新生牛血清(美國GIBCO公司)；胰酶(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)；RPMI1640培養(yǎng)液(美國GIBCO公司)；噻唑藍(lán)(MTT)(美國Amresco公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 SW-CJ-IF層流超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)；離心機(jī)(德國Heraeus公司)；UR-4100酶標(biāo)儀(美國Dynatech公司)；細(xì)胞培養(yǎng)板與培養(yǎng)瓶(丹麥NUNCLON公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 體外實(shí)驗(yàn) 將40只Wistar大鼠隨機(jī)分為模型組、欖香烯組、多柔比星組及欖香烯+多柔比星組(以下簡稱欖+多組) 4組，每組10只。分別予以腹腔注射生理鹽水、欖香烯(100 mg/kg)、多柔比星(4 mg/kg)及欖香烯加多柔比星(欖香烯：100 mg/kg、多柔比星：4 mg/kg)，連續(xù)注射5天。第6天，所有大鼠尾靜脈取血，分離血清用于培養(yǎng)A549肺腺癌細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后采用MTT法檢測(cè)各組A549肺腺癌細(xì)胞的增殖情況。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 40只C57BL/6小鼠分為4組復(fù)制Lewis肺癌模型：生理鹽水調(diào)整Lewis肺癌細(xì)胞濃度至1×107個(gè)/mL，0.2 mL接種于小鼠右腋皮下。造模結(jié)束后，第2天，開始藥物治療。用藥情況：4組均腹腔注射，模型組注射生理鹽水；欖香烯組注射欖香烯；多柔比星組注射多柔比星；欖+多組注射欖香烯加多柔比星。從注射當(dāng)天開始，每組隔天給藥1次，共給5次，第11天尾靜脈取血后處死小鼠，完整剝離腫瘤組織，計(jì)算腫瘤體積與抑瘤率。

2.3 檢測(cè)指標(biāo) ①細(xì)胞增殖情況：采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，利用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處的光密度OD值，以反映出活細(xì)胞數(shù)目。②瘤體積計(jì)算：游標(biāo)卡尺測(cè)小鼠腫瘤最長徑a、最短徑b，體積V=2a2b/5。③抑瘤率：抑瘤率=(對(duì)照組瘤體積-用藥組瘤體積)/對(duì)照組瘤體積×100%。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 研究結(jié)果

4.1 4組藥物對(duì)A549肺腺癌細(xì)胞增殖的影響 見表1。欖香烯組、多柔比星組及欖+多組的OD值均較模型組小(P＜0.01)，而欖香烯組OD值高于多柔比星組和欖+多組(P＜0.01)，多柔比星組OD值高于欖+多組(P＜0.01)。

表1 4組藥物對(duì)A549肺腺癌細(xì)胞增殖的影響

4.2 4組藥物對(duì)小鼠Lewis肺癌生長的影響 見表2。與模型組比較，欖香烯組、多柔比星組及欖+多組的腫瘤體積均明顯縮小(P＜0.01)，而多柔比星組的抑瘤率高于欖香烯組(P＜0.01)，低于欖+多組(P＜0.01)。

表2 4組藥物對(duì)小鼠Lewis肺癌生長的影響

5 討論

腫瘤細(xì)胞耐藥根據(jù)耐藥譜可分為原藥耐藥(PDR)和多藥耐藥(MDR)兩大類。PDR指僅對(duì)誘導(dǎo)藥物產(chǎn)生耐藥性而對(duì)其他藥物不產(chǎn)生交叉耐藥性，而MDR則指腫瘤細(xì)胞在對(duì)一種化療藥物產(chǎn)生耐藥的同時(shí)，對(duì)其他結(jié)構(gòu)不同、作用機(jī)制不同的藥物也產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象。MDR的發(fā)生，使大約90%腫瘤患者治療失敗。因此，研究MDR的發(fā)生機(jī)制、尋找有效低毒的逆轉(zhuǎn)劑及逆轉(zhuǎn)方法，對(duì)于臨床抗腫瘤治療有著重要而深遠(yuǎn)的意義，故長期以來，一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)。

目前西醫(yī)逆轉(zhuǎn)化療耐藥的藥物主要有化療逆轉(zhuǎn)劑和生物逆轉(zhuǎn)劑。前者主要有兩類：鈣離子通道阻滯劑和鈣調(diào)素抑制劑。后者主要為多種細(xì)胞因子[3]。其中，多數(shù)逆轉(zhuǎn)劑因其毒副作用，尚不能滿足臨床應(yīng)用的需要。

中醫(yī)藥具有療效高、靶點(diǎn)多、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)，在逆轉(zhuǎn)耐藥的同時(shí)有殺傷腫瘤細(xì)胞、調(diào)節(jié)和提高機(jī)體免疫功能的多重功效，故從中藥中尋找腫瘤多藥耐藥的抑制劑越來越受到科研及臨床工作者的關(guān)注。溫莪術(shù)為姜科植物蓬莪術(shù)或溫郁金、廣西莪術(shù)的根莖，β-欖香烯是從溫郁金(溫莪術(shù))中提取的有效成分，具有活血化瘀之功。已有學(xué)者研究證實(shí)活血化瘀中藥具有防止放化療毒副反應(yīng)、延長患者生存期的作用[4]，而β-欖香烯是活血化瘀藥物主要成分的濃縮，必將進(jìn)一步加強(qiáng)抗腫瘤的作用。國內(nèi)已有學(xué)者從分子、細(xì)胞水平對(duì)β-欖香烯抗腫瘤作用進(jìn)行了多途徑、多層次、大量的基礎(chǔ)研究，證實(shí)該藥物能較好地抑制肝癌細(xì)胞的生長、增殖，能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[5～6]。

本研究在借鑒前人研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究β-欖香烯對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果顯示，欖香烯組的腫瘤體積明顯小于模型組，但大于多柔比星組。說明欖香烯具有一定的抑瘤作用，但不及化療藥物，這可能與β-欖香烯的注射時(shí)間較短相關(guān)。β-欖香烯為中藥提取物，中藥一般起效較慢，但維持時(shí)間較長，因此，在臨床上應(yīng)足量、足療程使用。結(jié)果還顯示，當(dāng)多柔比星組加用欖香烯后，抑瘤率進(jìn)一步提高，由58.20%提升至74.06%，出現(xiàn)這一結(jié)果可能有兩方面的原因：①β-欖香烯的抗腫瘤作用與化療藥物多柔比星聯(lián)合使用時(shí)有協(xié)同作用；②β-欖香烯具有逆轉(zhuǎn)多柔比星耐藥的作用，通過逆轉(zhuǎn)耐藥，使多柔比星的細(xì)胞毒性增強(qiáng)，抑瘤作用進(jìn)一步提高。對(duì)于后一種機(jī)理，有待進(jìn)一步研究。而關(guān)于欖香烯逆轉(zhuǎn)化療耐藥的研究機(jī)理，姜志明等[7]研究認(rèn)為是通過抑制Bcl-2基因的生物學(xué)活性；姚成才等[8]認(rèn)為是抑制P-gp的功能和表達(dá)。但中醫(yī)藥抗腫瘤是多靶點(diǎn)、多途徑的，是否存在其他靶點(diǎn)，筆者將繼續(xù)追蹤。

[1] Molina JR，Yang P，Cassivi SD，et al．Non-small cell lung cancer：epidemiology，risk factors，treatment，and survivorship[J]．Mayo Clin Proc，2008，83(5)：584-594.

[2] 吳稚冰，馬勝林．β-欖香烯抗腫瘤作用的研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011，29(10)：2255-2257．

[3]肖海娟，范忠澤，許建華，等．中醫(yī)藥逆腫瘤多藥耐藥的機(jī)制研究進(jìn)展[J]．中國中醫(yī)藥信息雜志，2012，19 (6)：108-110.

[4]苑艷娟，王智森，劉亞嫻．活血化瘀藥物在治療惡性腫瘤過程中的作用[J]．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，10 (6)：26-27．

[5]郭霞，秦巖，譚婧．欖香烯對(duì)肝癌H22細(xì)胞荷瘤小鼠的抑瘤作用及其可能機(jī)制[J]．中國臨床藥學(xué)雜志，2013，22(3)：155-159.

[6]歐陽俊，沈洪，劉軍樓，等．β-欖香烯抗肝癌的促凋亡機(jī)制研究[J]．世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2014，16 (4)：738-742.

[7]姜志明，吳稚冰，凌志強(qiáng)，等．β-欖香烯聯(lián)合熱療和順鉑對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞HSP70及耐藥基因的影響[J]．全科醫(yī)學(xué)臨床與教育，2011，9(1)：38-41.

[8] 姚成才，涂遠(yuǎn)榮，杜好信，等．欖香烯乳劑對(duì)肺癌A549/DDP細(xì)胞株耐藥逆轉(zhuǎn)作用及其機(jī)制[J]．現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2013，21(12)：2670-2673．

（責(zé)任編輯：吳凌，劉迪成）

Experimental Study of Elemene on Reversing Chemotherapy Drug Resistance of Lung Cancer

ZENG Hui， ZHANG Yongjun，ZHANG Aiqin，BAO Wenlong，SHI Hua，JIANG Zhiming，GU Danlin

Objective：To observe and discuss the effect of elemene on reversing chemotherapy drug resistance of lungcancer.Methods：With the application of cell culture and animal experiment，the effect of elemene on reversing the chemotherapy drug resistance of lung cancer was study in vitro and in vivo.Detect the proliferation rate of A549 lung adenocarcinoma cell cultured in the drug serum in the way of MTT.Duplicate mice model with Lewis lung cancer，deal with the elemene and doxorubicin and finally measure the tumor volume of the mice in each group to calculate the anti-tumor rate. Results：The cell research result showed that the optical density of elemene group or doxorubicin group or elemene combined with doxorubicin group were all less than that in model group(P＜0.01).The optical density in elemene group was more than that in doxorubicin group and the elemene combined with doxorubicin group(P＜0.01).The optical density in doxorubicin group was more than that in the elemene combined with doxorubicin group(P＜0.01).The animal research showed that，comparing with the model group，the tumor volume in elemene group，doxorubicin group and elemene combined with doxorubicin group was dropped obviously(P＜0.01).While the anti-tumor rate of doxorubicin group was higher than that in elemene group(P＜0.01)，and was lower than that in the elemene combined with doxorubicin group(P＜0.01).Conclusion：Elemene has certain antitumor effect and effect of reversing the chemotherapy drug resistance.

Lung cancer；Elemene；Doxorubicin；Chemotherapy resistance

R285.5

A

0256-7415（2016）06-0271-03

10.13457/j.cnki.jncm.2016.06.119

2016-02-13

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LY13H290006）

曾暉（1983-），男，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤綜合治療的臨床工作。

張永軍，E-mail：zhangyj@zjcc.org.cn。