中藥提取物誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞程序性死亡研究進(jìn)展

江蘇閩，詹紅生，陳東煜，張繼偉上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院石氏傷科醫(yī)學(xué)中心，上海市中醫(yī)藥研究院骨傷科研究所，上海 201203

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中藥提取物誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞程序性死亡研究進(jìn)展

江蘇閩，詹紅生，陳東煜，張繼偉
上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院石氏傷科醫(yī)學(xué)中心，上海市中醫(yī)藥研究院骨傷科研究所，上海 201203

摘要：細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）是經(jīng)特定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控的細(xì)胞死亡，PCD的失序紊亂會(huì)引起腫瘤等疾病，這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑依賴或不依賴半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶。中藥在治療骨肉瘤方面有一定療效，其有效成分及干預(yù)機(jī)制的研究日益增多。本文對(duì)近年來(lái)中藥提取物誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞程序性死亡的研究做一綜述。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞程序性死亡；細(xì)胞凋亡；骨肉瘤；中藥；綜述

細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）是由特定基因控制、經(jīng)特有的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控、穩(wěn)步發(fā)生的細(xì)胞主動(dòng)性死亡，是機(jī)體維持細(xì)胞數(shù)量平衡的重要機(jī)制，PCD的失序紊亂會(huì)引發(fā)腫瘤在內(nèi)的一系列疾病。PCD根據(jù)是否有半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）家族的參與，分為caspase依賴的細(xì)胞程序性死亡（CD-PCD）和非caspase依賴的細(xì)胞程序性死亡（CI-PCD）。骨肉瘤是原發(fā)于骨骼的惡性腫瘤，常發(fā)生于兒童和青少年，惡性程度高、易轉(zhuǎn)移。中醫(yī)藥在治療腫瘤方面具有一定療效，因此，天然藥物提取物也成為研究抗腫瘤的新方向。茲就中藥提取物誘導(dǎo)骨肉瘤PCD研究進(jìn)展作一綜述。

1　caspase依賴的細(xì)胞程序性死亡

CD-PCD，即經(jīng)典的“細(xì)胞凋亡”，形態(tài)上表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、核染色質(zhì)固縮、胞核裂解、胞膜空泡化、凋亡小體形成。caspase家族是在CD-PCD信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用的酶蛋白，按功能不同，可分為啟動(dòng)因子（caspase8、9、10、12等）和效應(yīng)因子（caspase3、6、7等）。效應(yīng)因子可降解細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；啟動(dòng)因子則位于上游，激活效應(yīng)因子功能。整個(gè)CD-PCD過(guò)程根據(jù)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制不同可分為3種，即線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）途徑，分別依賴不同的caspase蛋白完成凋亡過(guò)程。

1.1線粒體途徑

線粒體是真核細(xì)胞提供能量和產(chǎn)生活性氧（ROS）的主要場(chǎng)所。胞內(nèi)外的刺激均可以啟動(dòng)線粒體途徑，具體表現(xiàn)和指征為胞內(nèi)ROS增加、線粒體膜電位（ΔΨm）耗竭、胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞色素c增多等。經(jīng)線粒體途徑引發(fā)的凋亡主要經(jīng)歷線粒體膜通透性（MMP）增強(qiáng)、線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔道（MPTP）開(kāi)放、細(xì)胞色素c釋放入胞質(zhì)與Apaf-1、caspase9前體形成凋亡復(fù)合體，激活caspase9和caspase3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的過(guò)程。在此過(guò)程中，Bcl-2蛋白家族的作用顯著，主要調(diào)控線粒體外膜的完整性和MPTP的開(kāi)放，根據(jù)功能不同，Bcl-2家族分為促凋亡蛋白（Bax、Bak、Bcl-XS、Bid、Bad及HRK等）和抑凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-W、Bfl-1、Bcl-B及Mcl-1等）。促凋亡蛋白收到凋亡信號(hào)刺激后活化，部分原本定位于胞質(zhì)的蛋白（如Bax）移位至線粒體外膜，部分原本定位于線粒體外膜的蛋白（如Bak）發(fā)生構(gòu)象變化，最終在線粒體外膜形成孔道，細(xì)胞色素c釋放，促成凋亡；相反地，抑凋亡蛋白則抑制該過(guò)程。

據(jù)目前的研究成果，線粒體途徑是中藥提取物誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制。淫羊藿素致細(xì)胞內(nèi)ROS濃度增高[1]，ROS增多啟動(dòng)線粒體途徑，活化caspase9、caspase3，誘發(fā)凋亡，caspase3抑制劑可以阻斷此過(guò)程[2]。氧化苦參堿[3]、人參皂苷[4]、毛竹葉水提物[5]、小檗胺及其衍生物[6]能上調(diào)Bax、Bad表達(dá)，下調(diào)Bcl-2表達(dá)，線粒體釋放細(xì)胞色素c入細(xì)胞質(zhì)，隨后激活caspase9、caspase3，裂解底物聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（PARP），誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡；氧化苦參堿和小檗胺[7]還能體內(nèi)抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。

姜黃素[8]、雷公藤甲素[9]、芹黃素[10]、山柰酚[11]及白英醇提物[12]誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制是多途徑的。在線粒體途徑中，它們能上調(diào)促凋亡蛋白Bid、Bax，下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL，降低ΔΨm，并釋放細(xì)胞色素c，最終激活caspase9、caspase3；Survivin是凋亡抑制蛋白（IAPs）家族成員，是caspase3、caspase7等酶的抑制物，姜黃素[13]和奇果菌素[14]還能抑制其表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

1.2死亡受體途徑

細(xì)胞膜分布著一些與細(xì)胞凋亡相關(guān)的死亡受體，如Fas/CD95、腫瘤壞死因子受體1（TNF-R1）、TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體1/2（TRAIL-R1/2）等[15]，胞外刺激信號(hào)增強(qiáng)所致的配體受體反應(yīng)可以激活caspase8，從而直接激活下游的效應(yīng)因子caspase3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；另外，caspase8還可激活胞質(zhì)中促凋亡蛋白Bid轉(zhuǎn)移至線粒體膜，打開(kāi)外膜通道，細(xì)胞色素c釋放至胞質(zhì)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

芹黃素可上調(diào)抑癌基因p53表達(dá)，激活caspase8，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并于體內(nèi)抑制移植瘤生長(zhǎng)[10]；雷公藤甲素上調(diào)死亡受體Fas及其配體FasL表達(dá)[9]，白英醇提物能激活Fas和TRAIL-R，它們均能活化caspase8、caspase3，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。

1.3內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑

ER是蛋白質(zhì)合成、折疊，以及鈣離子（Ca2+）儲(chǔ)存的重要場(chǎng)所。ER受胞內(nèi)外信號(hào)刺激后，啟動(dòng)非折疊蛋白應(yīng)答（UPR），并釋放Ca2+入胞質(zhì)，ER鈣穩(wěn)態(tài)的破壞和非折疊蛋白堆積導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）。caspase12定位于ER，ERS后caspase12經(jīng)多種機(jī)制被活化，活化的caspase12又剪切活化caspase9、caspase3，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡。

在芹黃素作用下，骨肉瘤細(xì)胞U2OS中ROS和Ca2+濃度增高，誘發(fā)ERS，ER上的跨膜蛋白活化轉(zhuǎn)錄因子4（ATF）傳遞ERS信號(hào)，靶基因葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP）表達(dá)上調(diào)，caspase12、caspase3活化，促使細(xì)胞凋亡[10]；另外，芹黃素誘發(fā)的ERS使生長(zhǎng)阻滯和DNA損傷誘導(dǎo)基因（GADD153）轉(zhuǎn)錄上調(diào)，GADD153是ER凋亡途徑的重要因子，可以通過(guò)下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]。

山柰酚能在體內(nèi)外抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，并對(duì)正常成骨表現(xiàn)出低毒性，它誘導(dǎo)凋亡機(jī)制涉及線粒體和ER途徑。山柰酚引起胞內(nèi)Ca2+濃度升高，這種鈣穩(wěn)態(tài)的失衡除了誘發(fā)ERS，活化ATF6、GRP78、GRP94外，還活化了胞質(zhì)中的半胱氨酸蛋白酶家族成員Calpain，激活caspase4功能，誘發(fā)凋亡[11]。

2　非caspase依賴的細(xì)胞程序性死亡

CI-PCD表現(xiàn)為無(wú)caspase蛋白激活且caspase蛋白抑制劑無(wú)法阻斷凋亡過(guò)程，其形式有自體吞噬、凋亡樣程序性死亡、壞死樣程序性死亡、類凋亡、有絲分裂災(zāi)變、失巢凋亡等。目前針對(duì)CI-PCD研究中藥提取物抗骨肉瘤的成果不多，相對(duì)明確的機(jī)制主要集中于以下兩方面。

2.1線粒體相關(guān)的非caspase依賴的細(xì)胞程序性死亡

凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）和核酸內(nèi)切酶（Endo G）正常情況下都存在于線粒體中，在胞內(nèi)外刺激存在的情況下（如Bcl-2家族促凋亡蛋白表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)ROS增多、Ca2+濃度增高），它們從線粒體移位至胞質(zhì)、再轉(zhuǎn)移至胞中，導(dǎo)致核固縮、DNA裂解。此過(guò)程并不受caspase活性影響，不能被caspase抑制劑所阻斷。

同是依賴線粒體途徑，caspase非依賴和caspase依賴機(jī)制往往是同時(shí)發(fā)生的，中藥提取物的作用機(jī)制也往往是雙方面的。上文提到的白英醇提物[12]、芹黃素[10]、山柰酚[11]均能通過(guò)caspase非依賴途徑，促進(jìn)AIF和Endo G釋放入核，直接剪切DNA，促成PCD。水鬼蕉提取物Pancratistatin的合成類似物對(duì)骨肉瘤細(xì)胞發(fā)揮選擇性細(xì)胞毒性作用，對(duì)正常成骨肉瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞無(wú)影響，它能提高細(xì)胞內(nèi)ROS濃度，誘導(dǎo)線粒體釋放AIF和Endo G，促進(jìn)PCD，它與姜黃素同用有協(xié)同作用，但姜黃素單用無(wú)作用[17]。

2.2自體吞噬

自噬是胞內(nèi)出現(xiàn)雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞器、蛋白質(zhì)形成自噬體，并與溶酶體融合成自噬溶酶體，通過(guò)水解酶解降解其內(nèi)容物的過(guò)程[18]。自噬相關(guān)基因（ATG）是參與自噬調(diào)控的一類蛋白家族，它們可以形成不同的復(fù)合體參與調(diào)控自噬體形成，通過(guò)基因敲除相關(guān)ATGs基因，細(xì)胞死亡減少。另外，ATG的同源基因也對(duì)自噬形成發(fā)揮重要作用，如基因敲除ATG6的同源基因Beclin-1后，細(xì)胞自噬水平降低，腫瘤發(fā)生率增高[19]；LC3是ATG8的同源基因，Ⅰ型LC3（胞質(zhì)中游離形式）向Ⅱ型LC3（自噬體膜結(jié)合形式）轉(zhuǎn)變是誘導(dǎo)細(xì)胞自噬體形成的關(guān)鍵步驟[20]。

老刺木胺生物堿可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，促進(jìn)Ⅰ型LC3向Ⅱ型LC3轉(zhuǎn)變，機(jī)制涉及的主要蛋白是ATG5；以蘆薈大黃素作為光敏劑的光動(dòng)力療法能上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞自噬，電鏡下可見(jiàn)典型自噬溶酶體，LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1表達(dá)增高[21]。

3　結(jié)語(yǔ)

從發(fā)生機(jī)制而言，CD-PCD和CI-PCD并不能截然分開(kāi)，在PCD過(guò)程中，這2種機(jī)制往往同時(shí)發(fā)生、相互聯(lián)系。而中藥提取物的作用也往往是多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多途徑。中藥提取物在誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞PCD方面具有一定的作用，但目前的研究還需深入。如何發(fā)現(xiàn)更多有效的提取物，更清楚地闡述中藥抑制骨肉瘤的機(jī)制，并將其應(yīng)用到臨床中，是急需解決的問(wèn)題。

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（修回日期：2015-07-29；編輯：梅智勝）

Research Progress in Chinese Herbal Medicine Inducing Programmed Cell Death ofOsteosarcoma

JIANG Su-min, ZHAN Hong-sheng, CHEN Dong-yu, ZHANG Ji-wei (Shi’s Center of Orthopaedics and Traumatology, Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM; Institute of Orthopaedics and Traumatology, Shanghai Academy of TCM, Shanghai 201203, China)

Abstract:programmed cell death (PCD) is cell death regulated by the specific signaling pathways. The disorder of PCD may cause diseases, such as tumor. These signal transduction pathways rely or do not rely on caspase. Traditional Chinese medicine has some efficacy for the treatment of osteosarcoma, and the number of study on its active ingredients and intervention mechanism is increasing. This article reviewed study on traditional Chinese herbal medicine which can inhibit osteosarcoma through the induction of PCD.

Key words:programmed cell death; cell apoptosis; osteosarcoma; traditional Chinese medicine; review

收稿日期：（2015-02-19）

通訊作者：陳東煜，E-mail：jiangsumin028@sina.com

基金項(xiàng)目：上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科研計(jì)劃（13401903400）

中圖分類號(hào)：R273.8

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1005-5304(2016)02-0127-03

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.038