基于UPLC-Q-TOF MS分析加工炮制對玄參化學成分的影響

王靜哲，劉　震，馬立滿，李　軍，尚明英，劉廣學，徐　風，蔡少青

(北京大學藥學院，北京　100191)

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基于UPLC-Q-TOF MS分析加工炮制對玄參化學成分的影響

王靜哲，劉震，馬立滿，李軍，尚明英，劉廣學，徐風，蔡少青

(北京大學藥學院，北京100191)

摘要：為了全面闡明玄參加工工藝對其化學成分的影響，采用UPLC-Q-TOF MS技術對烘干玄參和傳統(tǒng)加工玄參的化學成分進行分析比較，并運用主成分分析法(PCA)和正交偏最小二乘辨別分析法(OPLS-DA)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，尋找差異性成分，同時依據(jù)一級質(zhì)譜精確質(zhì)荷比和二級質(zhì)譜碎片信息進行成分解析。結果表明：與烘干玄參相比，傳統(tǒng)加工玄參中共有26種成分的含量變化顯著，實驗鑒定出了其中的15種成分，包括9種環(huán)烯醚萜類化合物和6種苯丙素類化合物；含量降低的成分有桃葉珊瑚苷、6-O-甲基梓醇、哈巴俄苷、8-O-香豆?；投碥?、8-O-阿魏?；投碥铡⒏裢熊?、異阿格托苷、安格洛苷 C和scrophuloside B1，其中scrophuloside B1為玄參中首次發(fā)現(xiàn)的成分；含量增加的成分有哈巴苷、哈巴俄苷同分異構體、6″-O-α-D-半乳糖哈巴俄苷、6-O-α-D-半乳糖哈巴俄苷、斬龍劍苷A和肉桂酸。本工作對研究玄參加工炮制機制有重要意義，同時可為闡明玄參藥效的物質(zhì)基礎提供依據(jù)。

關鍵詞：玄參；加工炮制；UPLC-Q-TOF MS；主成分分析法(PCA)；正交偏最小二乘辨別分析法(OPLS-DA)

doi：10.7538/zpxb.youxian.2015.0042

網(wǎng)絡出版時間：2015-09-09；網(wǎng)絡出版地址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20150909.1515.008.html

玄參為常用中藥，是玄參科植物浙玄參(ScrophularianingpoensisHemsl)的干燥根，主產(chǎn)地為浙江省[1]，是“浙八味”之一，具有滋陰涼血、瀉火解毒的傳統(tǒng)功效[2]。玄參的水浸液、醇提液和煎劑均有降血壓作用[3]，據(jù)文獻報道，玄參主要含有環(huán)烯醚萜苷、苯丙素苷、苯乙醇苷類及多糖等化學成分[4-5]。其中，環(huán)烯醚萜類成分哈巴俄苷能使陰虛小鼠抑制的免疫功能恢復[6]，苯丙素類成分有明顯的抗炎作用[7]，多糖類成分具有抗疲勞的作用[8]。

傳統(tǒng)加工炮制玄參的方法為“發(fā)汗”法，即將新鮮玄參曬或烘至半干，堆放3~6天，反復數(shù)次至干燥[2]。方學敏等[9]運用紫外檢測法研究玄參炮制前后多糖含量的變化，發(fā)現(xiàn)炮制后玄參中的多糖成分含量下降。本課題組[10-11]曾運用HPLC-DAD法研究玄參不同加工品中哈巴俄苷和肉桂酸的含量，發(fā)現(xiàn)玄參鮮材切片烘干品中哈巴俄苷含量高于傳統(tǒng)加工品，肉桂酸含量低于傳統(tǒng)加工品；運用HPLC-UV波長轉換法測定了玄參藥材及飲片中哈巴苷與哈巴俄苷的含量，發(fā)現(xiàn)玄參經(jīng)炮制后可使哈巴俄苷含量下降，而使哈巴苷含量升高。迄今對玄參加工炮制的研究報道主要集中在哈巴俄苷、哈巴苷和肉桂酸等少數(shù)化學成分在炮制前后含量上的變化，這僅是對幾個特定的化合物進行研究，而對于化學成分復雜的中藥而言，所得到的信息不夠全面，不能很好地闡明傳統(tǒng)加工對玄參化學成分的影響。因此，本工作擬采用UPLC-Q-TOF MS技術，結合主成分分析法(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘判別分析法(orthogonal partiallest squared discriminant analysis,OPLS-DA)，對烘干玄參和傳統(tǒng)加工玄參的化學成分進行系統(tǒng)的研究，試圖闡明玄參經(jīng)“發(fā)汗”法炮制后化學成分的變化情況。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

Xevo G2 UPLC-Q-TOF MS色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Waters公司產(chǎn)品，配有Masslynx4.1質(zhì)譜工作站；DHG-9000系列烘干機：上海市一恒科學儀器有限公司產(chǎn)品；KQ500DE型超聲儀：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；冷凍干燥機：金西盟(北京)儀器有限公司產(chǎn)品；Milli-Q超純水制備儀：美國Millipore公司產(chǎn)品。

甲醇(A452-4)：色譜純，美國Fisher公司產(chǎn)品；甲酸(zk3004)：色譜純，美國ROE公司產(chǎn)品；乙腈(134491)：質(zhì)譜純，美國Fisher公司產(chǎn)品；實驗用水為Milli-Q超純水；新鮮玄參藥材：于2013年12月23日購于浙江省磐安縣玄參種植基地，經(jīng)尚明英副教授鑒定為玄參科植物浙玄參ScrophularianingpoensisHemsl的根。

1.2樣品的制備

傳統(tǒng)加工玄參：將采購的新鮮玄參的一部分委托當?shù)厮庌r(nóng)用傳統(tǒng)“發(fā)汗法”干燥得傳統(tǒng)加工玄參。烘干玄參：將新鮮玄參的另一部分運到本實驗室切片(厚度約2 mm)后，于50 ℃烘干(約22.5 h)得烘干玄參。

1.3供試品溶液的制備

分別精密稱取1.0 g傳統(tǒng)加工玄參和烘干玄參粉末(過40目篩)，置于具塞錐形瓶中，加入20 mL 50%甲醇，密閉，于25 ℃超聲提取30 min，然后過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

1.4實驗條件

1.4.1色譜條件色譜柱：Acquity BEH C18柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)；柱溫40 ℃；流動相：A為0.1%甲酸-水溶液，B為乙腈；梯度洗脫；洗脫程序為：0~1.6 min、3%~20%B，1.6~2.96 min、20%~30%B，2.96~3.8 min、30%~47%B，3.8~4.5 min、47%~50%B，4.5~4.9 min、50%~60%B，4.9~5.2 min、60%~70%B，5.2~5.7 min、70%~90%B，5.7~6.0 min、90%~100%B，6.0~8.9 min、100%B；流速0.4 mL/min；進樣量0.5 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件采用ESI離子源，負離子模式下采集數(shù)據(jù)；數(shù)據(jù)采集范圍m/z100～1 200；毛細管電壓2 000 V；錐孔電壓40 V；離子源溫度110 ℃；脫溶劑氣溫度500 ℃；霧化氣(N2)流速50 L/h；脫溶劑氣(N2)流速800 L/h;碰撞能量(CE)15~40 V；質(zhì)量校正質(zhì)荷比m/z554.261 5。

1.5方法學考察

1.5.1穩(wěn)定性實驗精密吸取同一供試品溶液，分別于0、1、3、5、7、9 h進樣檢測，各主要色譜峰的相對保留時間RSD值均小于0.16%，相對峰面積RSD值均小于3.25%。實驗結果表明，供試品溶液在9 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.5.2精密度實驗精密吸取同一供試品溶液，連續(xù)進樣6 次，各主要色譜峰的相對保留時間RSD 值均小于0.21%，相對峰面積RSD值均小于3.20%，這表明儀器精密度良好。

1.5.3重復性實驗精密稱取1 g同一份樣品，按1.3節(jié)方法制備供試品溶液6份，各主要色譜峰的相對保留時間RSD值均小于0.16%，相對峰面積RSD值均小于2.98%，表明該方法重復性良好。

1.6樣品測定及數(shù)據(jù)分析

分別取烘干玄參及傳統(tǒng)加工玄參粉末制備的供試品溶液各6份，用UPLC-Q-TOF MS儀器分析(所有供試品均在2014年9月完成制備和檢測)。所得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)Masslynx 4.1軟件處理后，將數(shù)據(jù)導入SIMCA-P 13.0.3 demo版統(tǒng)計軟件，進行主成分分析和正交偏最小二乘辨別分析。

2結果與討論

2.1傳統(tǒng)加工玄參與烘干玄參的性狀差異

傳統(tǒng)加工玄參為個子藥材，直徑1~3 cm，長度6~20 cm，表面呈深棕色，質(zhì)堅實，斷面色漆黑，木質(zhì)部韌皮部紋理均不可見。烘干玄參為飲片，厚2 mm左右，寬1~3 cm，表面棕色，質(zhì)脆，斷面乳白色，木質(zhì)部韌皮部紋理可見。

2.2烘干玄參和傳統(tǒng)加工玄參樣品中化學成分的UPLC-Q-TOF MS檢測結果

本研究對烘干玄參和傳統(tǒng)加工玄參樣品進行了液相色譜-質(zhì)譜分析，它們在負離子模式下的基峰強度離子流圖(BPI)示于圖1。由圖1可知，烘干玄參和傳統(tǒng)加工玄參的主要色譜峰峰形和保留時間基本一致，但部分色譜峰的相對峰面積值變化較大。

圖1　負離子模式下，烘干玄參(a)和傳統(tǒng)加工玄參(b)的BPI圖Fig.1　BPI of dried (a) and processed (b) Scrophulariae Radix by UPLC-Q-TOF MS in negative ions mode

2.3UPLC-Q-TOF MS數(shù)據(jù)的PCA分析

在負離子模式下，烘干玄參和傳統(tǒng)加工玄參樣品的UPLC-Q-TOF MS數(shù)據(jù)PCA分析的得分圖示于圖2。每個點代表一個樣品，橫、縱坐標分別為第一、第二主成分得分。可以看出，烘干玄參和傳統(tǒng)加工玄參樣品在第一主成分得分上有明顯差異，即分別聚向橫軸的相反方向，表明二者UPLC/Q-TOF-MS數(shù)據(jù)的差異特征明顯。

圖2　負離子模式下，烘干玄參和傳統(tǒng)加工玄參樣品的PCA得分圖Fig.2　Score plots of PCA for dried and processedScrophulariae Radix in negative ions mode

圖3　負離子模式下,烘干玄參和傳統(tǒng)加工玄參樣品的OPLS-DA差異成分的S-plot曲線Fig.3　S-plots curve of OPLS-DA for dried andprocessed Scrophulariae Radix in negative ions mode

2.4UPLC-Q-TOF MS數(shù)據(jù)的OPLS-DA分析

在負離子模式下，烘干玄參和傳統(tǒng)加工玄參樣品的UPLC-Q-TOF MS數(shù)據(jù)OPLS-DA分析的S-plot圖示于圖3。圖中每個點代表一個變量，即位于某個保留時間的某個質(zhì)荷比的信號。橫坐標代表變量的貢獻度(協(xié)方差)，縱坐標代表變量的相關性(可信度)，在-1~1之間取值。烘干玄參與傳統(tǒng)加工玄參之間差異顯著的分子離子峰分布在S曲線的兩端，S曲線的右上角代表了烘干玄參與傳統(tǒng)加工玄參相比含量較高的化合物的分子離子峰，S曲線的左下角代表了傳統(tǒng)加工玄參與烘干玄參相比含量較高的化合物的分子離子峰，越靠近S曲線兩端的點，所代表的分子離子峰對兩組樣品間的差異貢獻越大。

通過對照兩組玄參UPLC/Q-TOF的BPI譜圖，并結合OPLS-DA模型的VIP 參數(shù)，可尋找烘干玄參和傳統(tǒng)加工玄參間的差異性化學成分。通過比較傳統(tǒng)加工玄參與烘干玄參，本實驗共發(fā)現(xiàn)26種化學成分的含量具有顯著性差異。將26種化學成分在烘干玄參中的峰面積與傳統(tǒng)加工玄參中各自峰面積的比值作為量化指標，能夠反映出26種差異性化學成分在兩種玄參間的量變趨勢及幅度，詳情列于表1。

2.5烘干玄參與傳統(tǒng)加工玄參差異性成分的鑒定

依據(jù)化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律并參考文獻數(shù)據(jù)對炮制前后發(fā)生量變的成分進行結構解析，共鑒定出15種化合物的結構，其中包括9種環(huán)烯醚萜類化合物和6種苯丙素及其苷類成分。但仍有11種化合物(峰2、5、6、14、17～19、22、25、26)的結構未見文獻報道，本實驗尚不能對其進行鑒別，其結構的確認還有待于進一步研究。

26種含量差異的化學成分中，傳統(tǒng)加工玄參中含量高于烘干玄參的成分有7種，鑒定出了其中的6種，包括4種環(huán)烯醚萜類，分別為哈巴苷(1.24倍)、哈巴俄苷同分異構體(1.35倍)、6″-O-α-D-半乳糖哈巴俄苷(2.58倍)和6-O-α-D-半乳糖哈巴俄苷(1.88倍)；2種苯丙素類，分別為肉桂酸(4.06倍)和斬龍劍苷 A(3.98倍)。傳統(tǒng)加工玄參中含量低于烘干玄參的成分有19種，鑒定出了其中的9種，包括5種環(huán)烯醚萜類，分別為桃葉珊瑚苷(0.27倍)、6-O-甲基梓醇(0.21倍)、哈巴俄苷(0.53倍)、8-O-香豆?；投碥?0.78倍)和8-O-阿魏?；投碥?0.50倍)；4種苯丙素苷類，分別為阿格托苷(0.16倍)、異阿格托苷(0.19倍)、安格洛苷 C(0.93倍)和scrophuloside B1(0.28倍)。

表1傳統(tǒng)加工玄參中26種化學成分相對烘干玄參的變化情況(n=6)及差異性化學成分的鑒定

Table 1Changes of 26 chemical constituents in processedScrophulariaeRadixcomparing

with dried samples (n=6) and identification of the difference chemical constituents

峰號tR/min選擇離子分子式誤差/10-6碎片離子峰面積比含量對比化合物鑒定11.293391.1239[M+HCOO]-C15H22O9-0.3345.1190,83.0658,165.0554,139.04000.27低**桃葉珊瑚苷[12]21.400509.1510[M-H]-C18H30O150.8383.1206,323.0947,253.0836,195.0509,0.09低**—183.0664,179.0567,161.045731.507409.1342[M+HCOO]-C15H24O10-1.0363.1295,201.0753,183.0648,164.0704,139.03861.24高**哈巴苷[12]41.741421.1332[M+HCOO]-C16H24O10-3.3375.1288,213.0757,195.0652,183.0657,151.03940.21低**6-O-甲基梓醇[12]51.876405.1382[M-H]-C17H26O11-3.7183.0640,179.0566,165.05580.23低**—62.459841.2621[M+HCOO]-C33H48O220.8795.2554,647.2062,341.1105,249.1328,179.05543.91高**—72.772623.1971[M-H]-C29H36O15-0.8461.1637,315.1052,179.0332,161.02290.16低**阿格托苷[12]82.815769.2552[M-H]-C35H46O19-0.4593.2094,193.0518,175.0394,163.0386,0.28低**scrophulosideB1[13]145.0300,135.044792.950623.1976[M-H]-C29H36O150461.1641,315.0991,179.0316,161.02330.19低**異阿格托苷[14]103.000517.1553[M+HCOO]-C21H28O12-0.8471.1487,323.0976,161.0283,147.04393.98高**斬龍劍苷A[12,15]113.213783.2706[M-H]-C36H48O19-0.8607.2245,461.1671,193.0496,175.0390,0.93低*安格洛苷C[12]167.0705,149.0443123.291637.2135[M-H]-C30H38O150.5193.0478,175.0401,161.0238,146.95980.29低**—133.313509.1643[M-H]-C24H30O12-3.1329.1005,285.0816,183.0638,163.0385,0.78低**8-O-香豆?；投碥誟12,16]161.0231,146.9598

續(xù)表1

注：“—”表示未鑒定；“*”表示p<0.05；“**”表示p<0.01

scrophuloside B1(化合物8)為玄參中首次發(fā)現(xiàn)，在玄參的同屬植物Scrophularianodosa中發(fā)現(xiàn)過該化合物。高分辨質(zhì)譜給出的化合物8的準分子離子峰為m/z769.254 7[M-H]-，推測其分子式為C35H46O19；高分辨質(zhì)譜給出的化合物11的準分子離子峰為m/z783.271 3[M-H]-，推測其分子式為C36H48O19，二者相差14 u(CH2)。根據(jù)二級質(zhì)譜中碎片離子及文獻數(shù)據(jù)推測化合物11為angoroside C[11]?；衔?的二級質(zhì)譜中出現(xiàn)了與化合物11相同的阿魏酸離子碎片m/z193.047 9[ferulic acid-H]-，還出現(xiàn)了鼠李糖離子碎片m/z163.038 6[rhamnose-H]-；化合物11出現(xiàn)中性丟失176 u的碎片離子m/z607.224 5[M-H-feruloyl]-，及進一步丟失鼠李糖基(146 u)的碎片離子m/z461.167 1，因此判斷化合物8和11有著相似的結構片段。在化合物8中可見3,4-二羥基苯乙醇的碎片離子m/z135.044 7[C8H10O3-H-H2O]-，化合物11中卻可見3-羥基-4-甲氧基苯乙醇的碎片離子m/z167.070 5[C9H12O3-H]-和m/z149.044 3[C9H12O3-H-H2O]-，3,4-二羥基苯乙醇和3-羥基-4-甲氧基苯乙醇在結構上相差CH2，與二者分子質(zhì)量相差14 u相符，因此推測化合物8為化合物11的同系物scrophuloside B1[13]，二者的結構式示于圖4。

圖4　Scrophuloside B1和angoroside C的結構式Fig.4　Structural formula of scrophuloside B1and angoroside C

傳統(tǒng)加工玄參中化學成分的含量(峰面積值)有些高于烘干玄參中的含量，有些則低于烘干玄參中的含量，推測是某些成分在炮制過程中發(fā)生了化學反應，轉化成了其他的成分。例如，在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)加工玄參中哈巴俄苷含量低于烘干玄參中的含量，而哈巴苷和肉桂酸含量高于烘干玄參中的含量，據(jù)此推測哈巴俄苷在炮制過程中水解生成哈巴苷和肉桂酸，反應途徑示于圖5，這與本課題組前期的研究結果相一致[11]。

傳統(tǒng)加工玄參中8-O-香豆?；蛙张c8-O-阿魏?；蛙蘸恳驳陀诤娓尚⒅泻浚吲c哈巴俄苷結構類似，因此推測二者在炮制過程中發(fā)生了與哈巴俄苷類似的反應，分別水解脫掉香豆酸與阿魏酸生成哈巴苷，這一反應可使哈巴苷含量升高。

傳統(tǒng)加工炮制玄參中6″-O-α-D-半乳糖哈巴俄苷和6-O-α-D-半乳糖哈巴俄苷含量高于烘干玄參中的含量，它們的結構均為在哈巴俄苷上結合了一分子半乳糖，因此推測玄參在加工炮制過程中哈巴俄苷可能與半乳糖發(fā)生結合反應。同時發(fā)現(xiàn)哈巴俄苷的同分異構體含量也增加，推測加工炮制可能使部分哈巴俄苷轉化為同分異構體，以上這兩種反應均可導致哈巴俄苷含量下降。

傳統(tǒng)加工玄參中斬龍劍苷A含量高于烘干玄參中含量，斬龍劍苷 A的結構為肉桂酸結合一分子蔗糖，因此推測玄參在加工炮制過程中肉桂酸與蔗糖發(fā)生了結合反應。

傳統(tǒng)加工玄參中環(huán)烯醚萜苷桃葉珊瑚苷和6-O-甲基梓醇與苯丙素苷阿格托苷、異阿格托苷、scrophuloside B1和安格洛苷 C含量低于烘干玄參中含量，推測這些化合物在加工炮制過程中可能發(fā)生了苷鍵水解反應。

圖5　玄參炮制過程中哈巴俄苷和哈巴苷的變化Fig.5　Changes of harpagoside and harpagide during the processing of Scrophulariae Radix

3結論

本實驗采用UPLC-Q-TOF MS技術對烘干玄參及傳統(tǒng)加工玄參中的化學成分進行快速分析，并用SIMCA-P 13.0.3軟件進行主成分分析和正交偏最小二乘判別分析，發(fā)現(xiàn)玄參炮制前后有26種化學成分含量具有顯著差異。其中，傳統(tǒng)加工玄參中含量高于烘干玄參的成分有7種，低于烘干玄參的成分有19種，且這些化合物含量變化幅度不等，這些炮制后發(fā)生量變的成分可能與玄參的傳統(tǒng)功效密切相關。依據(jù)質(zhì)譜裂解規(guī)律并參考文獻數(shù)據(jù)，對炮制前后發(fā)生量變的化合物進行結構解析，共鑒定了15個化合物的結構，除哈巴苷、肉桂酸、哈巴俄苷、阿格托苷和安格洛苷C外[10-11,22]，其余10個化合物為首次發(fā)現(xiàn)的差異性成分，化合物scrophuloside B1為玄參中首次報道的化學成分。

本實驗應用UPLC-Q-TOF MS技術和多元統(tǒng)計學方法研究加工炮制對玄參化學成分的影響，該方法能夠直觀準確地反映玄參炮制前后化學成分的變化情況，對進一步研究玄參加工炮制機制具有重要意義，同時也為玄參藥效物質(zhì)基礎的闡明提供了重要依據(jù)。

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Changes of Chemical Constituents inScrophulariaeRadix

During Processing Based on UPLC-Q-TOF MS

WANG Jing-zhe, LIU Zhen, MA Li-man, LI Jun, SHANG Ming-ying,

LIU Guang-xue, XU Feng, CAI Shao-qing

(SchoolofPharmaceuticalSciences,PekingUniversity,Beijing100191,China)

Abstract:In order to clarify the influence of the traditional processing on the chemical constitution ofScrophulariaeRadix, the UPLC-Q-TOF MS method was used to analyze the dried and processedScrophulariaeRadix. Data were processed by principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squared discriminant analysis (OPLS-DA) to find the difference between dried and processedScrophulariaeRadix. The accuratem/zvalues of Q-TOF MS and Q-TOF MS/MS fragments were applied to constitution identification. The results show that a total of 26 constituents have significant differences between dried and processedScrophulariaeRadix. Fifteen constituents are identified, including 9 iridoid glycosidesand 6 phenylpropanoid glycosides. Compared with the driedScrophulariaeRadix, the contents of aucubin, 6-O-methylcatapol, harpagoside, 8-O-cumaroylharpagide, 8-O-feruloylharpagide, acteoside, isoacteoside, angoroside C and scrophuloside B1in processedScrophulariaeRadixwereare decreasing. The contents of harpagide, harp agoside isomer, 6″-O-α-D-galactopyranosylharp agoside, 6-O-α-D-galactopyranosylharp agoside, sibirioside A and cinnamic acid are increasing. InScrophulariaeRadix, scrophuloside B1is detected for the first time. The UPLC/Q-TOF-MS method proves to have a high sensitivity and the result isaccurate and reliable. The method could fully reflect the changes of multiple chemical constituents in the course of processing and lay a good foundation for the further study of processing mechanism of traditional Chinese medicine.

Key words：ScrophulariaeRadix; processing; UPLC-Q-TOF MS; PCA; OPLS-DA

通信作者：尚明英(1963—)，女(漢族)，山東臨沂人，副教授，從事生藥質(zhì)量控制及有效成分研究。E-mail: myshang@bjmu.edu.cn

作者簡介：王靜哲(1988—)，女(漢族)，河北石家莊人，碩士研究生，生藥學專業(yè)。E-mail: wjingzhe2012@163.com

基金項目：國家自然科學基金項目(81274074)資助

收稿日期：2015-01-26;修回日期：2015-04-07

中圖分類號：O657.63

文獻標志碼：A

文章編號：1004-2997(2016)01-0001-09