促進(jìn)Aβ 42形成不溶性聚集物的一種真菌化合物

鄒永東，梁澤秋，董　瑤，陳國棟，劉國寶，鄭易之

1)深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，廣東深圳 518060；2)深圳市微生物基因工程重點實驗室，廣東深圳 518060；

3)深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室，廣東深圳 518060；

4)暨南大學(xué)藥學(xué)院，中藥及天然藥物研究所，廣東廣州510632

?

Received：2015-09-22；Accepted：2015-12-07

Foundation：National Natural Science Foundation of China (81202441)

? Corresponding author：Professor Zheng Yizhi. E-mail: yzzheng@szu.edu.cn

Citation：Zou Yongdong, Liang Zeqiu, Dong Yao, et al. Promoting action of demethoxyviridin on Aβ 42 oligomers to form insoluble macromolecule aggregates[J]. Journal of Shenzhen University Science and Engineering, 2016, 33(1): 25-32.(in Chinese)

【生物工程 / Bioengineering】

促進(jìn)Aβ 42形成不溶性聚集物的一種真菌化合物

鄒永東1,2，梁澤秋1,2，董瑤1,3，陳國棟4，劉國寶1,2，鄭易之1,2

1)深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，廣東深圳 518060；2)深圳市微生物基因工程重點實驗室，廣東深圳 518060；

3)深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室，廣東深圳 518060；

4)暨南大學(xué)藥學(xué)院，中藥及天然藥物研究所，廣東廣州510632

摘要：β-類淀粉蛋白42 (amyloid-β 42, Aβ 42)聚集形成的可溶性寡聚體具有神經(jīng)細(xì)胞毒性，是引起阿爾茨海默癥的主要原因之一．通過濁度法、聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)和原子力顯微鏡(atomic force microscopy, AFM)技術(shù)，分析在真菌化合物demethoxyviridin存在情況下，Aβ 42聚集過程中熒光強(qiáng)度、濁度、寡聚體和聚集物的比例及顆粒表觀形態(tài)等動態(tài)變化之間的對應(yīng)關(guān)系．結(jié)果表明，化合物demethoxyviridin可明顯促進(jìn)Aβ 42小分子寡聚體形成高分子量寡聚體后，形成不溶性大分子聚集物沉淀，減少可溶性Aβ 42寡聚體比例．探討了硫磺素T熒光法、濁度法、SDS-PAGE法和AFM法在研究Aβ 42聚集及活性化合物影響Aβ 42聚集中的互補(bǔ)性，認(rèn)為綜合應(yīng)用4種方法有助于揭示活性化合物影響Aβ 42寡聚體沉淀形成的分子機(jī)理．

關(guān)鍵詞：微生物藥物學(xué)；阿爾茨海默癥；β-類淀粉蛋白；Aβ 42寡聚體；Aβ 42聚集；Aβ 42大分子聚集沉淀；真菌化合物

Promoting action of demethoxyviridin on Aβ 42 oligomers

to form insoluble macromolecule aggregates

Zou Yongdong1, 2, Liang Zeqiu1, 2, Dong Yao1, 3, Chen Guodong4,

Liu Guobao1, 2, and Zheng Yizhi1,2?

神經(jīng)退行性疾病阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease, AD)已成為全球發(fā)病率和死亡率增長最快的疾病之一，其發(fā)病機(jī)制有淀粉樣蛋白學(xué)說等[1-4]．根據(jù)該學(xué)說，大腦中淀粉樣β-類淀粉蛋白42 (amyloid-β 42, Aβ 42)聚集形成寡聚體、纖維狀中間體和纖維，可引起神經(jīng)突觸損傷和炎癥，進(jìn)而導(dǎo)致阿爾茨海默癥的發(fā)生[4-5]．Aβ 42聚集形成的可溶性寡聚體是引起細(xì)胞毒性的首要原因[6-8]．在體外，Aβ 42單體(monomer，M)可自發(fā)形成多種寡聚體，如二聚體(dimer，D)、三聚體(trimer)、四聚體(tetramer，T)及高分子量寡聚體(high molecular weight oligomers，H)[8-9]，其中，以三聚體和四聚體為主的小分子寡聚體的細(xì)胞毒性最大[10]．因此，以Aβ 42寡聚體為靶點，獲得可抑制Aβ 42寡聚體形成或減少Aβ 42寡聚體比例的天然活性物質(zhì)，將有助于阻止其引起神經(jīng)細(xì)胞毒性，對預(yù)防與干預(yù)阿爾茨海默癥具有重要意義[4,7]．

目前，已發(fā)現(xiàn)一些天然化合物影響Aβ 42寡聚體形成，如表沒食子兒茶素沒食子酸酯和阿魏酸可抑制Aβ 42寡聚體形成，而姜黃素和白藜蘆醇可清除Aβ 42寡聚體[7,11-13]．文獻(xiàn)[14]通過硫磺素T(thioflavine T，ThT)熒光法發(fā)現(xiàn)來源真菌Nodulisporium sp.的甾體類化合物demethoxyviridin在0～5 h期間可明顯降低Aβ 42聚集過程中的ThT熒光強(qiáng)度，而其結(jié)構(gòu)類似物inoterpene B未顯示出明顯的作用．本研究采用濁度法、聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)和原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)技術(shù)，研究了0～48 h期間化合物demethoxyviridin影響Aβ 42聚集的動態(tài)過程，發(fā)現(xiàn)該化合物可顯著促進(jìn)溶液中Aβ 42單體、二聚體和四聚體形成高分子量寡聚體及不溶性大分子聚集物，減少可溶性寡聚體的比例．此結(jié)果不僅有助于揭示demethoxyviridin影響Aβ 42寡聚體沉淀形成的分子機(jī)理，也顯示出該活性化合物在干預(yù)和預(yù)防AD應(yīng)用上的潛力．

1材料與方法

1.1實驗材料

Aβ 42多肽購自上海吉爾生化有限公司；二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)和六氟異丙醇(1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol，HFIP)購自美國Sigma公司．

1.2Aβ 42寡聚體的制備

用2 mL HFIP溶解1 mg Aβ 42多肽干粉，于4 ℃混勻12 h．超聲波處理20 min后，取200 μL用氮氣吹干，加入111 μL DMSO溶解，離心40 min，上清液即Aβ 42母液．取40 μL Aβ 42母液，加入磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline，PBS)(10 mmol/L Na2HPO3，pH=7.4)至200 μL，Aβ 42終濃度為40 μmol/L，于25 ℃靜置48 h，制備Aβ 42寡聚體溶液．檢測待測化合物時，在40 μL Aβ 42母液中先加入用DMSO溶解的待測化合物．

1.3ThT熒光法檢測Aβ 42的聚集

ThT熒光法檢測Aβ 42寡聚體溶液時，在40 μL的Aβ 42母液中先加入等摩爾的ThT溶液．采用多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo Varioskan Flash)對Aβ 42寡聚體溶液進(jìn)行連續(xù)檢測，設(shè)置激發(fā)光和發(fā)射光檢測波長分別為444和485 nm．

1.4濁度法分析Aβ 42形成沉淀

在Aβ 42寡聚體溶液制備后的0、1、5、24和48 h時分別取樣，采用紫外分光光度計(美國GE UltroSpec 2100 pro)測定每份樣品在340 nm處的光密度(optical density, OD)， 檢測Aβ 42溶液的濁度．

1.5SDS-PAGE電泳檢測Aβ 42寡聚體

在Aβ 42寡聚體溶液制備后的0、1、5、24和48 h時分別取20 μL，各加入上樣緩沖液，95 ℃加熱5 min后用于電泳．采用質(zhì)量濃度為50 mg/mL的濃縮膠和質(zhì)量濃度為150 mg/mL的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳．利用Lab-image軟件(美國BioRad)分析凝膠板上電泳條帶的灰度百分比．

1.6AFM觀察Aβ 42聚集顆粒

在Aβ 42寡聚體溶液制備后的0、5和48 h時分別取2 μL，各稀釋10倍后滴于云母片上，靜置5 min后純水沖洗3遍，再干燥12 h．采用AFM(美國Bruker Multimode 8)選輕敲模式進(jìn)行掃描觀察，探針型號為RTESP．采用美國AEP科技公司SPIP型掃描探針圖像處理軟件統(tǒng)計云母片上顆粒高度分別為0.5～3.0 nm、3.0～8.0 nm及大于8.0 nm的Aβ 42聚集體的面積．

以上實驗均重復(fù)3～5次．采用方差分析法對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析．

2結(jié)果與分析

2.1ThT熒光法顯示demethoxyviridin可明顯影響Aβ 42的聚集

ThT熒光法常用于從化合物庫或天然產(chǎn)物庫中篩選可抑制Aβ 42聚集活性的化合物[7, 15]．文獻(xiàn)[15-16]顯示，Aβ 42多肽在聚集成寡聚體和纖維過程中形成β-折疊，以此與外加ThT結(jié)合，在444 nm光激發(fā)下產(chǎn)生485 nm發(fā)射光，通過檢測485 nm熒光強(qiáng)度來反映Aβ 42的聚集程度[15-16]．

在前期工作中發(fā)現(xiàn)，真菌Nodulisporium sp.次生代謝產(chǎn)物demethoxyviridin在Aβ 42聚集0～5 h時，表現(xiàn)出明顯的降低Aβ 42溶液ThT熒光強(qiáng)度的活性，而inoterpene B則未顯示出明顯活性[14]．在此基礎(chǔ)上，本研究通過ThT熒光法檢測了0～48 h內(nèi)demethoxyviridin和inoterpene B化合物對Aβ 42聚集的影響．將新配制的Aβ 42溶液(空白對照)加入ThT后置于酶標(biāo)儀下，檢測結(jié)果顯示，0 h時含Aβ 42肽的溶液的ThT熒光強(qiáng)度為6.2，5 h時迅速上升到10.9；隨后緩慢增加，48 h時達(dá)到13.4，即在5～48 h期間ThT熒光強(qiáng)度緩慢上升進(jìn)入“平臺期”．在Aβ 42溶液中加入4 μmol/L demethoxyviridin后，0～5 h期間熒光強(qiáng)度從4.2增至7.3；5～48 h間熒光強(qiáng)度趨于平穩(wěn)．當(dāng)demethoxyviridin濃度提高到40 μmol/L后，0～5 h期間熒光強(qiáng)度從4.3快速降至1.3，之后熒光強(qiáng)度維持穩(wěn)定．在Aβ 42溶液中加入40 μmol/L inoterpene B后，0～5 h時，Aβ 42溶液的熒光強(qiáng)度由5.2速升至9.9，之后保持穩(wěn)定，如圖1．由圖1可見，demethoxyviridin明顯地影響Aβ 42的聚集，且其影響作用主要發(fā)生在Aβ 42聚集的0～5 h內(nèi)．

圖1　化合物demethoxyviridin和inoterpene B對Aβ 42溶液ThT熒光強(qiáng)度的影響Fig.1　Influence of demethoxyviridin and inoterpene B on ThT fluorescence of Aβ 42 solutions

2.2濁度法顯示demethoxyviridin可促進(jìn)Aβ 42肽快速形成不溶性沉淀

Aβ 42肽在溶液中可聚集形成不溶性沉淀[17]，而溶液中的不溶性或懸浮體沉淀物質(zhì)可通過濁度法進(jìn)行檢測[18]．本研究通過濁度法檢測了Aβ 42肽形成不溶性沉淀的動態(tài)過程．結(jié)果顯示，含Aβ 42溶液(空白對照)在340 nm處0 h的光密度值為0.021，5 h時為0.023，48 h時為0.102，表明在0～48 h內(nèi)Aβ 42沉淀物持續(xù)緩增．在Aβ 42溶液中加入40 μmol/L demethoxyviridin后，0～5 h的光密度值從0.018急增至0.258，之后繼續(xù)上升，48 h時達(dá)到0.319，在聚集后期(5～48 h)沉淀物形成速度明顯減慢，如圖2．而在Aβ 42溶液中加入40 μmol/L inoterpene B后，0～5 h內(nèi)溶液的光密度值僅由0.019升至0.026，在48 h達(dá)到0.134．上述結(jié)果表明，demethoxyviridin可在Aβ 42溶液聚集初期(0～5 h)促進(jìn)Aβ 42肽快速形成不溶性沉淀．

圖2　化合物demethoxyviridin和inoterpene B對Aβ 42溶液D(340)值的影響Fig.2　Influence of demethoxyviridin and inoterpene B on the oplical density at 340 nm of Aβ 42 solutions

2.3SDS-PAGE法顯示demethoxyviridin可加快Aβ 42寡聚體聚集成大分子聚集物

Aβ 42肽具有高度自發(fā)聚集的特性．在體外實驗中因制備條件(如緩沖液、pH值及溫度)的差異，其聚集狀態(tài)(如寡聚體和纖維)也表現(xiàn)不同[8,19-20]．本研究采用PBS溶液(10 mmol/L Na2HPO3，pH=7.4)配制Aβ 42溶液(空白對照)，經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示，0 h時Aβ 42溶液中即出現(xiàn)單體、二聚體、四聚體和位于濃縮膠與分離膠交界處的高分子量寡聚體(1 Da=1 u)，如圖3(a)．這一現(xiàn)象與文獻(xiàn)[20-21]報道相似．實驗結(jié)果還顯示，在Aβ 42聚集后的0～48 h內(nèi)溶液中的單體、二聚體和高分子量寡聚體條帶未明顯改變，四聚體條帶濃度持續(xù)減弱；灰度掃描結(jié)果顯示，四聚體條帶灰度百分比從0 h的43.8%下降到5 h的33.3%及48 h的25.8%，如圖3(d)；值得注意的是，位于濃縮膠加樣孔處的大分子聚集物(aggregate，A)逐漸加深，其灰度百分比由0 h的4.9%漸升至5 h的8.9%，48 h達(dá)16.6%，如圖3(f)．

將40 μmol/L的demethoxyviridin加入Aβ 42溶液中，0 h時Aβ 42的單體、二聚體、四聚體和高分子量寡聚體條帶的灰度百分比與Aβ 42(空白對照)十分相似．在以后的48 h內(nèi)，Aβ 42單體和二聚體條帶的灰度百分比分別從0 h的21.6%和9.7%先升至5 h的22.2%和10.6%，然后降至48 h的18.3%和6.5%，如圖3(b)和(c)；四聚體條帶的灰度百分比由0 h的47.4%快速降至5 h的16.4%及48 h的3.2%，如圖3(d)；高分子量寡聚體條帶的灰度百分比由0 h的14.0%持續(xù)下降至5 h的8.5%及48 h的2.5%，如圖3(e)；與此相反，大分子聚集物條帶的灰度百分比在0 h為7.4%、5 h為22.3%，48 h上升至26.8%，如圖3(f)．根據(jù)上述結(jié)果可認(rèn)為，在0～5 h期間，demethoxyviridin可明顯促進(jìn)Aβ 42單體、二聚體、四聚體和高分子量寡聚體形成大分子聚集物；在后續(xù)的5～48 h期間，幾種寡聚體形成大分子聚集物的速度逐漸減慢．

若將40 μmol/L inoterpene B加入Aβ 42溶液后的0～48 h，單體、幾種寡聚體和大分子聚集物條帶的灰度百分比與Aβ 42(空白對照)相似，如圖3．

2.4AFM技術(shù)顯示demethoxyviridin可促進(jìn)Aβ 42形成大分子聚集物顆粒

AFM技術(shù)的優(yōu)點是可直觀顯示Aβ 42多肽形成的各種聚集顆粒大小及形態(tài)，并通過相應(yīng)的軟件統(tǒng)計顆粒的高度和面積百分比[5,8,19]．如Mastrangelo等[8]采用AFM法定義高度達(dá)1.0～3.0 nm的Aβ 42顆粒主要由單體、二聚體和四聚體組成，高度達(dá)2.0～8.0 nm的顆粒為高分子量寡聚體．本研究利用AFM觀察到Aβ 42聚集形成的小顆粒(高度0.5～3.0 nm)和中等顆粒(高度3.0～8.0 nm)，這與Mastrangelo定義的兩種顆粒相對應(yīng)；此外，在顯微鏡視野中還可見一些大顆粒(高度>8.0 nm)，如圖4(a)．筆者認(rèn)為大顆?？膳cSDS電泳中的大分子聚集物沉淀相對應(yīng).本研究還采用SPIP軟件比較了上述3種顆粒在Aβ 42溶液加入demethoxyviridin和inoterpene B后的面積百分比．

圖3　化合物demethoxyviridin和inoterpene B對Aβ 42溶液中單體、二聚體、四聚體、高分子量寡聚體和大分子聚集物比例的影響Fig.3　Influence of demethoxyviridin and inoterpene B on the proportions of Aβ 42 monomers, dimmers, tetramers, high molecular weight oligomers and macromolecular aggregates

圖4　化合物demethoxyviridin和inoterpene B對Aβ 42溶液中不同高度Aβ 42顆粒比例的影響Fig.4　Influence of demethoxyviridin and inoterpene B on the proportions of Aβ 42 particles with different heights

通過AFM技術(shù)可見，在0 h時Aβ 42溶液(空白對照)中存在大量小顆粒、少量中等顆粒和極少量的大顆粒；3種顆粒的面積百分比分別為88.2%、13.3%和3.5%，如圖4(b)．聚集后的5和48 h，小顆粒數(shù)量減少，其面積百分比急劇下降至32.7%和14.9%；中等顆粒的面積百分比均呈現(xiàn)先增后降的趨勢，從0 h的13.3%先增加到5 h的46.2%，后又減少到48 h的41.0%；而大顆粒不僅數(shù)目增加，面積百分比在48 h時增至44.1%，如圖4(b)．上述結(jié)果表明，Aβ 42肽在聚集過程中先聚集形成小顆粒，再逐漸聚集成中等顆粒及大顆粒，中等顆?？烧J(rèn)為是聚集過程中的過渡類型．將40 μmol/L demethoxyviridin加入Aβ 42溶液，在0 h時，3種顆粒的面積百分率與單獨Aβ 42溶液(空白對照)相比無顯著區(qū)別；5 h時小顆粒數(shù)量明顯減少，中等顆粒數(shù)目增加，同時中等顆粒面積也顯著增加；隨著聚集時間延長，在48 h時小顆粒與中等顆粒均顯著減少，而以大顆粒居多；同時，小顆粒面積百分比從0 h的73.9%持續(xù)減至48 h的19.2%，中等顆粒面積百分比從0 h的21.9%先增至5 h的44.7%再降至48 h的7.9%，而大顆粒面積百分比從0 h的4.0%持續(xù)增加到48 h的72.9%，如圖4(b)．若在Aβ 42溶液加入40 μmol/L inoterpene B，Aβ 42聚集過程中3種顆粒面積百分比與Aβ 42(空白對照)相比未見明顯區(qū)別．

可見，demethoxyviridin可加速Aβ 42溶液中的小顆粒形成中等顆粒及大顆粒，這一結(jié)果與前述濁度法和SDS-PAGE電泳結(jié)果相對應(yīng)．

3討論

阿爾茨海默癥的發(fā)病機(jī)制與Aβ 42聚集形成的寡聚體和纖維密切相關(guān)[4-5]，其中，Aβ 42寡聚體是引起神經(jīng)細(xì)胞毒性的主要原因之一[6]．因此，獲得可抑制Aβ 42寡聚體形成或減少Aβ 42寡聚體活性的天然產(chǎn)物具有重要意義．文獻(xiàn)[7]表明，一些天然化合物可抑制Aβ 42寡聚體形成或清除Aβ 42寡聚體．如表沒食子兒茶素沒食子酸酯可抑制較高毒性Aβ 42寡聚體的形成，產(chǎn)生低毒性的大分子聚集物；阿魏酸可抑制Aβ 42形成β-折疊，阻止Aβ 42單體向寡聚體的轉(zhuǎn)變，并減少Aβ 42引起的SH-SY5Y細(xì)胞毒性[12]；姜黃素可結(jié)合于Aβ 42多肽的N端，通過促進(jìn)Aβ 42纖維形成，減少Aβ 42原纖維和寡聚體的形成，降低Aβ 42導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞毒性作用[11]．白藜蘆醇是葡萄果皮產(chǎn)生的多酚類化合物，可將Aβ可溶性寡聚體、纖維狀中間體和成熟的纖維轉(zhuǎn)變?yōu)榈投镜臒o定形大分子聚集物，降低Aβ聚集物的細(xì)胞毒性[13]．本實驗室從一種紅樹植物——水黃皮中分離出內(nèi)生真菌Phomopsisocculta， 發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵提取物的ME0-W-F1肽組分可在體外抑制Aβ 42聚集，降低Aβ 42引起的SH-SY5Y細(xì)胞毒性[3]．前期還從真菌Nodulisporium sp.天然產(chǎn)物庫中篩選出具有明顯降低Aβ 42溶液ThT熒光強(qiáng)度的活性化合物demethoxyviridin[14]．實驗結(jié)果表明，該化合物可明顯促進(jìn)Aβ 42小分子寡聚體形成高分子量寡聚體，形成不溶性大分子聚集物沉淀，具有顯著清除可溶性小分子Aβ 42寡聚體的活性．

在Aβ 42聚集的體外研究中，通常采用ThT熒光法篩選出可影響Aβ 42聚集的活性化合物．由于Aβ 42聚集速度相當(dāng)快，研究者難以檢測到Aβ 42聚集為寡聚體、大分子聚集物及Aβ 42纖維的過程，也無法揭示活性化合物對有細(xì)胞毒性的Aβ 42寡聚體形成的影響．研究者通常采用以下一種或兩種方法，如圓二色譜法、SDS-PAGE、抗體雜交、透射電鏡和AFM等輔助ThT熒光法研究活性化合物的作用機(jī)理[3,7,11-13]，但相關(guān)報告并不多見．本研究綜合分析了ThT熒光法、濁度法、SDS-PAGE和AFM法的研究結(jié)果，認(rèn)為ThT熒光法是最常用的研究Aβ 42聚集的方法之一，其制備Aβ 42相對簡單，在樣品制備后的0～5 h內(nèi)即可檢出Aβ 42聚集的動態(tài)變化[14]，便捷、靈敏是ThT熒光法檢測Aβ 42聚集動態(tài)過程的優(yōu)勢；濁度法可快速反映溶液中Aβ 42聚集過程形成沉淀懸浮物的變化；SDS-PAGE電泳法可區(qū)分Aβ 42的單體、二聚體、四聚體和高分子寡聚體及大分子聚集物，并反映其比例[3,20-21]；AFM法可直觀地觀察到Aβ 42聚集的幾種不同高度的顆粒[5,8,19]．與ThT法相比，后3種方法最大的優(yōu)勢是能夠檢測出Aβ 42寡聚體的動態(tài)變化，并揭示活性化合物影響Aβ 42寡聚體及沉淀形成的分子機(jī)理．

本研究采用濁度法、SDS-PAGE電泳和AFM法發(fā)現(xiàn)，Aβ 42溶液可緩慢形成不溶性大分子聚集物沉淀，demethoxyviridin的加入則顯著加速形成不溶性沉淀．因此，推測Aβ 42溶液0～5 h內(nèi)ThT熒光強(qiáng)度快速升高可能與聚集早期形成的大量寡聚體有關(guān)；5～48 h期間隨著較多Aβ沉淀(蛋白電泳條帶灰度百分比達(dá)到16.6%)的形成，ThT熒光強(qiáng)度緩慢上升，該現(xiàn)象可能是已發(fā)生聚集形成沉淀的Aβ 42與ThT的結(jié)合力及發(fā)光強(qiáng)度很大程度被減弱所致[15-16]．而在demethoxyviridin加入Aβ 42溶液后0～5 h內(nèi)ThT熒光強(qiáng)度急劇下降，其原因是該化合物加快了Aβ 42沉淀的形成．

通過濁度法、SDS-PAGE法和AFM法研究還發(fā)現(xiàn)，在0～48 h期間活性化合物demethoxyviridin可快速減少Aβ 42各種寡聚體的相對比例，顯著促進(jìn)Aβ 42小顆粒聚集形成大顆粒，促進(jìn)其沉淀的快速形成．即使在demethoxyviridin加入Aβ 42溶液后5～48 h內(nèi)，ThT熒光強(qiáng)度處于較低的“穩(wěn)定期”，Aβ 42各種寡聚體向大分子聚集沉淀的快速轉(zhuǎn)變?nèi)源嬖冢@反映了demethoxyviridin影響Aβ 42聚集的作用方式，也預(yù)示著它具有降低Aβ 42低聚物比例和減少細(xì)胞毒性的可能性．由此可見，在利用ThT法篩選到具有降低Aβ 42溶液ThT熒光強(qiáng)度的候選活性化合物后，應(yīng)增加SDS-PAGE法和AFM法進(jìn)行研究，這不僅有助于從理論上揭示活性化合物影響Aβ 42寡聚體沉淀形成的分子機(jī)理，也可為今后利用相關(guān)的細(xì)胞及動物模型研究活性化合物是否可降低Aβ 42寡聚體的細(xì)胞毒性提供重要依據(jù)．

Aβ 42具有高度自聚集傾向的特性，受緩沖液離子強(qiáng)度、pH值和溫育的溫度的影響，所形成的寡聚體、大分子聚集物或纖維比例有很大不同[22]．同時，Aβ 42形成寡聚體和纖維的過程有多種途徑[23]．本研究將Aβ 42加入到25 ℃的PBS溶液(pH=7.4)中，在AFM下只觀察到了大小不等的顆粒，未見到Aβ 42纖維形成．這表明在此制備條件下，單獨的Aβ 42主要形成的是寡聚體而不是纖維．可見，這是一套適合于檢測活性化合物對Aβ 42寡聚體影響的實驗體系．

結(jié)語

阻止或減少可溶性Aβ 42寡聚體(尤其是小分子寡聚體)的形成對于干預(yù)和預(yù)防阿爾茨海默癥具有重要意義．本研究比較了ThT熒法法、濁度法、SDS-PAGE法和AFM法4種方法在研究Aβ 42形成寡聚體及活性化合物影響Aβ 42寡聚體形成的互補(bǔ)性，證明了demethoxyviridin具有顯著的清除可溶性小分子Aβ 42寡聚體的活性，這不僅有助于從理論上揭示活性化合物影響Aβ 42聚集物形成的分子機(jī)理，也可為今后利用細(xì)胞及動物模型研究活性化合物是否可降低Aβ 42聚集物的細(xì)胞毒性提供重要參考．

引文：鄒永東，梁澤秋，董瑤，等. 促進(jìn)Aβ 42形成不溶性聚集物的一種真菌化合物[J]. 深圳大學(xué)學(xué)報理工版，2016，33(1)：25-32.

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【中文責(zé)編：晨兮；英文責(zé)編：艾琳】

1) College of Life and Marine Science, Shenzhen University, Shenzhen 518060, Guangdong Province, P.R.China

2) Shenzhen Key Laboratory of Microbial Genetic Engineering, Shenzhen 518060, Guangdong Province, P.R.China

3) Shenzhen Key Laboratory of Marine Bioresources and Ecology, Shenzhen 518060, Guangdong Province, P.R.China

4) College of Pharmacy, Institute of Traditional Chinese Medicine and Natural Products, Jinan University,

Guangzhou 510632, Guangdong Province, P.R.China

Abstract：Amyloid beta (Aβ) is crucially involved in Alzheimer’s disease, and soluble Aβ 42 oligomers are the main neurotoxic species. In this paper, the experimental methods, including standard thioflavin T (ThT) fluorescence assay, turbimetric method, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis (SDS-PAGE) and atomic force microscopy (AFM), are applied to investigate the relationship among the thioflavin T fluorescence, the turbidity, the proportion and the surface shape of Aβ 42 oligomers and aggregates during the Aβ 42 aggregation procedure. The results show that the fungal compound demethoxyviridin could clearly promote soluble small molecular Aβ 42 oligomers to form insoluble macromolecular aggregate precipitates via high molecular weight oligomers. In addition, the complementarities of the ThT fluorescence assay, turbimetric method, SDS-PAGE and AFM on Aβ 42 aggregation procedure are discussed. The comprehensive application of these methods is helpful to reveal the molecular mechanism of the effect of the active compounds on the formation of Aβ 42 oligomers and their precipitation.

Key words：microbial pharmacology; Alzheimer disease; amyloid-β (Aβ); Aβ 42 oligomer; Aβ 42 aggregation; Aβ 42 macromolecular aggregate precipitate; fungal compound

作者簡介：鄒永東(1968—)，男，深圳大學(xué)高級實驗師.研究方向：植物生物技術(shù)及天然產(chǎn)物應(yīng)用. E-mail：zouyd@szu.edu.cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(81202441)

中圖分類號：R 93

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.3724/SP.J.1249.2016.01025