高效液相色譜法測(cè)定連花清瘟顆粒中連翹酯苷A含量

蔡清宇　唐慧慧　李曼玲　康琛

摘要：目的 建立連花清瘟顆粒中連翹酯苷A含量的高效液相色譜測(cè)定方法，為更好地控制連花清瘟顆粒質(zhì)量提供參考。方法 采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-0.4%冰醋酸（15∶85），流速為1 mL/min，柱溫為室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm。結(jié)果 連翹酯苷A在0.1～1.4 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=1240X-16.82（r=0.999 9），平均回收率為101.53%，RSD=1.71%。結(jié)論 本方法準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好，能測(cè)定連花清瘟顆粒中連翹酯苷A含量，可作為連花清瘟顆粒質(zhì)量控制的含量檢測(cè)方法。

關(guān)鍵詞：連花清瘟顆粒；連翹酯苷A；高效液相色譜法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.027

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）02-098-03

Content Determination of Forsythoside A in Lianhua Qingwen Granules by HPLC CAI Qing-yu1， TANG Hui-hui1， LI Man-ling2， KANG Chen2 （1. Navy General Hospital， Beijing 100048， China； 2. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

Abstract： Objective To provide a better reference for the quality control of Lianhua Qingwen Granules by establishing the method for the content determination of Forsythoside A in Lianhua Qingwen Granules by HPLC. Methods The chromatographic conditions were Agilent C18 as chromatographic column， acetonitrile-0.4% acetic acid （15∶85） as the mobile phase； the flow rate was 1.0 mL/min； the column temperature was at room temperature； the detection wavelength was 330 nm. Results Forsythoside A was in a good linear range between 0.1–1.4 μg； regression equation was Y=1240X?16.82 （r=0.999 9）； the average recovery was 101.53%， RSD=1.71%.Conclusion The method is accurate， reliable， and with good repeatability， which can be used for the content determination of Forsythoside A in Lianhua Qingwen Granules and the quality control of Lianhua Qingwen Granules.

Key words： Lianhua Qingwen Granules； Forsythoside A； HPLC

連花清瘟顆粒收載于2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》第二增補(bǔ)本，同時(shí)收載的其他劑型還有連花清瘟片、連花清瘟膠囊[1]，均由連翹、金銀花、麻黃（炙）、苦杏仁（炒）、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、魚(yú)腥草、廣藿香、大黃、紅景天、薄荷腦、甘草13味中藥組成。該組方源于麻杏石甘湯與銀翹散，功能清瘟解毒、宣肺泄熱，臨床廣泛用于中醫(yī)辨證屬表寒里熱證患者的治療，對(duì)非重癥社區(qū)獲得性肺炎在聯(lián)合西醫(yī)抗感染治療的基礎(chǔ)上治愈率更高，安全性好[2-4]。關(guān)于連花清瘟顆粒及另2個(gè)劑型的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，目前只收載了連翹苷的含量測(cè)定項(xiàng)，未見(jiàn)制劑中連翹酯苷A的含量測(cè)定及限度規(guī)定。本研究建立高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定其主要成分連翹酯苷A含量的方法，為提高該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

安捷倫1100液相色譜儀，CHEM32工作站，G1314A UV檢測(cè)器；色譜柱kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；超聲波清洗器KQ-100（昆山市超聲儀器有限公司）。

連翹酯苷A對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用（批號(hào)111810-201304）；連花清瘟顆粒為市售，北京以嶺藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批號(hào)1402080、1403004、1403079）；乙腈，甲醇為色譜純，冰醋酸為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 稱取連翹酯苷A對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0. 1 mg的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70% 甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率100 W，頻率40 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取陰性樣品（除連翹外其他藥材制成的成藥），按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈- 0.4%冰醋酸（15∶85）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，理論板數(shù)按連翹酯苷A峰計(jì)算不低于3 000[5]。

2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品溶液1、4、10、12、14 μL分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以對(duì)照品的峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品量（μg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，連翹酯苷A回歸方程為Y=1240X+16.82，r=0.999 9，表明連翹酯苷A在0.1～1.4 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗(yàn)

取上述已制備的供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記率錄色譜圖，結(jié)果計(jì)算得連翹酯苷A峰面積RSD=0.82%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取本品顆粒劑，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于第0、1、2、4、8、12、24 h進(jìn)行測(cè)定，每次進(jìn)樣10 μL，結(jié)果供試品中連翹酯苷A含量的RSD=0.85%，表明該方法制備的供試品溶液在24 h內(nèi)含量基本不變。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

選擇同一批號(hào)樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果供試品中連翹酯苷A含量RSD=1.88%，重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的連花清瘟顆粒，按1∶1比例分別添加連翹酯苷A對(duì)照品，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，測(cè)定，結(jié)果表明平均回收率為101.53%，RSD=1.71%，見(jiàn)表1。

2.8 空白試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液，進(jìn)樣10 μL，結(jié)果連花清瘟顆粒的陰性對(duì)照溶液，在連翹酯苷A處未出現(xiàn)相同保留時(shí)間的色譜峰，表明無(wú)干擾，此方法可行。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.9 樣品測(cè)定

取連花清瘟顆粒3批，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，按上述色譜條件，平行測(cè)定3次，采用外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

本試驗(yàn)主要參考2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）中連翹藥材中連翹酯苷A測(cè)定條件測(cè)定連花清瘟顆粒中連翹酯苷A含量，流動(dòng)相為乙腈- 0.4%冰醋酸（15∶85），同時(shí)對(duì)流動(dòng)相比例乙腈-0.4%冰醋酸（17∶83）及乙腈-0.4%冰醋酸（20∶80）進(jìn)行了研究，結(jié)果均不理想，故仍選用乙腈-0.4%冰醋酸（15∶85）為流動(dòng)相。

根據(jù)文獻(xiàn)[5]確定采用甲醇后分別對(duì)60%、70%、80%不同濃度的溶劑進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明70%甲醇制備的樣品測(cè)得含量較高，故選用70%甲醇作為提取溶劑。本研究分別對(duì)15、20、25 mL溶劑用量進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，25 mL甲醇制備的樣品測(cè)得含量較高，故選擇加入25 mL甲醇。確定以上條件后，分別對(duì)冷浸、超聲處理、回流3種不同提取方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，超聲處理及回流方法測(cè)得樣品含量接近，冷浸略低，故選用超聲處理作為提取方法。然后分別對(duì)超聲處理20、30、40 min進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，超聲處理20 min略低，30、40 min測(cè)得樣品含量接近，故選用超聲處理30 min。

另外，本研究測(cè)得3批樣品中的連翹酯苷A含量分別為15.42、17.34、18.70 mg/袋，故暫定其每袋含連翹酯苷A不得少于13 mg。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)人民共和國(guó)藥典：第二增補(bǔ)本[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2013：35-36.

[2] 李彬，孟泳.蓮花清瘟顆粒治療急性上呼吸道感染60例臨床觀察[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2014，17（9）：38-39.

[3] 周三軍，方強(qiáng).連花清瘟顆粒治療痰熱壅肺型社區(qū)獲得性肺炎46例[J].浙江中醫(yī)雜志，2014，48（11）：805.

[4] 王代平，黃巍.連花清瘟顆粒治療非重癥社區(qū)獲得性肺炎療效觀察[J].熱帶病與寄生蟲(chóng)學(xué)，2014，12（3）：176-177.

[5] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)人民共和國(guó)藥典：一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：159-160.

（收稿日期：2015-05-14）

（修回日期：2015-06-01；編輯：陳靜）